ESTUDIO MICROBIOLGICO DEL ESPUTO Y VAS RESPIRATORIAS INFERIORES

INTRODUCCION

El esputo es una sustancia que est constituida por materia procedente de las vas
respiratorias inferiores, que llega a la boca gracias a fenmenos de expectoracin. El hecho
de tener que realizar un largo recorrido desde que se produce hasta que sale al exterior,
condiciona que arrastre consigo a restos celulares y a microorganismos que se encuentran a
su paso, falsificando o enmascarando el producto inicial.
Sin embargo, hay varios procesos bacterianos que actualmente an se investigan en esputo:
la neumona bacteriana, la bronquitis crnica y la tuberculosis pulmonar.

Los microorganismos que con mayor frecuencia se encuentran complicados en estas

afecciones respiratorias son: Streptococcus pneumoniae, Klebsiella
pneumoniae y Staphylococcus aureus, que muchas veces causan neumonas mucho ms
rpidas y peligrosas que el propio neumococo;Enterobacteriaceae, sobre todo coliformes
y Proteus, Pseudomonas y Haemophilus influenzae.

Tambin son motivo de infecciones Mycoplasma pneumoniae, Histoplasma

capsulatum y Mycobacterium tuberculosis. Con excepcin de estos tres ltimos, los anteriores
forman parte en cierta manera de las vas respiratorias superiores, y, por tanto, pueden
recuperarse de los cultivos sin tener importancia patolgica. El microbilogo debe saber
valorar la presencia de estos microorganismos, teniendo en cuenta que en neumonas
bacterianas agudas, el germen responsable suele encontrarse casi en cultivo puro.

OBTENCION DE LA MUESTRA

Para que la recogida de esputo sea aceptable, deber cumplir una serie de requisitos,
resumidos a continuacin:

El material se recoger en un frasco estril de boca ancha.

Se procurar que la expectoracin se efecte a primera hora de la maana, y que provenga

de tos profunda (esputo traqueobronquial).

Se desecharn las muestras con saliva, o con moco de procedencia nasal (muestras
inadecuadas).

La muestra se procesar enseguida, sobre todo si se sospecha histoplasmosis. Como mximo

puede guardarse varias horas en nevera (una-tres horas).

METODOLOGIA

A partir de la muestra se efectuar un frotis, procurando extender las partes ms purulentas

del esputo, que se teirn por el mtodo de Gram. Si el clnico lo solicita, se practicar
tambin una tincin para Mycobacterium (Ziehl-Neelsen o auramina)
La coloracin de Gram permite visualizar la flora bacteriana del esputo, observndose
diplococos lanceolados grampositivos junto a clulas de pus, tpico de neumococos, o
abundantes racimos de cocos grampositivos, caractersticos del estafilococo, o numerosos
bacilos cortos y gruesos, gramnegativos, a veces capsulados, significativo de Klebsiella
pneumoniae, cuya infeccin debe tratarse inmediatamente, pues su evolucin es rpida y
fatal. En cualquiera de los casos, y sin esperar el resultado de los cultivos, se indicar al
clnico la etiologa sospechosa para que tome las medidas oportunas.
Investigacin de neumona por neumococo

Actualmente, en el medio extrahospitalario, el 70-80 por 100 de las neumonas bacterianas

siguen siendo de etiologa neumoccica. En el medio nosocomial van aumentando
progresivamente las debidas a bacterias gramnegativas. En ambos casos, los principales
mtodos microbiolgicos lo constituyen el hemocultivo y el anlisis de esputo.

Son sospechosos de neumona aquellos esputos de apariencia rojiza (herrumbrosos), o

manchados de sangre (hemoptoicos). En estos casos se proceder de la siguiente forma:

a) Se seleccionarn los grumos purulentos o los filamentos sanguinolentos de la muestra, y,

con la ayuda de un asa de platino, se depositarn sobre un portaobjetos. A continuacin se
tapar con un cubre y se apretarn los dos cristales con el fin de obtener una extensin fina.
Se fijar por calor y se teir por el mtodo de Gram. Con la diferencia de la tcnica de
tincin, este mismo mtodo se utiliza para preparar frotis para investigar Mycobacterium
tuberculosis.

b) Se sembrar una porcin purulenta o sanguinopurulenta sobre agar sangre 5 por 100 de
carnero, y se incubar en atmsfera de C02 a 37 C durante veinticuatro horas. Algunos
autores siembran otra porcin de la muestra en tioglicolato, que acta como medio de
enriquecimiento, y al da siguiente resiembran en agar sangre 5 por 100 de carnero.

c) Despus de las oportunas incubaciones, en caso de que existan neumococos, aparecern

en forma de colonias planas, brillantes, alfa-hemolticas, transparentes, y con el centro
deprimido y los bordes ms altos. Entre las pruebas necesarias para su identificacin
destacan la solubilidad en bilis y la sensibilidad a la optoquina. Tambin pueden identificarse
serolgicamente.

Investigacin de neumona por otros microorganismos patgenos

Las caractersticas del esputo pueden orientar algo sobre el microorganismo que est
presente en l. As los esputos espesos y consistentes pueden ser debidos a Klebsiella
pneumoniae, y los purulentos de olor ftido a microorganismos anaerobios en pacientes con
abscesos pulmonares, empiemas o bronquiectasia.
Otros grmenes que con frecuencia producen infecciones pulmonares son Escherichia coli y
otras Enterobactericeas, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, los cuales, al
igual que Klebsiella pneumoniae, crecen bien en agar sangre y no presentan dificultad en su
identificacin.

En ocasiones pueden pasar desapercibidas las infecciones fngicas, responsables de cuadros

como histoplasmosis, criptococosis, candidiasis, etc. Es de gran ayuda en su descubrimiento,
la simple observacin en fresco de la muestra.

Del resto de posibles agentes de infecciones pulmonares, cabe destacar al parsito

oportunista Pneumocystis carinii, que para su diagnstico precisa de tcnicas no
microbiolgicas, como son la biopsia pulmonar teida con sales de plata (Gomorri).

NEUMONIAS ATIPICAS:

Hay pulmonas que cursan clnica y radiolgicamente de forma distinta a la clsica neumona
de Streptococcus pneumoniae. A estos procesos, se las denomina neumonas atpicas, y estn
producidas por microorganismos que difcilmente pueden investigarse por metodos directos,
por lo que se han desarrollado una serie de pruebas serolgicas para tal efecto.
A continuacin se describen las caractersticas de estos microorganismos, prestando especial
atencin a alguno de ellos.

Virus . Son probablemente los microorganismos que antes desaparecen de las secreciones
pulmonares, por lo que su investigacin debe efectuarse muy tempranamente. Entre los
mtodos de diagnstico serolgico destacan la contrainmunoelectroforesis y el
enzimoinmunoensayo (ELISA). La reaccin de fijacin de completo es tambin muy
utilizada para la investigacin de virus respiratorios.

Mycoplasma pneumoniae . Es el productor de la neumona atpica primaria. Es el

microorganismo de vida libre ms pequeo que existe. Sus dimensiones estn prximas al
poder resolutivo del microscopio ptico. El pequeo tamao de sus elementos cocoides (0,1-
0,3 micras), les capacita, al igual que a muchos virus, para atravesar los filtros de
membrana, hecho que en principio abog por su unin. Actualmente se les considera
incluidos dentro del grupo de las bacterias por poseer dos cidos nucleicos y crecer in vitro en
medios de cultivo anlogos a los utilizados por ellas. Presentan la particularidad de estar
exentos de pared celular durante toda su vida.

Cultivados en medios slidos, las colonias de Mycoplasma suelen tener una forma
caracterstica, que recuerda a un huevo frito, debido a la formacin de un cuerpo central
que penetra en el agar, rodeado de un rea circular que al ser ms delgada despide una
tonalidad ms clara. Normalmente los medios lquidos inoculados pueden parecer estriles,
debido a que el pequeo tamao de las clulas evita que la luz se difracte, atravesando el
tubo sin manifestar turbidez.

El Mycoplasma pneumoniae, produce infeccin al atacar las membranas celulares epiteliales

de las vas respiratorias. El perodo de incubacin es de dos a tres semanas y no hay signos
de enfermedad.

La mejor forma de efectuar el diagnstico de la neumona atpica primaria es por fijacin de

complemento, cuyos anticuerpos se manifestan a los siete-diez das del comienzo del cuadro
clnico. Con frecuencia aparecen aglutininas fras (anticuerpos IgM), que son los primeros
detectados, aunque su desarrollo no es especfico. De todas formas, una clnica respiratoria
con aumento de crioaglutininas policlonales, es muy sugestivo de la enfermedad.

Los mtodos directos de diagnstico no son tiles para investigar una etiologa micoplsmica
de la neumona atpica, pues el microorganismo tarda casi un mes en desarrollar sus colonias
sobre el medio de cultivo. De todas formas, a continuacin se detallan sus principales
caractersticas morfolgicas, de cultivo e investigacin.

La toma de muestra se efecta de las superficies mucosas, por las que posee una especial
predileccin (cavidad oral), y del tracto respiratorio (esputos, gargarismos, etctera).

El medio de cultivo utilizado consta de 70 por 100 de caldo PPLO, 2O por 100 de suero de
caballo o de cerdo y 10 por 100 de extracto de levadura fresca, preparada al 25-50 por 100.
Para solidificarlo se aade 1 por 100 de ion-agar al caldo. Como antibacterianos se aade
penicilina G (1.000.000 UI) y 2 ml. de acetato de talio al 2,5 por 100. Este medio expuesto
sirve para el crecimiento de Mycoplasma, pero es suceptible de variaciones, igualmente
vlidas.

El pH de crecimiento es de 7,8-8. Para ajustarlo se recomienda utilizar bicarbonato al 4,4 por

100 o P04 K2 H 1 molar en lugar de OHNa, ya que ste precipita al suero y enturbia al
conjunto. Las principales variaciones del medio bsico son:

a) Medio lquido con glucosa: Consta del medio lquido bsico al que se aade 2 ml. de rojo
fenol al 0,1 por 100 y 1 ml. de glucosa al 10 por 100. Se ajusta a pH 7,8-8, con lo que
adquiere un color rojo prpura. El crecimiento de los organismos fermentadores de la glucosa
(Mycoplasma pneumoniae) se pone de manifiesto por un gradual cambio de color hacia el
amarillo.

b) Medio lquido con arginina: Est constituido por el medio bsico al que se aaden 2 ml. de
rojo fenol al 0,1 por 100 y 1 ml. de arginina al 10 por 100. Se ajusta el pH a 7, aadiendo
0,2-0,4 ml. de HCI N. El color final del medio es amarillo anaranjado, y los microorganismos
que metabolizan la arginina (otros micoplasmas distintos a Mycoplasma pneumoniae)
producen un cambio de color a rojo (aumentan el pH).

c) Medio con azul de metileno: Se utiliza normalmente en forma difsica. Consta del medio
bsico con glucosa al que se aade 1-1,5 ml. de azul de metileno al 0,1 por 100 y se ajusta el
pH a 7,8. Mycoplasma pneumoniae es la nica especie capaz de crecer en este medio y
reducir el azul de metileno, al tiempo que fermenta la glucosa, variando el color de azul
oscuro a verde intenso.

Las muestras clnicas procedentes de la cavidad oral se inoculan en el medio bsico slido y
en los tres caldos, produciendo a los veinticinco-treinta das las diminutas y caractersticas
colonias (apreciables con 15 aumentos), y variando la coloracin de los caldos, a) y c).

Con frecuencia los micoplasmas recin aislados no forman colonias con centro, sino
simplemente circulares. Posteriormente, cuando el microorganismo se adapta al medio de
cultivo de laboratorio, se produce la tpica forma colonial. Otras veces, las colonias aparecen
como formas rugosas o granulares de superficie irregular, que sobresalen algo del agar e
indican crecimiento bacteriano. Para comprobar que este crecimiento es debido
a Mycoplasma pneumoniae, se selecciona una de estas colonias al microscopio y con una
esptula estril se corta el bloque de agar que la contenga, y se deposita sobre otro medio
para micoplasmas, de modo que la pseudocolonia contacte con la superficie del nuevo agar. A
continuacin, presionando ligeramente, se desplaza el bloque en todas direcciones. Esta
nueva placa se incuba en las condiciones antes mencionadas, y se inspecciona
peridicamente al microscopio, intentado descubrir la presencia de microcolonias.

Nunca se debe efectuar la resiembra de una colonia de Mycoplasma con asa, pues no se
conseguir, o si se logra, significa que se trata de una contaminacin.

Legionella pneumophila es el agente causal de una neumona atpica denominada

enfermedad de los legionarios.

Los sucesos acaecidos condicionaron que al cuadro neumnico, de etiologa desconocida, se le

llamase enfermedad de los legionarios. Posteriormente se consigui aislar la bacteria,
denominndola Legionella pneumophila, de la que en la actualidad se conocen varios
serogrupos.

Es curioso mencionar que ya en 1947 se haba cultivado la bacteria, pero sin concederle una
importancia clnica concreta.

En el esfuerzo de los cientficos por incrementar los conocimientos sobre el germen, se

aislaron cepas de microorganismos ntimamente relacionados con l, que en primer lugar se
designaron como organismos semejantes a Legionella pero que despus han constituido
nuevas especies. Entre ellas podemos destacar a L bozemanii, L dumoffii, L micdadei y L
gormanii.

Legionella pneumophila es un bacilo gramnegativo de 0,5 a 0,7 micras de anchura por 2

micras de largo, aunque puede llegar a tener hasta 20 micras. Para su visualizacin en cortes
de tejido se utilizan tcnicas de impregnacin argntica, recomendndose preferentemente la
modificacin de Dieterle.

Es mvil por un flagelo polar y uno lateral poseyendo adems otros apndices parecidos. Es
muy poco activa bioqumicamente. No es esporulada y produce catalasa y oxidasa, esta
ltima a veces, dbilmente. Tambin fabrica gelatinasa y beta-lactamasas.

Estudiando al microorganismo por cromatografa de gas-lquido se ha comprobado que est

constituido por gran cantidad de cidos grasos de cadena ramificada, lo cual representa una
caracterstica taxonmica de especial interes.

Crece muy lentamente en medios de cultivo enriquecidos como el agar Charcoal Yeast extract
o el agar Feeley-Gorman. Otro medio en el que se obtienen buenos resultados es el MH-IH.
Existe tambin la modificacin de Smalley y cols. que han propuesto aadir selenito sdico al
agar Feeley-Gorman, sealando que se favorece el crecimiento de Legionella.

Estos medios no selectivos el nico que lo es algo es el suplementado con selenito son
aptos para el aislamiento del microorganismo a partir de muestras lquidas no contaminadas,
como lquidos pleurales o aspirados transtraqueales. Si el estudio se efecta sobre productos
contaminados (esputos, etc.), es ms recomendable utilizar medios semiselectivos, como el
de Edelstein y Finegold.

La incubacin se realiza a 35 C en aerobiosis, exceptuando en el medio de Feeley-Gorman,

en que se aconseja aadir un 2,5 por 100 de C02, y en el MH-IH donde es recomendable
hacerlo en un frasco buja.

Las colonias de Legionella tardan varios das en crecer y son muy pequeas. Las que lo hacen
en el medio de Feeley-Gorman suelen presentar una pigmentacin gris. En cuanto a la
supervivencia, hay autores que aseguran que Legionella pneumophila es capaz de
permanecer viable por espacio de dos meses en agar Charcoal
Para aislar al microorganismo tambin resulta til la inoculacin al cobaya.

Para confirmar la identificacin se utilizan tcnicas de fluorescencia directa, cromatografa

gas-lquido, o mtodos genticos de hibridacin de cidos desoxirribonucleicos.

Las tcnicas de fluorescencia directa pueden utilizarse a su vez, con aceptables niveles de
sensibilidad, sobre secreciones respiratorias, lquidos pleurales, aspirados transtraqueales o
esputos.

El diagnstico de la enfermedad puede hacerse tambin por mtodos serolgicos, buscando

anticuerpos especficos en el suero del paciente, que presenta ttulos ascendentes a partir de
la primera semana y con un mximo hacia la quinta. La investigacin se hace por
microaglutinacin o por ELISA, aunque la tcnica universalmente aceptada es la de
inmunofluorescencia indirecta.

Parece ser que la sintomatologa neumnica que motiv el inters por la enfermedad, slo es
un aspecto, quiz el ms importante, de las manifestaciones clnicas de la infeccin. En otros
casos afecta a los sistemas renal, gastrointestinal o nervioso central.
Hasta el momento no se conoce ningn reservorio del microorganismo ni el mecanismo de
transmisin; sin embargo, la va ms probable parece ser la area, penetrando mediante la
respiracin.