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INGENIERA QUMICA
TESIS
PRESENTA
DIRECTOR
Otra de las partes muy importantes de mi vida son mis padres (Estela
y Enrique) y hermanos (Cecilia y Luis), a los cuales les agradezco
infinitamente el apoyo y confianza que me han brindado a lo largo de
mi vida. Gracias por darme el impulso que necesit cada da, por
ayudarme a levantarme cada vez que caa. En fin, por estar en los
momentos buenos y no tan buenos. Aunque se me dificulta abrir mi
corazn y sentimientos, sepan que los quiero mucho. A ustedes ms
que a nadie les debo este triunfo y ste tambin es suyo!
Pgina
ndice de Figuras v
ndice de Tablas vi
1. INTRODUCCIN 1
2. MARCO TERICO 3
2.2 Descripcin 3
2.7 Usos 9
2.8 Antioxidantes 9
i
Pgina
2.10.5 Pectina 17
2.10.9 pH 19
2.10.12 Vitamina C 20
4. HIPTESIS Y OBJETIVOS 22
4.1 Hiptesis 22
5. METODOLOGA 23
ii
Pgina
5.3.5 Pectina 27
5.3.9 pH 30
5.3.11 Vitamina C 31
6. RESULTADOS Y DISCUSIN 37
iii
Pgina
7. CONCLUSIONES 45
8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 46
9. ANEXO 51
iv
NDICE DE FIGURAS
Figura Pgina
v
NDICE DE TABLAS
Tabla Pgina
vi
1. INTRODUCCIN
Las frutas son alimentos llamativos por su diversidad de colores y formas, adems de lo que
muestran a simple vista, forman parte de los alimentos con mayor cantidad de nutrientes y
sustancias naturales altamente beneficiosas para la salud. Las frutas y todos los vegetales,
sobreviven a la intemperie, enfrentando todo tipo de condiciones y agresiones meteorolgicas.
Todo ello es posible gracias a las sustancias protectoras y antioxidantes naturales que poseen,
esas sustancias son las que ofrecen proteccin cuando se consume el alimento [9].
Las frutas tropicales, tambin llamadas exticas, han comenzado recientemente a presentarse con
mayor diversidad en los mercados occidentales, siendo muchas de ellas hasta ahora desconocidas
para gran parte de la poblacin. An existe mucho desconocimiento en cuanto a la manera de
consumir muchas de estas frutas tropicales lo cual puede llevar a su rechazo (Novillo, 2009).
Las ventajas de estas frutas son los mayores rendimientos por hectrea que las tradicionales, al
producirse bajo tcnicas orgnicas y naturales, guardan un equilibrio de conservacin ambiental
que propicia nuevas prcticas agronmicas y comerciales para el productor. Ello les da un valor
agregado ideal para dirigirlos a mercados con alto poder adquisitivo, lo que reporta mejores
ingresos [10].
La carambola (Averrhoa carambola L.), es un fruto considerado como extico por su distintiva
forma de estrella en la seccin transversal, su particular sabor y su color. Estas caractersticas le
han proporcionado un mercado potencial considerable para combinarse en ensaladas y bebidas,
adems de su consumo como fruto fresco y procesado.
La ubicacin geogrfica y la diversidad de climas con las que cuenta Mxico le permite ser el
pas con mayor variedad de productos frescos en el cual va inmerso el cultivo de frutales [2]. La
produccin de nuevos cultivos llamados no tradicionales como el de carambola, es alternativo,
adaptado a las condiciones de clima y suelo de la regin y con buenas perspectivas de
comercializacin, produccin, y rentabilidad; con el objetivo de diversificar la produccin y el
ingreso, ya que la rentabilidad que se tiene actualmente con los cultivos tradicionales de mayor
1
importancia (ctricos y caf) ha disminuido debido entre otros factores, a los bajos precios de
comercializacin (Cruz, 2006).
Con el presente trabajo, se busca analizar y dar a conocer las caractersticas fsicas y qumicas de
la carambola (Averrhoa carambola L), adems de las propiedades antioxidantes de la misma,
cultivada en la comunidad de Los Mangos, Yanga, Veracruz.
2
2. MARCO TERICO
La carambola (Averrhoa carambola L.) es una fruta tropical de origen incierto pero se cree que
proviene del suroeste de Asia, especficamente, Malasia e Indonesia. En Amrica fue introducido
a fines del siglo XVIII; actualmente se encuentra este cultivo en un gran nmero de pases tales
como: Australia, Francia, Tailandia, Indochina, China, Malasia, Brasil, Repblica Dominicana,
Venezuela, Colombia, Costa Rica, Estados Unidos, Mxico, Hait, Colombia, Ecuador, y
Argentina [3]. En Mxico, el cultivo comercial de esta especie existe desde hace ms de 10 aos,
en Morelos, Colima, Veracruz, Chiapas, Tabasco y Sinaloa (Salinas et al, 2003).
2.2 Descripcin
a b
3
Sus hojas son alternas y compuestas, con nmero impar de foliolos; ovalados o ligeramente
elipsoides, de 2 a 9 cm de largo y de 1 a 5 cm de ancho, el tamao aumenta de la base al pice de
la hoja de un verde claro (Figura 2). Estas son sensibles a la luz y se pliegan por la noche o
cuando el rbol se agita (Prez, 2005).
Las flores son pequeas con panculas cortas (Figura 3), hermafroditas y de color que van desde
el rosado oscuro hasta el rojo y se agrupan en inflorescencias racimosas, opuestas a las hojas en
las ramillas o en ramas viejas y defoliadas. Tienen 5 spalos rojos, de 3 a 4 mm de largo y 5
ptalos oblongos, blancos o amarillentos, con manchas rojas en los bordes; llevan 10 estambres, 5
frtiles y 5 convertidos en estaminodios. Hay dos tipos de flor segn la longitud del pistilo, el
cual est constituido por un ovario piloso y 5 estilos que miden cerca de 2 mm en las flores de
estilos largos y menos de 1 mm en las de estilos cortos. Los insectos son necesarios en la
produccin de fruta y son agentes polinizadores dado que el carambolo es una especie de
polinizacin cruzada (Prez, 2005).
4
Figura 3. Flores de carambolo
Los frutos son bayas elipsoidales u ovoides con 5 costillas o prominencias longitudinales; en
corte transversal da a la fruta una apariencia de estrella por lo que es llamada comnmente fruta
estrella (Figura 4a), los cuales se cosechan todo el ao. A cada costilla o prominencia
corresponde un lculo con dos semillas planas. Los frutos miden de 6 a 12 cm de largo por 3 a 6
cm de ancho (Len, 1987). Se da en racimos con un promedio de 8 a 10 frutos por racimo y las
mejores frutas se producen si estn protegidos del sol a travs del follaje de las hojas (Figura 4b),
de tal manera que los mejores racimos de frutas se dan en las axilas de las ramas y en la parte
interna de la falda de los rboles [2].
a b
5
La pulpa es jugosa de agradable fragancia y en las variedades ms dulces poseen un sabor vivo,
ligeramente subcido (Tello et al, 2002). Maduran a los cuatro o cinco meses despus de la
floracin (Orduz, 2002).
Tiene una piel fina, lustrosa y comestible, de color entre verde o dorado y amarillo-
anaranjado cuando est madura, (Figura 5).
Wan y Lam (1984), citan que la carambola en estado maduro, presenta mejor calidad que en
estado inmaduro, ya que los slidos solubles y la acidez no cambian durante el almacenamiento.
Sin embargo, estas caractersticas de madurez en el fruto acortan su vida de anaquel e
incrementan la susceptibilidad a daos por manejo.
6
2.3 Clasificacin taxonmica
El carambolo pertenece al reino vegetal, ubicado en la clase de la dicotilednea, del orden de las
geraniales, dentro de la familia botnica de las Oxalidaceae, perteneciendo al gnero Averrhoa,
ubicndose en la familia carambola L, adquiriendo el nombre cientfico de Averrhoa carambola
L.
Son diversos y numerosos los nombres bajo los cuales se conoce a la fruta del rbol carambolo
(Averrhoa carambola L.) en el mundo, (Tabla 1).
Pas Nombre
Mxico Carambolo, Carambola, rbol de pepino, Bambolea
Repblica Dominicana Cinco dedos
Costa Rica Tiriguro, Cambola
Brasil Lima de Callenas, Camboya
Venezuela Tamarindo Chino, Tamarindo Dulce
Colombia Carambolo, Caramelo
Francia Pomler de Goa, Caramboller, Camboya
China Yangto, Durazno extranjero
Filipinas Balimbing, Camboya
India Kamranga
EUA Star Fruit, Camboya
7
Tabla 2. Composicin qumica de la carambola (Tello et al, 2002).
La carambola es una fruta rica en vitamina C. Esta vitamina antioxidante, ayuda a prevenir
algunos cnceres de rganos con mucosa como el estmago, disminuye el riesgo de padecer
cataratas y otras enfermedades crnicas o degenerativas. Junto a la accin del cido flico y de la
fibra soluble ayuda a prevenir el estreimiento crnico y el cncer de colon (Palomar, 2006).
Contiene compuestos polifenlicos, como los taninos y vitamina C, haciendo que la fruta obtenga
una alta capacidad antioxidante. Cuando esta fruta es consumida permite bloquear y eliminar los
radicales libres del ser humano, evitando el infarto, colesterol, cncer al colon, el envejecimiento
8
prematuro, mal de Alzheimer, arteriosclerosis, enfermedades hepticas, problemas prostticos y
enfermedades de la piel [8].
La fibra soluble impide la absorcin del colesterol por el intestino; por su bajo contenido en
hidratos de carbono, riqueza en potasio y bajo aporte de sodio, resulta muy recomendable para
aquellas personas que sufren de diabetes, hipertensin arterial o afecciones de vasos sanguneos y
corazn (Palomar, 2006). Tambin se recomienda su consumo en otras situaciones: tabaquismo,
abuso del alcohol, empleo de ciertos medicamentos, estrs, actividad fsica intensa, sida, prdidas
digestivas originadas por vmitos o diarreas y enfermedades inflamatorias crnicas. Todas estas
circunstancias disminuyen el aprovechamiento de las vitaminas y producen una mala absorcin
de nutrientes. En Mxico, se ha extendido su uso, ya que es excelente para elevar las plaquetas,
bajar la fiebre y aminorar el dolor de huesos en casos de dengue clsico o hemorrgico [6].
Las personas que sufren de clculos y otras enfermedades renales, as como de gastritis, deben
tener cuidado con el consumo excesivo de carambolo, pues es rico en potasio y oxalato de
calcio [7].
2.7 Usos
2.8 Antioxidantes
Los antioxidantes son molculas que tienen la propiedad de evitar o prevenir la oxidacin con
otras molculas. Se produce una oxidacin, siempre que una especie cede electrones a otra, la
especie que gana electrones se reduce, y la que pierde se oxida. En estas reacciones de oxidacin,
a veces, se pueden producir radicales libres, especies muy oxidativas y que pueden producir
9
daos al organismo. Los antioxidantes son especies que acaban estas reacciones, inhibiendo
algn producto intermedio y oxidndose los mismos. Las clulas, como parte de su propio
metabolismo, producen radicales libres y especies reactivas del oxigeno (ROS). Estos radicales
libres, son bloqueados por un complejo sistema antioxidante de enzimas como la catalasa,
superxido dismutasa, glutatin peroxidasa y un continuo de antioxidantes no enzimticos, como
las vitaminas A, E y C, glutatin, ubiquinona o flavonoides. Si se produce un desequilibrio entre
los proxidantes y los antioxidantes, se llega a un estado de estrs oxidativo, que puede ser
producido por una excesiva produccin de radicales libres. Los seres vivos, tienen un complejo
sistema, para hacer frente a esta oxidacin, y en especial, los vegetales, por estar expuestos a la
radiacin solar. Ciertas sustancias, llamadas antioxidantes, desde vitaminas hasta polifenoles,
bloquean la accin de estos radicales libres (Almajano, 2009).
Los fenoles tienen la capacidad de atrapar especies reactivas de oxigeno debido a su propiedad
como donadores de electrones. La efectividad de su capacidad antioxidante va a depender de su
estabilidad en los diferentes sistemas, as como tambin del nmero y localizacin de grupos
hidroxilo, que rompen el ciclo de generacin de nuevos radicales libres, anticipando las
reacciones de terminacin actuando como un antirradicalarios (Robles et al, 2007). Constituyen
una de las principales clases de metabolitos secundarios de los vegetales, donde tienen diversas
funciones fisiolgicas. Entre otros, intervienen en el crecimiento y reproduccin de las plantas y
en los procesos defensivos, (patgenos, depredadores, incluso radiacin ultravioleta). Los
compuestos fenlicos comprenden desde molculas simples como lo cidos benzicos hasta
polmeros complejos como las ligninas. Los compuestos fenlicos estn presentes en todo el
reino vegetal y sus cantidades y tipos varan en funcin de la especie, variedad y parte del vegetal
(frutas, semillas, hojas) considerado horas de exposicin solar, grado de maduracin,
condiciones de cultivo, etc. (Muoz et al, 2007).
10
2.8 Actividad antioxidante en frutas
Los metabolitos secundarios de las plantas se encuentran en la mayora de las frutas, verduras, y
ts. Las plantas son la base de toda terapia de medicina tradicional y en 1992 se descubri el
efecto positivo de los antioxidantes en frutas y verduras. Hay un inters creciente por conocer la
capacidad antioxidante de frutas y verduras para usar su potencial como alimentos nutracuticos
o funcionales (Beltrn et al., 2009).
11
Tabla 3. Vitaminas con actividad antioxidante y sus fuentes alimentarias (Avello, 2006).
En general, las frutas son los vegetales ms ricos en compuestos polifenlicos, pero algunas
frutas los contienen como antioxidantes en mayor concentracin (Murillo, 2006). Los
antioxidantes polifenlicos se encuentran comnmente en vegetales, pero sus concentraciones
son ms altas en las frutas (Tabla 4).
Tabla 4. Productos alimenticios con alto contenido de antioxidantes fenlicos (Avello, 2006).
Producto Antioxidante
Frijol de soya Isofavonas, cidos fenlicos
T verde, t negro Polifenoles, catequinas
Caf Esteres fenlicos
Vino tinto cidos fenlicos, polifenoles
Romero cido carnstico, cido rosmrico
Ctricos y otras frutas Bioflavonoides, chalconas
Cebollas Quercetina, camferol
Aceitunas Polifenoles
12
Adems de su atractivo color y olor, los frutos tropicales poseen cantidades importantes de
compuestos bioactivos con capacidad antioxidante, tales como las vitaminas C y E, carotenoides
y polifenoles, especialmente flavonoides. Estos efectos benficos han sido atribuidos en parte a la
presencia de componentes bioactivos con actividad antioxidante, cuyo mecanismo de accin es
inhibir la iniciacin o impedir la propagacin de las reacciones de oxidacin, evitndose as el
dao oxidativo.
Los constituyentes antioxidantes de los frutos frescos cortados (FFC) son muy susceptibles a
degradacin cuando se exponen a oxigeno, luz y altas temperaturas. De la misma forma, los
procesos de sanitizacin donde se emplean compuestos con bajo pH (2-3), pueden favorecer en
diferente medida la oxidacin y dao del tejido, dependiendo del cultivar y estado de madurez.
Cuando los FFC se almacenan por periodos largos (2-3 semanas) se pueden producir perdidas
substanciales de vitamina C y otros compuestos bioactivos (Robles et al., 2007).
Los fenoles estn asociados al color, las caractersticas sensoriales (sabor, astringencia, dureza),
las caractersticas nutritivas y las propiedades antioxidantes de los alimentos de origen vegetal.
La caracterstica antioxidante de los fenoles se debe a la reactividad del grupo fenol (Paladino,
2008).
Por otra parte, el oscurecimiento del tejido debido a la degradacin de fenoles, catalizada por la
enzima polifenol oxidasa (PPO), adems de afectar la apariencia del producto disminuye la
actividad antioxidante por la prdida de esos compuestos. El cortado promueve la sntesis de
etileno, acelerando los procesos de senescencia del producto donde tiene lugar la oxidacin de
compuestos bioactivos. Durante la senescencia, la accin de la enzima lipoxigenasa (LOX)
resulta en la oxidacin de cidos grasos y al mismo tiempo, los carotenoides pueden degradarse
por co-oxidacin.
A los alimentos los compuestos fenlicos, se presentan conjugados con azcares, como la
glucosa, galactosa, arabinosa, ramosa, xilosa o los cidos glucornicos y galacturnicos. Tambin
pueden unirse con cidos carboxlicos, cidos orgnicos, aminocidos y lpidos.
13
En la actualidad, este grupo de compuestos de origen vegetal, presentan un gran inters
nutricional, por su contribucin, al mantenimiento de la salud humana.
Particularmente los jugos ctricos se caracterizan por una acumulacin importante de flavonoides
y fenilpropanoles, adems de cido ascrbico, siendo todos estos componentes los responsables
de proporcionar propiedades benficas relacionadas con la salud (Acevedo, 2004).
El ensayo Folin-Ciocalteu, ha estado utilizado durante muchos aos, como medida del contenido
en compuestos fenlicos totales en productos naturales. An as, el mecanismo bsico es una
reaccin redox, por lo que se puede considerar, como otro mtodo de medida de la actividad
antioxidante total. El reactivo Folin-Ciocalteu, est constituido por una mezcla de cido
fosfotngstico (H3PW12O40) y cido fosfomolibdico (H3PMo12O40), que se reduce por la
oxidacin de los fenoles en una mezcla de xidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno
(Mo8O23).
La oxidacin de los fenoles, presentes en la muestra, causa la aparicin de una coloracin azulada
que, y que se cuantifica por espectrofotometra en base a una recta patrn de cido glico. Se trata
de un mtodo preciso y sensible, pero que, an as, padece numerosas variaciones, cuando es
aplicado por diferentes grupos de investigacin, fundamentalmente en lo relativo a los volmenes
utilizados de la muestra, concentracin de reactivos y tiempo y temperatura de incubacin.
Tambin se producen numerosas variaciones, en el modo de expresar los resultados, de manera
que el patrn recomendado de cido glico, ha sido sustituido, en ocasiones por otros. El ensayo
de los fenoles totales, se utiliza con frecuencia en el estudio de las propiedades antioxidantes de
14
alimentos vegetales, como zumos de fruta, al tratarse de un parmetro que generalmente, muestra
una estrecha correlacin con los diferentes mtodos de medir la actividad antioxidante. As,
cuando se evalan, las propiedades antioxidantes de estos alimentos, el anlisis de fenoles,
proporciona informacin valiosa a la hora de seleccionar, variedades con mayor potencial
antioxidante (Almajano, 2009).
El anlisis de alimentos es la disciplina que se ocupa del desarrollo, uso y estudio de los
procedimientos analticos para evaluar las caractersticas de alimentos y de sus componentes.
Esta informacin es crtica para el entendimiento de los factores que determinan las propiedades
de los alimentos, as como la habilidad para producir alimentos que sean consistentemente
seguros, nutritivos y deseables para el consumidor. Existen un nmero considerable de tcnicas
analticas para determinar una propiedad particular del alimento. De ah la necesidad de
seleccionar la ms apropiada para la aplicacin especfica. La tcnica seleccionada depender de
la propiedad que sea medida, del tipo de alimento a analizar y la razn de llevar a cabo el anlisis.
Se definen los slidos totales como los residuos de material que quedan en un recipiente despus
de la evaporacin de una muestra y su consecutivo secado en estufa a temperatura definida. Los
15
slidos totales incluyen los slidos suspendidos, o porcin de slidos totales retenidos por un
filtro, y los slidos disueltos totales, o porcin que atraviesa el filtro.
El origen de los slidos disueltos puede ser mltiple, orgnico e inorgnico. La determinacin de
slidos disueltos totales mide especficamente el total de residuos slidos filtrables (sales y
residuos orgnicos).
El contenido de slidos solubles es un buen estimador del contenido azcar en los jugos de frutas,
ya que sta representa ms del 90% de la materia soluble en la mayora de ellos. Frecuentemente
se consideran los Brix como equivalentes de los SST porque el mayor contenido de slidos
solubles en el jugo de las frutas son azcares, sin embargo es ms preciso realizar las
correcciones pertinentes a las lecturas registradas con los brixmetros para obtener datos reales
en trminos de SST. Tambin deben hacerse correcciones por la temperatura a la cual se realice
la determinacin. Los slidos solubles del zumo de los ctricos estn formados,
fundamentalmente, por los azcares reductores y no reductores y por los cidos orgnicos. En la
maduracin, el contenido en azcares aumenta y el de cidos disminuye [11,12].
Una amplia variedad de mtodos se han utilizado para determinar azucares reductores, todos
estos han sido variaciones del mtodo de Fehling. Estas variaciones han sido para cada tipo de
alimento, en cualquier caso el principal logro de modificaciones ha sido mejorar la precisin de
reduccin y eliminar cualquier factor que interfiera con la produccin de oxido de cobre, de los
factores estudiados, la alcalinidad del reactivo, la proporcin, el tiempo de calentamiento, la
concentracin del azcar, parecen ser los ms importantes.
16
A partir de esto, diferentes tcnicas han sido utilizadas para determinar el oxido cuproso que se
forma y se han obtenido datos de calibracin; de estos mtodos los ms usados son el mtodo de
Lane-Eynon y el mtodo Munson y Walker.
En el mtodo Lane-Eynon se titula con el reactivo de Fehling caliente en dos etapas, primero se
aade una cantidad de reactivo de Fehling tal que se lleve a cabo la total reduccin y despus se
determina el punto final con azul de metileno por goteo, es necesario un control de la temperatura
y se sugieren dos titulaciones (Pomeranz y Meloan 2000).
2.10.5 Pectina
Las soluciones pcticas son solubles en agua con una alta proporcin de galacturonanos o
galacturonorhamnanos, aunque tambin arabinanos, galactanos y arabinogalactanos han sido
aislados de la fraccin pctica de varias plantas.
Las soluciones pcticas incluyen polisacridos que pueden ser extrados con agua caliente. Es
usual aadir un agente quelante como EDTA u oxalato de amonio al medio de extraccin para
liberar aquellas pectinas que estn presentes como sales de calcio.
(Southgate, 1991)
Las cenizas de un alimento son un trmino analtico equivalente al residuo inorgnico que queda
despus de calcinar la materia orgnica. Las cenizas normalmente, no son las mismas sustancias
inorgnicas presentes en el alimento original, debido a las perdidas por volatilizacin o a las
interacciones qumicas entre los constituyentes.
17
2.10.7 Protenas. Mtodo de Kjeldahl
El procedimiento de Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no
protenas como las protenas verdaderas (Aurand et al., 1987).
La acidez total o acidez titulable se define como la suma de todos los cidos orgnicos
encontrados en el alimento (fruta, vegetales, alimentos procesados, etc.) que pueden ser valorados
mediante una titulacin con una base fuerte, generalmente usando el hidrxido de sodio. El
resultado se expresa refirindose al cido que se encuentre en mayor proporcin.
La determinacin de la acidez total se basa en el hecho de que las frutas contienen cido ctrico,
cido tartrico y cido mlico, los cuales reaccionan con lcalis fuertes para dar origen a las sales
sdicas correspondientes.
18
2.10.9 pH
Generalmente en la maduracin de los frutos, los tejidos se reblandecen y pierden cohesin, esto
es a causa de un incremento de pectina soluble en agua acompaada de una prdida de
protopectina. Este incremento de pectina soluble se atribuye a la accin de las poligalacturonasas
que actan de forma conjunta con otras enzimas tales como las pectinmetilesterasas (PME) y
varias glicosidasas. Hablando de frutos climatricos, las glicosidasas particularmente llegan a un
incremento cuantitativo y a un aumento de actividad al mismo tiempo que hay incremento de
produccin de etileno.
La fibra diettica se define como los polisacridos y lignina que no son digeridos por enzimas
humanas (Lee y Prosky, 1995). Los mtodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se
fundamentan en aislar la fraccin del inters con la precipitacin selectiva y despus determinar
su peso.
La fibra diettica es uno de los componentes de las plantas que es comestible, est formada por
carbohidratos que son resistentes a la digestin y a la absorcin en el intestino delgado humano y
as mismo que puede ser total o parcialmente fermentada en el intestino grueso.
19
La fibra puede ser clasificada en dos grupos, fibra soluble y fibra insoluble. Para la determinacin
de cada uno de las clasificaciones se emplean diferentes mtodos cuantitativos, ya que hay unos
que identifican y cuantifican cada una de las fracciones la fibra bruta (insoluble), otros la fibra
total (soluble e insoluble). Al hablar de fibra bruta se hace referencia al residuo orgnico
combustible e insoluble generado despus de someter la muestra en determinados tratamientos
sucesivos con petrleo ligero, acido sulfrico diluido hirviente, hidrxido de sodio diluido
hirviente, acido clorhdrico diluido, en alcohol y ter. Dejando as el residuo el cual contiene
celulosa, lignina y hemicelulosa.
2.10.12 Vitamina C
20
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
21
4. HIPTESIS Y OBJETIVOS
4.1 Hiptesis
22
5. METODOLOGA
Ubicacin de especie
Averrhoa carambola L
Recoleccin de
fruto
Anlisis Actividad
bromatolgico antioxidante
Maceracin en
etanol
Humedad, Slidos totales,
Slidos solubles, Azcares
reductores, Pectinas, Protenas,
Acidez total, pH, Cenizas, Reduccin de
volumen
Fibra cruda, Vitamina C
Determinacin de Pruebas
absorbancia en fitoqumicas
espectrofotmetro
Preparacin de
curva de
calibracin
Determiancin de
compuestos fenlicos
totales por mtodo Folin-
Ciocalteu
23
5.1 Material Vegetal
La colecta de los frutos en la localidad de Los Mangos municipio de Yanga, Veracruz; se realiz
por las maanas durante el periodo de mayo a octubre de 2011. La eleccin de los frutos se
realiz considerando homogeneidad en el tamao, sazn y color, libres de daos por insectos,
plagas o deformaciones. A continuacin fueron trasladados dentro de un recipiente de plstico
para evitar daos mecnicos a la Facultad de Ciencias Qumicas de Orizaba Veracruz, para
efectuar la limpieza de los frutos con agua y jabn antes de realizar los anlisis correspondientes.
24
P P1
% Humedad 100
P2
Donde:
Se expresaron como Brix, esta determinacin se realiz con un refractmetro de mano marca
ATAGO a 25 C. Se coloc una gota de jugo de carambola en el refractmetro previa calibracin
del equipo con agua destilada, posteriormente se leyeron los Brix. A continuacin se realiz la
correccin de la lectura, considerando la temperatura de la muestra (Tabla 5).
25
Tabla 5 Slidos solubles totales (Bx)
Calentar la mezcla a ebullicin sobre tela de alambre sin asbesto y mantenerla a ebullicin
durante 2 minutos, bajando la llama si es necesario para evitar proyecciones, sin quitar la llama
adicionar 3 gotas de azul de metileno al 1% y completar la titulacin dentro de un tiempo total de
26
ebullicin de 3 minutos aproximadamente, adicionando pequeas porciones de azcar hasta
decoloracin total del azul de metileno.
5.3.5 Pectina
Para esta determinacin se redujo 50 g de muestra a pulpa fina, con ayuda de un mortero y se
mezcla bien, se vierte en un vaso de precipitado y se aaden 400 mL de agua, se puso a hervir
durante una hora manteniendo constante el volumen. A continuacin se transfiri el contenido a
un matraz volumtrico de 500 mL para diluir hasta el aforo del mismo a 20C. Posteriormente se
filtr a travs tomando alcuotas de 100 mL. Despus se agregaron 100 mL de agua y 10 mL de
hidrxido de sodio 1N, dejando reposar durante la noche.
Aadir 50 mL de solucin de cido actico 1N y dejar que la solucin repose durante 5 minutos.
Lentamente agregar 25 mL de solucin de cloruro de calcio 1N con agitacin constante. Dejar en
reposo durante una hora. Desecar durante una hora un pedazo de tela, que servir como filtro, en
un pesa filtro al que previamente se le ha determinado su masa. Lavar perfectamente la tela con
agua caliente hasta eliminar todas las trazas de cloruro. (Probar en las agua de lavado hasta la
ausencia del precipitado de cloruro de plata, el cual se obtiene por la adicin de solucin de
nitrato de plata y solucin de cido ntrico).
Transferir el pedazo de tela y residuo al pesa filtro y desecar a 105 C durante tres horas. Enfriar
y determinar su masa. Volver a desecar durante otra media hora y comprobar su masa para
asegurarse de que no se han producido posteriores prdidas de masa.
27
Clculos:
% Pectina
m1 m 100
s
Donde:
Para esta determinacin se utiliza un crisol tarado, a peso constante, donde se colocan 3 g de
muestra, a continuacin empleando un mechero la muestra se calcina, en seguida se pasa a la
mufla por 2 horas a 500 C, una vez concluido el tiempo, se pasa al desecador para que enfre y
cuando est a temperatura ambiente se pesa.
Clculos
P1 P2
% Cenizas * 100
P
Donde:
28
Digestin: Se pesaron 0.5 g de muestra previamente seca y molida en un matraz de digestin
Kjeldahl. Agregar 5 g de sulfato de potasio, 0.5 g de sulfato de cobre y 15 mL de cido sulfrico
concentrado. Calentar en manta calefactora; rotar el matraz peridicamente para digestin de toda
la materia orgnica, y una vez que la solucin est transparente, dejar en ebullicin 15 a 20 min
ms. Enfriar y posteriormente aforar a 100 mL.
29
alcuota de 25 mL, que se titul con hidrxido de sodio 0.1 N; usando como indicardor 3 gotas de
fenolftalena.
% Acidez
mL de solucin m.e. del cido N de NaOH 100
muestra
5.3.9 pH
El ndice de madurez se determin a partir de los resultados arrojados en los mtodos analticos
referentes a los slidos solubles totales y a los expresados en la acidez titulable (cido ctrico)
(ICOTEC, 1999). En la obtencin de resultados se emplea la siguiente frmula:
30
se transfiri al matraz de bola y se adicionaron 100 mL de hidrxido de sodio al 1.25% y se puso
a ebullicin con reflujo durante media hora. Nuevamente se filtr la solucin (a travs de un
papel filtro pesado previamente) y se enjuag con 10 mL de cido sulfrico al 1.25% y luego con
agua hirviendo hasta que el agua de lavado alcanz un pH neutro. Este residuo, junto con el
papel filtro, se coloc en un crisol a peso constante y se dej secar en la estufa a 130 C durante 2
horas. El crisol con la muestra se dej enfriar en un desecador y se pes. Finalmente, se calcin
en la mufla durante 30 minutos a 600 C, se dej enfriar y se pes.
5.3.11 Vitamina C
A continuacin se especifica la preparacin que se sigui de cada una de las soluciones que se
utilizan para el mtodo de Indofenol para la determinacin de cido ascrbico.
31
Valoracin de estndares de cido ascrbico
Fue necesario para una exactitud la titulacin de tres blancos con 7 mL de solucin de HPO 3-
HOAC ms un volumen de agua igual al volumen de la solucin de indofenol usada en la
titulacin directa.
Preparacin de la muestra
Para materiales que contienen cantidades apreciables de sustancias bsicas. Se aadi solucin de
HPO3-HOAC H2SO4 para ajustar el pH a aproximadamente a 1.2 y se tritur la muestra hasta
que estuvo en suspensin. Se diluy con la misma solucin a un volumen determinado designado.
32
Para materiales lquidos, se toma una cantidad de muestra que contena aproximadamente 100 mg
de cido ascrbico, se prosigui a ajustar el pH a aproximadamente a 1.2 con solucin de HPO 3-
HOAC H2SO4. Se diluy con la solucin de HPO3-HOAC a un volumen determinado que
contenga aproximadamente 10-100 mg de cido ascrbico por 100 mL.
Se titularon tres replicas por cada muestra, cada una contena aproximadamente 2 mg de cido
ascrbico, se realizaron determinaciones de blancos para la correccin de las titulaciones, se
usaron volmenes apropiados de la solucin HPO3-HOAC y agua. La determinacin se calcul
de la siguiente manera:
cido ascrbico ( mg ) ( X B )( F )( V )
g ,tableta ,mL EY
Donde:
33
cubrirlas totalmente, se dejaron en reposo por tres das a temperatura ambiente protegidas de la
luz.
Posteriormente se separ el extracto etanlico de la fruta por filtracin, del cual se tomaron
aproximadamente 50 mL para las pruebas fitoqumicas y al resto se le redujo el volumen por
medio de bao mara hasta un volumen final de 20 mL.
Primero se hizo una solucin estndar de cido glico preparndose 50 mL de solucin madre (A)
con una concentracin de 105 gmL-1: a 0.00525 g (5.25 mg) de cido glico, se adicionaron 50
mL de solvente (alcohol metlico). Por otro lado se prepar una solucin (B): 0.1 mL de alcohol
metlico y 9.9 mL de agua para un total 10 mL; tambin se prepar reactivo de Folin-Ciocalteu al
50% v/v (5 mL de reactivo ms 5 mL de agua destilada), y 100 mL de carbonato de sodio al
7.5%. Se hizo la curva estndar considerando concentraciones entre 10-90 mEqmL-1. Para esto
se tomaron las alcuotas que se indican en la Tabla 6.
34
En una celda se colocaron 300 L de cada concentracin (10-90 mEqmL-1), 1200 L de agua
desionizada y 1500 L de reactivo de Folin-Ciocalteu. La mezcla se agit durante tres minutos y
enseguida se adicionaron 3000 L de carbonato de sodio al 7.5%. Se agit de nuevo por unos
segundos y se incub durante 15 minutos a 45 C. Se dejaron transcurrir 20 minutos para que la
reaccin se estabilizara. Pasado este tiempo se hizo la lectura en el espectrofotmetro UV-Vis
modelo 1000 a 760 nm de longitud de onda () contra un testigo de metanol.
35
mL de solvente y se volvi a incubar 24 horas a 25 C y 300 rpm. Despus de este tiempo se puso
en la centrfuga a 13,000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se incorpor con el anterior y se
almacen a -20 C hasta su utilizacin.
36
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
Los resultados obtenidos para cada una de las determinaciones realizadas en la carambola se
presentan en la Tabla 7.
Pectina 0.10
Fibra 3.59
Protenas 0.28
37
Los resultados obtenidos con respecto a azcares reductores comparados con los reportados por
Tello et al., (2002), se encuentran con valores ms bajos; con respecto a la prueba de acidez,
expresada como cido ctrico, cido mlico y oxlico, los valores son inferiores; en relacin a la
determinacin de vitamina C, slidos solubles, los resultados obtenidos son superiores y en el
caso de pectina y pH, los valores son iguales a los reportados; estos resultados pueden atribuirse
al estado de madurez de la planta, que en este trabajo se decidi utilizar en sazn, etapa en que la
fruta an no ha logrado la conversin total de los polisacridos a disacridos, aumentado la
dulzura del producto; otra razn puede ser el hecho de que el fruto proviene de cultivos de
traspatio, donde el producto no recibe ningn tipo de fertilizacin a diferencia con las muestras
utilizadas en el otro trabajo donde se refiere proceden de un invernadero.
Dentro del grupo de las frutas ctricas se encuentran: limn, mandarina, toronja, naranja, lima y
kiwi; carambolo, tambin pertenece a este grupo y el valor determinado de vitamina C, expresado
como cido ascrbico para carambolo de 54.25 mg se encuentra entre los valores reportados
semejante al de la naranja (55 mg); superior al de mandarina, toronja , limn y lima; que tienen
un promedio que va de 30 a 52 mg; el carambolo solo es superado por el kiwi al cual se le reporta
80 mg. Esta comparacin resulta benfica si se trata de establecer que el consumo de esta
novedosa fruta aportar las mismas cantidades de vitamina C que las de uso comn.
En el anlisis fitoqumico del extracto etanlico (Tabla 8), de la especie Averrhoa carambola L.,
arroj resultados similares a los reportados por Novillo (2009).
38
de las variantes se encuentra en las sesquiterpenlactonas y glucsidos cardiotnicos dando
positivo a la prueba de Baljet.
Pruebas fitoqumicas
Flavonoides
Vapores de amoniaco +
Shinoda +
Glucsidos cardiotnicos
Baljet +
Fenilpropanoides +
Saponeinas
Rosenthaler +
Sesquiterpenlactonas
Baljet +
+ significa presencia
Palomar (2006), seala que el carambolo contiene compuestos polifenlicos y taninos, lo cual
coincide con los resultados obtenidos en el carambolo, que indican la presencia de flavonoides
principalmente.
Por otro lado Almajano, (2009), refiere la relacin de la capacidad antioxidante con la presencia
de flavonoides y vitamina C, entre otros; la determinacin realizada, permite sealar que a ellos
se debe la capacidad antioxidante que otros autores confieren a este fruto.
39
Los compuestos fenlicos o polifenoles provienen del metabolismo secundario de las plantas.
Qumicamente son compuestos que tienen al menos un anillo aromtico al que est unido uno o
ms grupos hidroxilo. Existe una gran variedad de compuestos fenlicos, y se clasifican en
flavonoideos, formados por dos anillos aromticos unidos por un heterociclo oxigenado y que
dependiendo del grado de hidrogenacin y de la sustitucin del heterociclo son, flavonoles,
flavonas, isoflavonas, antocianos, proantocianidinas, flavanonas, etc. y se encuentran
generalmente en forma de glicsidos, y los no flavonoideos, compuestos benzoicos y cinmicos,
llamados comnmente cidos fenlicos, que contienen un anillo aromtico con diferentes grupos
funcionales, y que pueden estar formando esteres con los cidos orgnicos. Otros compuestos de
naturaleza polifenlica son estilbenos, taninos, ligninas y lignanos. Algunas de las propiedades de
los productos de origen vegetal, como color, astringencia y aroma son debidas a la presencia de
compuestos de este tipo.
En la Figura 7 se muestra el modelo ajustado obtenido a travs del mtodo de regresin lineal
simple, el cual ayuda a explorar y cuantificar el grado de relacin existente entre la absorbancia y
la concentracin (mEqmL-1 de cido glico) para as desarrollar una ecuacin lineal con fines
predictivos. Adems, el anlisis de regresin lleva una serie de procedimientos de diagnstico
que informan la estabilidad e idoneidad del anlisis.
40
Grfica de lnea ajustada
Concentracin = - 5.575 + 132.8 Absorbancia
100 S 2.97398
R-Sq 98.9%
R-Sq(adj) 98.8%
80
Concentracin
60
40
20
El anlisis de varianza nos permite aceptar o rechazar la hiptesis nula (Tabla 9). En general, en
este trabajo se plantean dos hiptesis: la hiptesis nula (H0) que indica que el modelo no es
adecuado y la hiptesis de investigacin (H1) la cual muestra que ste si es adecuado. Para
conocer cul de las dos hiptesis es la correcta se recurre a la probabilidad de que la hiptesis
nula sea verdadera (P), que en este caso es cero, la que indica que se debe aceptar la H 1, por no
existir la probabilidad de que H0 sea verdadera.
41
Tabla 9. Anlisis de varianza
Fuente DF SS MS F P
Regresin 1 20180.8 20180.8 2281.71 0.000
Error 26 230.0 8.8
Total 27 20410.7
Los residuos (diferencia entre los valores observados y los pronosticados) son muy importantes
en el anlisis de regresin (Figura 8). En primer lugar, informan sobre el grado de exactitud del
pronstico: cuanto ms pequeo es el error tpico de los residuos, mejor se ajusta la recta de
regresin a la nube de puntos. En segundo lugar, el anlisis de las caractersticas de los casos con
residuos grandes (valor absoluto) puede ayudar a detectar casos atpicos y, perfeccionar la
ecuacin de regresin
Los supuestos del modelo estadstico se refieren a una serie de condiciones que deben darse para
garantizar la validez del modelo; como es la normalidad, que indica si los residuos de la variable
independiente se distribuyen normalmente con media cero.
El grfico de probabilidad normal de la Figura 9 muestra a los residuos con una distribucin
normal, la nube de puntos se encuentra en su mayora alineada sobre la diagonal del grfico; lo
que parece confirmarse con el histograma de residuos. Tambin se puede notar una aparente
distribucin de la nube de puntos de los residuos con respecto al valor ajustado.
42
Grficas de residuos para Concentracin
Grfica de probabilidad normal vs. ajustes
99
5.0
90
Porcentaje
2.5
Residuo
50 0.0
10 -2.5
-5.0
1
-8 -4 0 4 8 0 20 40 60 80
Residuo Valor ajustado
3 2.5
Residuo
2 0.0
1 -2.5
-5.0
0
-4 -2 0 2 4 6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Residuo Orden de observacin
Muestras
Promedio
(Averrhoa carambola L.)
43
La Tabla 11 muestra la cantidad de compuestos polifenlicos (mEq cido glico mL-1), lo cual se
obtuvo mediante el perfil polifenlico; introduciendo la absrobancia (x) leda en el refractmetro
en la frmula.
Perfil Polifenlico=-5.575+132.8x
Concentracin
23.641
(mEq cido glico mL-1)
Se puede notar a simple vista un valor pequeo de compuestos polifenlicos, pero hay que tomar
en cuenta que ste se encuentra expresado en frutos fresco; donde el agua podra obstruir en la
extraccin y cuantificacin de compuestos fenlicos; adems, los constituyentes antioxidantes de
los FFC son muy susceptibles a degradacin cuando se exponen a oxigeno, luz y altas
temperaturas.
La tcnica empleada para la determinacin de polifenoles totales es determinada por Vila Lpez
(2006), donde indica que es una tcnica muy til con numerosas ventajas como la rapidez, bajo
costo, fcil manejo y los resultados obtenidos son un indicio de su posible utilizacin, adems
seala que los modelos de calibracin son aceptables y en este trabajo la curva de estandarizacin
y el modelo estadstico aplicado permiti eficientemente la cuantificacin de compuestos
polifenlicos totales, expresados como mEq cido glico mL-1.
44
7. CONCLUSIONES
Los resultados expresados anteriormente sealan al carambolo (Averrhoa carambola L.), como
un fruto con alto contenido de vitamina C, as como el anlisis fitoqumico y la cuantificacin de
los compuestos fenlicos totales indican en este fruto una elevada capacidad como antioxidante;
caractersticas que le dan un valor agregado al incluirlo en la alimentacin.
45
8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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14. http://www.biblio.colpos.mx:8080/jspui/handle/10521/325
50
9. ANEXO
Flavonoides
1) Vapores de amoniaco: Someter una muestra del material a estudiar a vapores de amoniaco. La prueba
vegetal puede cambiar de color, interpretndose como sigue:
2) Reaccin de Shinoda: Consiste en tratar el extracto alcohlico incoloro o ligeramente amarillo, con una
viruta de magnesio y unas cuantas gotas de cido clorhdrico concentrado, la interpretacin es como
sigue:
Anaranjado Flavonas
Rojo Flavononas
51
Cumarinas
1) Formacin de hidroximato: A una gota de extracto etanlico o etreo, aadir una gota de solucin de
metanol 2N de clorhidrato de hidroxilamina y una gota de solucin metanlica 2N de KOH. Calentar la
mezcla durante dos minutos y enfriar. Acidular con HCl 0.5N y aadir una gota de cloruro frrico al 1%.
La prueba es positiva si se observa la formacin de una coloracin viletacea. En caso negativo, diluir un
poco y repetir la prueba.
2) Prueba de Legal: Disolver una pequea muestra de extracto en 3 gotas de piridina (si el solvente del
extracto no es soluble en piridina, se evapora este a sequedad). Aadir una gota de solucin reciente de
nitroprusiato de sodio al 0.5% y posteriormente gota a gota, 4 gotas de KOH 2N. La prueba es positiva si
se observa una coloracin rosa- rojo.
Sesquiterpenlactonas
1) Formacin de hidroximato: A una gota de extracto etanlico o etreo, aadir una gota de solucin de
metanol 2N de clorhidrato de hidroxilamina y una gota de solucin metanlica 2N de KOH. Calentar la
mezcla durante dos minutos y enfriar. Acidular con HCl 0.5N y aadir una gota de cloruro frrico al 1%.
La prueba es positiva si se observa la formacin de una coloracin viletacea. En caso negativo, diluir un
poco y repetir la prueba.
2) Prueba de Legal: Disolver una pequea muestra de extracto en 3 gotas de piridina (si el solvente del
extracto no es soluble en piridina, se evapora este a sequedad). Aadir una gota de solucin reciente de
nitroprusiato de sodio al 0.5% y posteriormente gota a gota, 4 gotas de KOH 2N. La prueba es positiva si
se observa una coloracin rosa- rojo.
3) Prueba de Baljet: Solucin A de cido pcrico, solucin B de sosa, se mezclan en volmenes iguales
antes de usarse. Una pequea cantidad de muestra se pone en contacto con 3-4 gotas del reactivo de
Baljet, la prueba es positiva si se roma una coloracin anaranjado a roja obscura.
4) Prueba de Tollens: Agregar a 2 mL de nitrato de plata al 5% una gota de hidrxido de sodio al 10%.
Aadir hidrxido de amonio al 2% hasta disolver el precipitado. Un mL de esta mezcla se agrega a una
muestra de extracto libre de solvente. La prueba es positiva al formarse un espejo de plata. Las lactonas
alfa-gama insaturadas dan positivas a esta prueba aun en ausencia de sosa.
Saponinas y sapogeninas
Saponinas
1) Formacin de espuma: Al sacudir una muestra en agua, la prueba ser positiva si existe formacin de
espuma.
2) Prueba de Molish: Uno o dos mg de glucsido contenidos en tubo de ensaye, se mezclan con una o
dos gotas de alfa naftol en etanol (5%) . Por la pared del tubo se agrega cido sulfrico concentrado. La
prueba es positiva si se forma un anillo violeta.
52
1) Prueba de Rosenthaler: Una muestra pequea se pone en contacto con una o dos gotas de de
vainillina al 1% en etanol y una o dos gotas de HCl concentrado. Se obtienen coloraciones
caractersticas.
2) Prueba de Noller: Una muestra de 4 u 8 mg contenida en un tubo de ensaye, se pone en contacto con
4 gotas del reactivo de Noller. El tubo se tapa y se observan los cambios de color durante 60 minutos, de
amarillo a caf rojizo, pasando por diversos tonos de naranja y verde. Puede variar rpidamente a caf
obscuro.
Glucsidos cardiotnicos
2) Prueba de Legal: Una muestra pequea se disuelve en 2-3 gotas de piridina, se agrega una gota de
nitroprusito de sodio y 1-3 gotas de sosa. La prueba es positiva si se forma una coloracin rojo- intenso.
3) Prueba de Keller-Kiliani: (Para glucsidos cardiotnicos con 2-desoxiazucares o para estos azucares).
Una pequea muestra se disuelve en 1 mL de una mezcla formada por sulfato frrico y cido actico
glacial. Se agregan 1-2 gotas de cido slfurico, siendo la prueba positiva si en 1-2 minutos aparece un
color azul.
4) Prueba Baljet: Solucin A de cido pcrico, solucin B de sosa, se mezclan en volmenes iguales
antes de usarse. Una pequea cantidad de muestra se pone en contacto con 3-4 gotas del reactivo de
Baljet, la prueba es positiva si se roma una coloracin anaranjado a roja obscura.
Alcaloides
1) Prueba Mayer: Una muestra de extracto previamente acidulada con cido sulfrico o cido clorhdrico
previamente diluido, se trata con unas gotas de reactivo de Mayer, la prueba es positiva si se produce un
precipitado blanco.
2) Prueba de Dragendorff: Una muestra de extracto previamente acidulada con cido sulfrico o cido
clorhdrico previamente diluido. Se trata con unas gotas de reactivo de Dragendorff, la prueba es positiva
si se produce un precipitado naranja marrn.
3) Prueba de Wagner: Una muestra de extracto acuoso o etanlico previamente acidulada, se trata con el
reactivo de Wagner, la prueba es positiva si se produce un precipitado floculante de color marrn.
Iridoides
Utilizar tres tubos de ensaye de la siguiente manera: en el primero colocar 0.5 mL del extracto etanlico.
Colocar en el segundo tubo 0.5 mL del extracto etanlico, mezclar con 3 mL de vainillina (4% en metanol)
y con 1.5 mL de HCl concentrado. La muestra se protege de la luz durante 1 a 2 horas. Por ltimo en el
tercer tubo colocar la mezcla de reactivos sin muestra. Interpretacin: color azul indica la presencia de
iridoides.
53
Antocianinas
1) A un tubo de ensayo agregar 0.5 mL de extracto y agregar 0.5 mL de una solucin alcalina (KOH,
NaOH, etc.). Interpretacin: la prueba es positiva si hay formacin de coloracin verde o azules.
2) A un tubo de ensayo agregar 0.5 mL de extracto y agregar 0.5 mL de una solucin cida.
Interpretacin: la prueba es positiva si hay formacin de coloracin roja, violeta o morada.
Fenilpropanoides
1) A un tubo de ensayo agregar 1 mL del extracto etanlico (tubo testigo). A un segundo agregar 1 mL de
extracto etanlico, 2 mL de HCl 0.5N, 2 mL de NaNO 2 al 10% y 2 mL de NaOH 2N. A un tercer tubo
agregar todos los reactivos excepto el extracto etanlico. Interpretacin: coloracin naranja y despus de
la adicin de la sosa coloracin rosa-purpura.
54