UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA

INTEGRANTES:
GRANADOS CALDERON, BRYAN JESS
PORTOCARRERO, PABLO

FLORICULTURA II - GRUPO A* - JAULIS

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 1. Introduccin
Desde hace miles de aos el hombre ha domesticado animales y plantas con
relativo xito; ya que no toda la naturaleza, con su biodiversidad ha sido sometida
y solo un porcentaje muy pequeo, es el que ha sido manipulado por el hombre
para su sustento alimentario y necesidades varias tales como: fibras y materiales
para la elaboracin de todas sus manufacturas, que luego van a formar piezas
ms elaboradas como textiles, vivienda, herramientas, medicinas y en fin todo lo
que el hombre puede imaginar en su mente creadora.

Ya con nuevas herramientas y tecnologas el hombre descubri que las plantas

podan reproducirse o multiplicarse en un tiempo ms rpido y en mayor nmero;
con ventajas evidentes que hicieron crecer el cultivo de tejidos vegetales, como
una rama de la biotecnologa.

La inmensa diversidad de plantas con potencial ornamental existente en nuestro

pas est siendo actualmente mal aprovechada, siendo una de las razones, el
desconocimiento de tcnicas alternativas de micropropagacin. La tala como
actividad extractiva y la prdida de dichos hbitats llega a tal punto que
actualmente muchas de nuestras especies nativas se encuentran en inminente
peligro de extincin. Una alternativa para la solucin de este problema lo
constituye el recurrir a la reproduccin artificial, la cual se puede llevar a cabo de
manera rpida, eficiente y segura mediante la propagacin in vitro.

En la presente practica se llevara a cabo la siembra in vitro de semillas de

orqudea en las instalaciones del IBT de la UNALM, con la finalidad de conocer
acerca de la propagacin in vitro de este material as como de los
procedimientos y cuidados que se debe tener al momento de realizarlo.

2. Objetivos:
Profundizar en el manejo de instrumentos, equipos, reactivos, soluciones,
nutricin y todo lo pertinente con el crecimiento y desarrollo de las plantas
in vitro.
Propagar orqudeas por medio de cultivos de semillas.

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 3. Revisin Literaria:

A. Definicin:
El cultivo de tejidos vegetales es un grupo de tcnicas por medio de las cuales se
pueden obtener plantas, a partir de una porcin vegetal con crecimiento activo
de una planta donante; a esta porcin se le denomina explante; su tamao
generalmente es pequeo (ocasionalmente microscpico) y su manipulacin
debe ser bajo condiciones de laboratorio asptico e inoculado en medios de
cultivo apropiados, bajo condiciones ambientales controladas. (Pachn, 2008).

B. Ventajas de la Propagacin In vitro:

Nmero ilimitado de nuevas plantas (miles).

Nmero grande de plantas homogneas o iguales a la planta donante, ya
que el explante es de carcter somtico y su informacin gentica es
homocigota 2n diploide, y no sexual n haploide.
El tiempo de regeneracin de una planta es significativamente menor.
Sanidad de las plantas propagadas por este mtodo: son de calidad
certificada, ya que en cada uno de los pasos de la propagacin, se hace
una seleccin del material, con el fin de producir nicamente material
sano, y eliminar el material contaminado.
Mejoramiento gentico: con fines de obtener plantas ms resistentes al
ataque de plagas y enfermedades, as como plantas tolerantes a sequas,
salinidad, heladas y muchas ms condiciones adversas que en la
naturaleza estn presentes e inciden en el vegetal.

C. La biologa de la germinacin de semillas de orqudeas

Las semillas de orqudeas son conocidas usualmente como semillas de polvo
porque son minsculas y contienen pocas reservas de alimento. Usualmente estas
semillas no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un
hongo micorriza, el mismo que abastece a las plantas jvenes con azcares y
nutrientes que necesitan hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar
su propio alimento. Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada
de clulas llamada protocormo.

Manteniendo las condiciones normales, el protocormo continuar su crecimiento

por varias semanas, meses o incluso aos dependiendo de la especie hasta que
alcance la edad apropiada para producir races y hojas. En el caso de orqudeas
terrestres, es de vital importancia que la relacin orqudea-hongo se conserve
durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el
protocormo enterrado no puede fabricar alimento por s mismo.

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Por otro lado, los protocormos de las orqudeas epfitas son comnmente verdes,
lo que les posibilita producir parte de su alimento. La relacin orqudea-hongo no
ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orqudeas tropicales.

D. Fundamentos para mantener condiciones de esterilizacin

Es de vital importancia que el medio, los frascos, los aparatos y las semillas se
mantengan desinfectadas desde el principio del proceso de germinacin.
Cualquier bacteria u hongo que se introduzca en los frascos crecer ms rpido
que las semillas y pronto ocupar su espacio hasta matarlas. Las condiciones de
esterilizacin en la preparacin del medio se crean autoclavando el medio y los
frascos a utilizarse por 15 minutos a 15 atm. Esta temperatura y presin son
suficientes para matar todas las esporas de bacterias y hongos presentes en el
medio.

Las semillas deben ser esterilizadas y transferidas a los frascos sin introducir hongos
o bacterias externos. Generalmente, este proceso se realiza sembrando desde la
superficie desinfectada de cpsulas verdes, o desinfectando semillas maduras
con hipoclorito de sodio o calcio, o perxido de hidrgeno. Adems de
asegurarse que todos los instrumentos utilizados en la transferencia estn
desinfectados. Con cierto cuidado y prctica se puede crear y mantener
condiciones de esterilizacin desde la germinacin hasta el transplante de las
semillas.

E. Uso de la cmara de flujo laminar

Se debe prestar atencin a ciertas reglas bsicas al usar la cmara de flujo
laminar:

1. Siempre se la debe desinfectar por completo usando alcohol de 70-90% de

concentracin. Use un roceador y limpie todas las superficies de la cmara con
un algodn empapado de alcohol (incluyendo las paredes y el techo). Se debe
desinfectar tanto antes como despus de utilizar la cmara.

2. Todo lo que ingresar en la cmara debe estar esterilizado. Utilice guantes y

desinfctelos completamente antes de usarlos, rocendo alcohol y guardndolos
en la cmara hasta que el alcohol se haya secado. Con prctica, es posible en
lugar de usar guantes, lavarse las manos y fregarse las uas usando un jabn
antibacterial, secarse y esterilizar con alcohol, sin embargo en caso de que
existieran problemas con contaminacin bacterial se debe volver a utilizar los
guantes. Use un mandil de laboratorio y lvelo constantemente. Una vez en la
cmara, la esterilizacin es asegurada sumergindola en etanol al 100% y
encendindola tres veces antes de usarla. La mejor manera de conservar el
etanol es en frascos grandes de vidrio para permitir la mxima exposicin de los

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instrumentos al etanol. Despus de flamear los instrumentos stos deben ser
ubicados rpidamente sobre un frasco de vidrio esterilizado para continuar con el
flameado. Djelos enfriar antes de su uso.

3. Recuerde que cualquier espora de bacteria u hongo dentro de la cmara

flotar hacia el interior y en direccin a su persona. Nunca ponga las manos,
mangas u otro objeto sobre o en direccin de algo desinfectado (como el
medio). Trabaje en lo posible por la parte de atrs de la cmara y minimice el
tiempo de exposicin de los medios cuando sea posible.

4. Mantenga las condiciones de esterilizacin mediante la limpieza regular de la

cmara con alcohol, desinfecte nuevamente los instrumentos luego de su uso y
lvese de nuevo las manos despus de haber tenido contacto con cualquier
objeto fuera de la cmara.

F. Elaboracin del medio de cultivo

El xito que se obtenga en el cultivo de tejidos vegetales depende en gran parte
del uso de un medio nutritivo adecuado, como tambin del empleo de tejidos
viables, incubacin, calidad de reactivos, etc. Las necesidades nutricionales,
varan con la especie, naturaleza del tejido, estado fisiolgico, mtodo de cultivo
y tipo de organognesis a estudiar. La nutricin mineral in vitro, est en funcin de
las dimensiones del explante, la naturaleza del tejido, la actividad metablica, la
frecuencia de trasplante y la composicin del medio.

Los principales componentes del medio de cultivo se pueden clasificar en:

1. Sales inorgnicas: Mezcla de macronutrientes y micronutrientes.

2. Compuestos orgnicos: Se clasifican en tres grupos: Carbohidratos, sustancias

hormonales (auxinas, citoquininas, giberelinas, etileno, cido abscisico) y
vitaminas.

3. Complejos naturales: Muchas preparaciones de composicin indefinida han

sido empleadas para enriquecer los medios de cultivo, tal como: pulpa de
pltano, endospermo de coco, emulsin de pescado, extracto de malta, jugo de
naranja, jugo de tomate, etc.

4. Carbn activado

Sus efectos se pueden resumir as:

- Efecto favorable sobre rizognesis debido al oscurecimiento del medio.

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- Efecto favorable por la absorcin de metabolitos fitotxicos que estaran siendo
liberados al medio de cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados,
hidroxiquinonas, cido-para-hidrobenzico).

- Promueve la embriognesis.

- Adsorcin de etileno que inhibe el crecimiento y la diferenciacin de las

plntulas y protocormos.

- Previene el crecimiento de callo.

- Contribucin de minerales en forma de impurezas la cual estara enriqueciendo

el medio de cultivo.

- Adsorcin de sustancias producidas durante la esterilizacin en el medio de

cultivo, como el hidroximetil-furfural, resultado de la deshidratacin de las hexosas
que afectan el desarrollo y crecimiento de las plntulas.

G. Siembra de semillas
1. Coleccin y Almacenamiento de las Semillas

Las semillas pueden ser colectadas a partir de cpsulas verdes o cpsulas

maduras. Una cpsula verde que est madurando, y est lista para ser sembrada,
se encuentra llena de semillas y no se deforma cuando se la aprieta con las
pinzas, "queda intacta". Las cpsulas pueden ser almacenadas por algunas
semanas si se las envuelve en papel de cocina y si se las coloca en un lugar del
refrigerador con bastante aireacin (como el compartimiento para el queso). No
se debe almacenar las semillas en fundas plsticas ya que las cpsulas sudarn y
se podrirn.

2. Siembra de las Semillas

2.1 Cpsulas verdes vs. semillas secas

Se puede sembrar semillas a partir de cpsulas verdes o a partir de semillas secas.

A continuacin se describen las ventajas y desventajas de ambos mtodos:

a. Siembra a partir de cpsulas verdes

El interior de las cpsulas de orqudeas se mantiene estril si las cpsulas estn

intactas. Entonces, si se esteriliza la parte exterior de las mismas, donde hongos
y bacterias pueden desarrollarse, y se abre las cpsulas bajo condiciones de
esterilizacin las semillas podrn mantenerse desinfectadas. La ventaja de este
mtodo es que no se requiere de la esterilizacin de las semillas, lo que podra
provocar su deterioro. Adems, algunas semillas tomadas de cpsulas casi

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 maduras podran germinar ms rpido que las provenientes de cpsulas
maduras a causa de los mecanismos de dormancia. La desventaja de este
mtodo es que al abrir la cpsula todas las semillas en ella deben ser utilizadas
o eliminadas (algunas semillas maduras podran secarse y ser almacenadas).
Tambin se debe considerar que las semillas sembradas a partir de cpsulas
que no han madurado lo suficiente podran germinar lentamente o
simplemente no germinar.

b. Siembra a partir de semillas secas.

Una vez que la cpsula es abierta, las semillas dejan de ser estriles y requieren de
un proceso de esterilizacin. Comnmente, se utiliza una solucin de hipoclorito
(cloro) de sodio, hipoclorito de calcio o perxido de hidrgeno. Las semillas se
agitan dentro de la solucin que adems contiene una gota de detergente para
humedecerlas, luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el
medio preparado. La ventaja de este mtodo es que las semillas pueden ser
colectadas, secadas al aire, almacenadas por varios meses en el refrigerador y
utilizadas cuando sea necesario.

3. Siembra a partir de cpsulas verdes

El mtodo general para sembrar semillas a partir de cpsulas verdes es el
siguiente:

Con la ayuda de un bistur, remueva cuidadosamente la flor muerta de la

cpsula
Utilice un cepillo de dientes suave para fregar suavemente la cpsula con
la solucin jabonosa.
Enjuague la cpsula en agua.
Introduzca la cpsula por 10 minutos aproximadamente en una solucin de
hipoclorito de sodio al 1% a la que se ha aadido una gota de detergente
(tome en cuenta que el cloro comn es hipoclorito de sodio al 5% por lo
tanto hay que diluir lo necesario).
Transfiera la cpsula sumergida en la solucin de cloro a la cmara de flujo
laminar.
Saque la cpsula de la solucin de cloro usando unas pinzas y tomndola
preferiblemente de lo que queda del peciolo. Luego sumrjala en alcohol
al 100% y psela rpidamente por el fuego (flamear). Deje que el alcohol
se queme completamente y que la cpsula y las pinzas se enfren. Repita el
proceso dos veces para las cpsulas grandes. Para el caso de las cpsulas
pequeas y frgiles decida Usted con discrecin el tiempo de pasarlas por
la llama (tal vez slo una vez). Si no es posible sostenerlas del peciolo,
cambie la posicin de las pinzas antes de flamearlas nuevamente.
Transfiera la cpsula a una superficie desinfectada (como una caja petri
esterilizada). Corte longitudinalmente la cpsula en la mitad con la ayuda

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 de un bistur desinfectado. Utilice una hoja de bistur nueva para cada
cpsula para prevenir la propagacin de virus.
Levante la una mitad de la cpsula con las pinzas y golpela ligeramente
sobre el medio para discernir las semillas.
Repetir este paso hasta que todas las semillas faltantes se utilicen. Las
semillas menos maduras se pueden extraer de la cpsula con las pinzas.
Normalmente se aaden unas gotas de agua en cada frasco de modo
que ciertos grupos de semillas se separen y se distribuyan sobre el agar.

4. Siembra a partir de cpsulas dehiscentes (abiertas con semillas

secas)
Existen diferentes mtodos para la siembra a partir de semillas secas. Todos ellos se
basan en la esterilizacin de las semillas y el lavado en agua destilada antes de
sembrarlas, pero las tcnicas varan. El tiempo de esterilizacin tambin vara
dependiendo de la especie, del tiempo de maduracin luego que la semilla es
colectada, de las condiciones climticas a momento de la coleccin y de los
mtodos de secado y almacenamiento. Por ello, un rango de tiempos de
esterilizacin es recomendado para las nuevas semillas.

H. CUIDADO DE LAS PLNTULAS.

A. Las semillas en los frascos.
Las semillas en la USFQ crecen 40 cm bajo tubos fluorescentes de 20 watts en un
cuarto de crecimiento que est regulado a 18C con 16 horas de luz y 8 horas de
oscuridad. Los frascos recientes deben ser revisados regularmente luego de la
siembra por el riesgo de contaminacin. Si la contaminacin es detectada lo ms
temprano posible, se la puede combatir antes de que se disperse totalmente. Sin
embargo, una vez que el hongo ha producido esporas, o si existe poco lquido en
el fondo del frasco, no es aconsejable combatir dicha contaminacin. En casos
como ste, se debe eliminar el frasco. De manera ocasional, una contaminacin
de hongos podra motivar la germinacin. En este ltimo caso, se puede dejar
que las semillas crezcan, pero deben ser transplantadas antes que el hongo
ocupe su espacio y las destruya. Agua destilada puede ser aadida si los frascos
estn secos, usando una jeringuilla desinfectada. Las pequeas plantas son
transplantadas cuando empiezan a aparecer hojas y empiezan a llenar el frasco.
La excepcin a esta regla se da cuando es ms eficaz remover los protocormos
de un frasco o caja petri contaminada. Las plntulas se transfieren a nuevos
frascos que contienen el medio usando pinzas desinfectadas. El siguiente medio
puede ser el mismo que el primero, pero usualmente es mejor si se aade al
nuevo medio sustancias complejas (como pltano aplastado, leche de coco,
jugo de pia o vitamina B) para fomentar el desarrollo de la raz.

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 B. Transplante
En los frascos las plntulas se han desarrollado en un ambiente cerrado y limpio
por lo que deben acostumbrarse gradualmente al ambiente externo antes de ser
transplantadas a las masetas. En el cuarto de crecimiento, la luz es baja y tanto la
luz como la temperatura son prcticamente constantes. La humedad en los
frascos es alta y las plantas estn protegidas de ataques de hongos, bacterias y
herbvoros. En el medio natural, ambas temperatura y luz varan constantemente.
Las nuevas plantas deben estar protegidas de manera especial de la fuerte luz
solar: incluso una pequea cantidad de luz solar podra quemar las hojas de estas
plantas que usualmente crecen en la sombra. Adems, las plntulas que han
crecido en condiciones de alta humedad tendrn cutculas dbiles por lo que
necesitan acostumbrarse gradualmente a medios ms secos antes de ser
transplantadas. Finalmente, tanto en la fase de aclimatacin como en la de
transplante, las plntulas deben ser cuidadas diariamente para evitar problemas,
y ms que una vez al da si el clima es seco y muy soleado.

4. Materiales y Equipos:
- Capsulas de orqudea (Cattleya)
- Agua
- Detergente
- Lega pura
- Envases de vidrio
- Jabn desinfectante
- Medios de cultivo
- Alcohol
- Mechero
- Tapabocas
- Mandiles
- Cmara de flujo laminar
- Bistur y pinzas

5. Procedimiento:
Remojar las capsulas en detergente por 10 min
Lavar y enjuagar las capsulas
Remojar las capsulas en lega pura por 15 minutos
Llevar las capsulas a la cmara de flujo laminar (previa desinfeccin de las
manos e instrumentos por parte del manipulador)

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 Remojar las capsulas en agua esterilizada (3 veces)
Flamear la capsula para esterilizarla y proceder a cortarla y abrirla
Coger una porcin de semillas con las pinzas y colocarlas dentro del medio
de cultivo
Sellar correctamente el envase y llevarlo al ambiente de incubacin

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 6. Discusiones:
Mediante la germinacin in vitro, se reproducen semillas en frascos de vidrio o
plstico sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azcares y minerales
necesarios para que las semillas germinen y crezcan. Hay dos tipos bsicos de
germinacin in vitro: simbitica y no simbitica. En la germinacin simbitica, las
semillas se siembran con una pequea porcin del hongo micorriza apropiada. El
hongo crece en el medio, coloniza a las semillas en proceso de germinacin y se
origina una relacin simbitica que se espera alimente al protocormo hasta que
ste produzca hojas y se vuelva autotrfico. Esta tcnica es ampliamente usada
para la propagacin de orqudeas terrestres en zonas templadas. Tiene la ventaja
de usar un medio simple (uno de los ms comnmente usados consiste en avena
en polvo con una pequea cantidad de extracto de levadura), y como resultado
las plantas micorrizales suelen ser ms fuertes y resistentes a infecciones que sus
contrapartes cultivadas asimbiticamente. Sin embargo, la desventaja es que se
necesita seleccionar el tipo de hongo micorriza adecuado para que se origine la
simbiosis y prevenir parasitismo y la consecuente muerte de las semillas. Se ha
realizado poca investigacin sobre la relacin del hongo micorriza con las
orqudeas tropicales, y por lo tanto no se dispone del hongo micorriza apropiado.
La germinacin asimbitica es usualmente usada en la propagacin de
orqudeas tropicales, las mismas que tienden a crecer fcilmente en
comparacin con sus parientes en zonas templadas. El medio usado para la
germinacin asimbitica es ms complejo que para la germinacin simbitica, ya
que todos los nutrientes orgnicos e inorgnicos y los azcares deben estar
disponibles para la orqudea en una forma apropiada puesto que ya no existe la
intermediacin del hongo.

7. Conclusiones:
Mediante la germinacin in vitro un mayor nmero de plantas pueden ser
cultivadas en un perodo de tiempo relativamente menor (algunos meses para las
especies ms rpidas). Un grupo de estas semillas germinadas podrn ser
exportadas fcilmente porque las orqudeas cultivadas y mantenidas en frascos
esterilizados estn exentas de las usuales regulaciones CITES referentes a sanidad
vegetal y vida silvestre. Cada cpsula de orqudeas contiene muchos miles de
semillas, lo que significa que se podrn admirar muchas plantas.

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 8. Bibliografa:
Mrgara, J. 1988. Multiplicacin vegetativa y cultivo in vitro. Los meristemos y la
organognesis. Ediciones Mundi Prensa. Madrid

Roca, W. y Mroginski. L. A. 1993. Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos

y Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT. Cali.

Snchez, J. I. 1990. Manual de cultivo de tejidos vegetales y la

micropropagacin. Bogot.

http://turrusta.blogspot.com/2009/05/formulas-para-hacer-el-medio-para-la.html

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