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Acide citrique par fermentation

par Enrico MORETTI


Directeur du Dpartement de biotechnologie
Pressindustria SpA - Biassono (MI) Italie
et Fabio FELIPPONE
Chef du laboratoire Recherche et Dveloppement
Pressindustria SpA - Biassono (MI) Italie

1. Biosynthse de lacide citrique............................................................ J 6 062 - 2


2. Procds de production avec lAspergillus niger........................... 3
2.1 Fermentation en surface ............................................................................. 3
2.2 Fermentation submerge............................................................................ 3
2.3 Fermentation en phase solide .................................................................... 4
2.4 Procds dextraction.................................................................................. 4
3. Procds de production avec des levures du type Candida........ 5
4. Fiche produit ............................................................................................. 5
4.1 Proprits physico-chimiques .................................................................... 5
4.2 Spcifications commerciales ...................................................................... 5
4.3 Toxicit.......................................................................................................... 5
4.4 Stockage ....................................................................................................... 5
4.5 Utilisation de lacide citrique et de ses sels............................................... 6
4.6 Principaux producteurs et prix ................................................................... 6
Rfrences bibliographiques ......................................................................... 7

acide citrique (acide 2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylique) est trs diffus


L dans la nature. Il intervient dans le mtabolisme de nombreux animaux et
plantes ; il a t isol sous forme cristalline partir du jus de citron, en 1784,
par K.G. Sheele et sa structure a t tablie par Liebig en 1838. La synthse
chimique de lacide citrique, partir de glycrine, remonte 1880. En 1893,
Wettmer dcouvrit quelques micromyctes capables de produire lacide citrique
par fermentation de substrats contenant du sucre.
Les premiers quipements industriels remontent au dbut du sicle. Ils pro-
duisaient lacide citrique par extraction partir de citrons (qui en contiennent
de 7 9 %) ; jusqu 1920, plus de 90 % de la production mondiale dacide citrique
tait ralise en Italie. cette poque le procd industriel par fermentation,
en utilisant Aspergillus niger comme micro-organisme producteur et le sucre
12 - 1996

comme matire premire commena se dvelopper en Europe et aux


tats-Unis. Au dbut des annes 30, 80 % de la production mondiale dacide
citrique tait ralise par fermentation.
De nos jours, lacide citrique est produit par des techniques de fermentation
en surface et submerge et il est utilis, avec ses sels, essentiellement
dans lagro-alimentaire, lindustrie pharmaceutique et dans les dtergents.
J 6 062

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Techniques de lIngnieur, trait Gnie des procds J 6 062 1
ACIDE CITRIQUE PAR FERMENTATION ______________________________________________________________________________________________________

1. Biosynthse de lacide duction et laccumulation dun ou plusieurs intermdiaires (comme


lacide citrique) par altration des mcanismes de rgulation des
citrique principales voies mtaboliques avec des modifications gntiques
(qui peuvent se produire naturellement ou tre induites artificielle-
ment) et/ou par la culture de micro-organismes dans un milieu de
Lacide citrique est un intermdiaire du cycle de Krebs (ou cycle composition trs dsquilibre, cest--dire avec une carence ou un
des acides tricarboxyliques) (figure 1), qui illustre la partie principale excs en substances particulires. La production industrielle
du systme mtabolique oxydant des substances organiques nutri- dacide citrique par fermentation a t dveloppe en utilisant des
tives par des micro-organismes. Ce cycle, qui reprsente la partie micro-organismes gntiquement slectionns de plus en plus
terminale de la dgradation oxydante des substances nutritives en productifs et en cherchant les meilleures conditions de culture
CO2 et H2O, fournit lnergie ncessaire aux processus vitaux et pour obtenir les rendements maximaux avec diffrents substrats.
reproductifs des cellules de micro-organismes, ainsi que les subs- Les micro-organismes les plus tudis ont t les champignons du
tances intermdiaires ncessaires la synthse des amino-acides genre Aspergillus et les levures du genre Candida.
et des lipides.
Ci-dessous sont illustrs les principaux procds de fermentation
Dans les conditions normales, les cellules du micro-organisme qui utilisent Aspergillus niger et levures du genre Candida comme
produisent les intermdiaires du cycle de Krebs en quantit suffi- micro-organismes producteurs.
sante pour ses exigences vitales. Il est possible dobtenir la surpro-

Figure 1 Cycle de Krebs

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2. Procds de production la fin du cycle, le mot de fermentation est dcharg du fond


des cuves ; aprs sparation de la couche superficielle de myclium,
avec lAspergillus niger il est envoy dans les rservoirs de stockage pour extraction de
lacide. Le myclium est enlev des cuves, lav puis sch. Il peut
tre valoris en alimentation animale.
Aspergillus niger est le principal micro-organisme utilis de nos La fermentation superficielle, par ses caractristiques particu-
jours pour la production industrielle de lacide citrique, qui est lires, ne peut pas tre automatise et, pour cette raison, elle exige
effectue, en conditions arobies, par les techniques de fermentation une importante main-duvre ; lusage de cette technologie pour des
en surface, submerge ou en phase solide, suivies par des procds installations industrielles de grande capacit est donc trs difficile.
dextraction et de purification.

2.2 Fermentation submerge


2.1 Fermentation en surface
La fermentation submerge est ralise dans des fermenteurs o
les micro-organismes sont cultivs dune faon homogne dans
Cette technique a t la premire utilise. Elle consiste cultiver toute la masse du milieu nutritif liquide et maintenus aux conditions
Aspergillus niger sur la surface dun milieu nutritif liquide contenu optimales doxygnation, de temprature et de pH.
dans des cuves en aluminium ou en acier inoxydable appropri (anti- Gnralement, les fermenteurs sont des bacs cylindriques en
corrosion) empiles lune sur lautre, espaces de 30 40 cm, dans acier inoxydable de qualit dfinie, de volume compris entre 50 et
des rteliers placs dans des salles striles de fermentation quipes 500 m3, ils sont construits pour supporter la pression de strili-
dun systme daration trs efficace. sation. Ils possdent aussi des systmes pour la dispersion de lair
Les petites cuves, les rteliers et les chambres de fermentation strile et de refroidissement du liquide de fermentation et ils
sont soigneusement lavs et striliss avant chaque opration de peuvent tre munis ou non dune agitation mcanique. En labsence
fermentation. dagitation mcanique, le brassage du milieu est assur par le pas-
sage de lair, ou le mlange de gaz au travers du racteur. Temp-
Le milieu nutritif, ou mot de fermentation, est prpar en diluant
rature, pH, niveau de la mousse, oxygne dissous, dbit dair strile
la matire premire, gnralement une mlasse de betterave, de
et addition de matires premires sont contrls automatiquement
faon obtenir une concentration en sucre, le substrat principal,
par des ordinateurs : les phases de lavage et de strilisation, aprs
comprise entre 15 et 20 %. Dautres substances, ncessaires la
chaque cycle de fermentation, sont compltement automatises.
croissance du micro-organisme et au bon droulement de la fer-
mentation, sont ajoutes ce milieu. Celles-ci sont principalement Dans la production industrielle de lacide citrique, cette technique
des sources dazote et de phosphore (ammoniaque, sels dammo- est en train de remplacer la fermentation de surface puisquelle
nium, phosphates, etc.), des traces de mtaux (sels de Fe, Mn, Mg, prsente beaucoup davantages :
Zn, etc.), diffrents facteurs de croissance (vitamines, extraits de temps de fermentation plus courts ;
levure, etc.). productivit plus grande et quantits infrieures de produits
Aprs dilution la mlasse est gnralement traite avec de lhexa- secondaires ;
cyanoferrate de potassium pour complexer et prcipiter la quantit meilleur contrle des paramtres ;
en excs dions de fer et dautres mtaux lourds qui ont une influence plus grande garantie dasepsie ;
ngative sur la production dacide citrique. conomies despace et de personnel.
Le mot de fermentation est pasteuris ou strilis, puis refroidi Les matires premires principalement utilises sont des
la temprature de fermentation, une valeur de pH entre 6 et 7. mlasses de betterave ou de canne et des sirops de glucose net-
Ensuite, il est plac dans des cuves, chacune contenant de 400 tement plus purs que les mlasses. Celles-ci contiennent une quan-
2 000 L sur une hauteur de 8 20 cm. On procde linoculation tit plus ou moins grande dimpurets et doivent tre purifies
des spores dAspergillus niger qui sont disperses la surface du pralablement avant fermentation en utilisant le traitement, dj
mot de fermentation en quantit variant de 70 150 mg/m2. dcrit plus haut, lhexacyanoferrate de potassium ou en utilisant
dautres techniques telles que filtration, floculation ou passage sur
Le procd comporte deux phases : une premire phase, dune rsines changeuses dions.
dure denviron 2 jours, de germination et de croissance du
micro-organisme avec la formation dune couche consistante de Le mot de fermentation est prpar dans le fermenteur principal
myclium enchevtr en surface ; cette phase est suivie par celle de en diluant la matire premire prtraite la concentration en sucre
production de lacide citrique. La fermentation est conduite une dsire (en gnral de 10 20 %), aprs addition des sources dazote
temprature de 28 32 oC, le pH ayant une valeur initiale de 6 7 et de phosphore, des sels minraux et des facteurs de croissance
descend jusqu une valeur denviron 3 suite la formation dacide ncessaires puis il est strilis.
citrique. Un flux dair strile balaye la surface du milieu en fournis- Aprs avoir ajust de pH (6 7) et la temprature (28 30 oC),
sant la quantit doxygne ncessaire aux diverses tapes du pro- on ajoute linoculum prpar avec la quantit ncessaire de spores
cd. Il limine par vaporation deau les calories produites pendant dans de petits fermenteurs partir de souches pures de laboratoire.
la fermentation. Le balayage maximal dair correspond un dbit Dune manire analogue la fermentation submerge se droule
de 2 4 volumes dair par volume de milieu par minute (vvm). La en deux phases successives, une de croissance des
consommation maximale est obtenue lorsque la production dacide micro-organismes et une dintense production dacide citrique. La
citrique est la plus intense. 30 40 % de leau initiale est vapore fermentation dure 5 9 jours ; pendant cette priode lair strile est
pendant lopration. fourni, avec un dbit de 0,5 1 vvm ncessaire pour la croissance
La dure totale du cycle de fermentation est de 6 12 jours, avec des micro-organismes et pour la production dacide citrique. La tem-
une production de 60 75 g dacide citrique par 100 g de saccharose prature est maintenue rigoureusement la valeur fixe comprise
et une concentration finale denviron 200 g/L. entre 25 et 32 oC ; le pH est en gnral descendu jusqu 2 ou 2,5.
En mme temps, on obtient la formation dune quantit appr- La concentration finale de lacide citrique est de 100 130 g/L, avec
ciable de sous-produits, principalement les acides oxalique et une production de 65 80 g par 100 g de saccharose (ou de glucose)
gluconique. contenu dans la matire premire. Le principal sous-produit est
lacide oxalique.

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la fin de la fermentation, le liquide est spar du myclium en


utilisant des filtres bandes ou rotatifs sous vide, et envoy aux
rservoirs de stockage pour rcupration ultrieure de lacide
citrique. Le myclium est gnralement lav et sch (de 150 200 kg
par tonne dacide citrique produit).

2.3 Fermentation en phase solide

La fermentation en phase solide est la fermentation des sucres


contenus dans les pulpes sucres de dchets, marcs, etc., ainsi que
des substances amylaces qui viennent des procds de produc-
tion de lamidon. La teneur en eau des pulpes est variable.
La fermentation, dont la dure est de 5 10 jours, est conduite
dans des cuves places dans des chambres striles ares et main-
tenues une temprature de 30 32 oC, o la matire premire,
aprs avoir t humidifie et strilise, est inocule avec des spores
dAspergillus niger. Les rendements sont plutt modestes puisque
les matires premires ne subissent aucun traitement de purifica-
tion et les conditions de fermentation sont loin dtre optimales et
restent peu contrlables.
Ces limitations, avec les besoins de surface importante,
empchent lapplication de cette technique dans des installations de
moyenne ou grande capacit. Pour sa simplicit, cette technique
peut tre utilise pour de petites productions en situations locales
particulires.
De nos jours, la fermentation en phase solide est applique
presque exclusivement au Japon pour une production infrieure
2 000 t/an.

2.4 Procds dextraction

Lacide citrique est gnralement spar du liquide de fermenta-


tion par prcipitation ou par extraction par solvant, car la cristal-
lisation directe nest pas possible cause de la prsence
dimpurets dues aux matires premires.
Figure 2 Schma simplifi du procd de production
La figure 2 reproduit le schma dun procd dextraction par dacide citrique
prcipitation aprs une production dacide citrique par fermenta-
tion submerge.
Ce procd, qui est le plus utilis, met profit la prcipitation de
pouvoir en utiliser une partie, entranent une augmentation impor-
lacide citrique sous forme de citrate de calcium par lajout
tante des cots de production de lacide citrique.
dhydroxyde de calcium au liquide de fermentation jusqu obtenir
un pH denviron 8. Au dbut de laddition de lhydroxyde, le pH est Les procds de rcupration par extraction par solvant oprent
denviron 3, loxalate de calcium prcipite et il est spar. par extraction slective de lacide citrique du liquide de fermenta-
tion avec un solvant organique non miscible leau et rextraction
Le citrate de calcium en suspension dans leau, est trait environ
ultrieure de lacide par de leau.
50 oC par un lger excs dacide sulfurique pour obtenir lacide
citrique libre en solution et du sulfate de calcium insoluble. Puis la Ces systmes, qui ont t introduits pour liminer la formation
solution dacide citrique est traite sur des rsines changeuses du sulfate de calcium, sont difficilement applicables des procds
dions, pour fixer les ions inorganiques rsiduels, enfin elle est qui utilisent des matires premires trs impures, comme les
dcolore avec du charbon actif. Cette solution est concentre dans mlasses.
des vaporateurs multiples effets puis envoye dans les cristal- Gnralement, lextraction est ralise contre-courant,
lisoirs. temprature ambiante, avec des extracteurs multi-tages. Pour
Lacide citrique est obtenu sous forme de monohydrate quand la favoriser lextraction par la phase organique, on peut utiliser un
cristallisation est effectue une temprature infrieure 36,5 oC, mlange damines secondaires ou tertiaires insolubles dans leau.
ou sous forme anhydre une temprature suprieure. Aprs la La rextraction par leau est ralise en utilisant le mme systme,
cristallisation, on ralise le schage et le conditionnement. mais une temprature plus leve. La solution aqueuse est traite
avec du charbon actif puis concentre jusqu la cristallisation de
Les sous-produits de ce procd dextraction et de purification
lacide citrique.
(calculs en substance sche) reprsentent environ 2,5 t par tonne
dacide citrique obtenue. Ce sont principalement : le myclium (15 Les connaissances sur les procds industriels de rcupration
20 % du total), le sulfate de calcium (environ 60 %) et dautres par extraction par solvant sont trs limites ; pour cette raison, il
produits contenus dans le mot de fermentation. La quantit leve est difficile dvaluer les avantages, dun point de vue pratique, en
de sous-produits couler et les traitements ncessaires pour comparaison avec la mthode traditionnelle par prcipitation.

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3. Procds de production Sa formule chimique est la suivante :

avec des levures


du type Candida
Bien que les procds de production dacide citrique par culture
submerge, dcrits plus haut, sont dsormais bien connus,
lindustrie du secteur est toujours la recherche de techniques alter-
natives pour utiliser des matires premires nouvelles, pour Numro CAS (*) : 77-92-9 pour la forme anhydre,
simplifier les procds de fermentation, en slectionnant de 5949-29-1 pour le monohydrate,
nouveaux micro-organismes faciles utiliser et ayant une haute
capacit productive et pour minimiser les problmes de traitement Numro EINECS (**) : 2010691 pour les deux formes.
des effluents et des rsidus solides. (*) Chemical Abstract Service
(**) European Inventory of Existing Commercial Substances
Au dbut des annes 70, des procds de fermentation par la
technique submerge, avec des levures du type Candida utilisant
des n-paraffines (alcanes linaires) comme matire premire ont t
dvelopps. La fermentation se faisait un pH de 4 6 et une tem- 4.1 Proprits physico-chimiques
prature de 26 30 oC. Elle donnait, en 3 4 jours, des rendements
de conversion de 130 140 %. Le principal produit secondaire tait Lacide citrique est un acide organique relativement fort avec une
lacide isocitrique. Les liquides de fermentation, qui sont trs purs, constante de premire dissociation de 8,2 104 ; la deuxime et la
permettaient lutilisation de procds dextraction plus simples que troisime constantes de dissociation sont respectivement
ceux partant de matires premires traditionnelles avec une impor- 1,77 105 et 3,9 107.
tante rduction des sous-produits liminer. Lacide citrique anhydre fond 153 oC alors que le monohydrate
Cette technologie fut utilise industriellement par la socit Liqui- perd son eau de cristallisation entre 70 et 75 oC et fond entre 135
chimica qui ralisa en Italie une installation avec une capacit de et 153 oC.
100 000 t/an pour la production dacide citrique et de citrate Il est trs soluble dans leau (735 g/L 20 oC), soluble dans les
trisodique. Linstallation fonctionna peu de temps cause de alcools. Il est insoluble dans des autres solvants organiques
laugmentation du cot des n-paraffines et limpossibilit dutiliser comme le tolune, le benzne et le chloroforme.
le produit obtenu dans les industries alimentaires et pharma-
ceutiques du fait de la matire premire employe. En solution aqueuse, le groupe hydroxylique et les groupes
carboxyliques se conduisent comme des chlates en formant des
Par la suite, dautres levures du type Candida ont t slectionnes complexes chlats avec des ions mtalliques.
pour utiliser le glucose, directement ou sous forme hydrolyse en
amidon, comme matire premire.
Lapplication industrielle de cette technologie continue tre
tudie avec beaucoup dintrt. 4.2 Spcifications commerciales
Ces derniers temps [1] a t dvelopp un procd utilisant un Dans le tableau 1 sont mentionnes les spcifications commer-
alcool thylique de cot trs bas comme matire premire et une ciales pour les utilisations pharmaceutiques [2] et alimentaires [3].
souche mutante de Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica ) comme
micro-organisme producteur. La dure de la fermentation est de 5 (0)
6 jours, avec une concentration finale dacide citrique de 110
130 g/L et un rendement de conversion atteignant 90 100 %. Le
pH est maintenu par addition de NaOH entre 4 et 7 et la temprature 4.3 Toxicit
entre 26 et 30 oC.
Dans ce cas, les liquides de fermentation sont trs purs et, pour Lacide citrique est considr comme un additif alimentaire non
cette raison, aprs sparation des levures, il est possible dutiliser toxique. Il peut tre utilis dans les aliments sans limitation,
des systmes dextraction par cristallisation directe de lacide comme la dcid le comit conjoint FAO/WHO sur les additifs ali-
citrique qui se trouve dans le mot de fermentation, aprs llimi- mentaires.
nation du sodium (qui vient de la soude ajoute comme correcteur Lacide citrique tant un irritant de la peau et des yeux, pendant
de pH) grce des rsines changeuses dions ou par lectro- sa manipulation, il faut utiliser des moyens appropris pour la pro-
dialyse. Les rsidus de ce procd sont rduits environ 200 kg de tection corporelle.
substance sche par tonne dacide citrique produit.
Il est biodgradable et ne prsente pas de risque pour lenviron-
nement.

4. Fiche produit
4.4 Stockage
Lacide citrique (acide 2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylique)
est lacide organique le plus important obtenu industriellement par Lacide citrique, soit anhydre, soit monohydrat, est stock sans
fermentation. difficult ; pour prvenir une possible agglomration il faut viter
des conditions de temprature et dhumidit leves.
Il est vendu anhydre (M = 192,13 g/mol) ou monohydrate
(M = 210,14 g/mol). Les solutions dacide citrique sont corrosives pour le ciment, lalu-
minium, le fer, le cuivre et ses alliages. Elles ne doivent pas tre uti-
Il se prsente en cristaux incolores ou en poudre cristalline lises avec les polycarbonates, les polyamides, les polyimides et les
blanche, inodore, de saveur acide caractristique. La forme mono- polyacrylates.
hydrate est lgrement efflorescente lair sec.

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Tableau 1 Spcifications commerciales de lacide citrique (1)


Usage pharmaceutique [2] Usage alimentaire [3]
Puret (sur matire sche)........................................................... > 99,5 % > 99,5 %
Limpidit et couleur de la solution ............................................. passe le test (2)
Teneur en eau :
forme anhydre..................................................................... < 0,5 % < 0,5 %
monohydrate ....................................................................... de 7,5 9 % < 8,8 %
Baryum.......................................................................................... passe le test (2)
Teneur en calcium........................................................................ < 200 ppm
Teneur en mtaux lourds (Pb)..................................................... < 10 ppm < 5 ppm
Teneur en arsenic......................................................................... ............................................................. < 1 ppm
Teneur en plomb .......................................................................... ............................................................. < 0,5 ppm
Teneur en fer ................................................................................ < 50 ppm
Teneur en chlorures ..................................................................... < 50 ppm
Teneur en sulfates........................................................................ < 150 ppm
Teneur en acide oxalique ............................................................ < 350 ppm passe le test (2)
Substances facilement carbonisables ........................................ passe le test (2) passe le test (2)
Taux de cendres ........................................................................... < 0,1 % < 0,05 %
Teneur en tridodcylamine ......................................................... ............................................................. < 0,1 ppm
Absorption UV .............................................................................. ............................................................. passe le test (2)
(1) exprims en % en masse ou bien en ppm (partie par million) soit 106 en masse.
(2) Se reporter la rfrence bibliographique indique en tte de colonne.

4.5 Utilisation de lacide citrique le citrate de fer-ammonium ;


le citrate de potassium ;
et de ses sels le citrate de sodium.
Le citrate de sodium est le plus largement utilis et sa
Les principales applications de lacide citrique dans les diffrents consommation augmente sans cesse dans le secteur des dtergents
secteurs industriels sont les suivantes : comme remplaant efficace biodgradable des polyphosphates et
des zolithes. Il est aussi utilis dans les secteurs alimentaires,
Boissons et aliments : il est utilis principalement comme cosmtiques et pharmaceutiques.
agent acidulant, comme correcteur de la sapidit et comme agent
conservateur.
Pharmaceutique, cosmtique et hygine du corps : il 4.6 Principaux producteurs et prix
trouve des applications dans la prparation de diverses formes
pharmaceutiques effervescentes en association avec une source de
carbonate ou bicarbonate ; en mme temps, on exploite ses Les principaux producteurs mondiaux sont les suivants : Miles,
proprits antimicrobiennes. Dans lindustrie cosmtique et pour ADM, Cargill, Jungbunzlauer, Hoffmann-La Roche.
lhygine de corps, il est utilis comme antioxydant et rgulateur de
pH. La production mondiale de lacide citrique et de ses sels, est situe
principalement en Europe et aux tats-Unis ; elle tait value plus
Autres utilisations : les solutions qui contiennent de lacide de 600 000 t/an en 1995. titre indicatif, la consommation est ainsi
citrique sont largement employes pour lenlvement des oxydes rpartie :
mtalliques de la surface des mtaux ferreux et non ferreux et 65 % dans lindustrie alimentaire et dans les boissons ;
comme agent antitartre dans les chaudires. Il trouve beaucoup 10 % dans lindustrie pharmaceutique et les cosmtiques ;
dautres applications dans lagriculture, dans le placage lectro- 20 25 % dans lindustrie des dtergents et pour le nettoyage
lytique des mtaux, dans la photographie, dans la prparation de des mtaux ;
certains plastifiants et comme composant des rsines alkydes. Les 5 % pour des autres utilisations industrielles.
sels de lacide citrique dimportance commerciale sont :
Le prix de catalogue en juin 1996 tait denviron 2 $/kg pour des
le citrate dibasique dammonium ; quantits industrielles [4].
le citrate de calcium ;

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Rfrences bibliographiques

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(1992). KIRK-OTHMER Encyclopedia of Chemical

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