Fardy Daz Microbiologa Ambiental

Laura Vlez FUAC

INFORME 1: PRACTICA 1. ESTERILIZACIN + PRACTICA 2. MORFOLOGIA MICROBIANA Y

MUESTREO DE AMBIENTES Y SUPERFICIES + PRACTICA 7. MICROMYCETOS

RESUMEN

En el laboratorio de microbiologa se realizaron los pasos y se conocieron los requisitos mnimos para
poder esterilizar y operar adecuadamente los implementos de trabajo, en la prctica 1 se conocieron los
mtodos de eliminacin total de las bacterias que contaminan las herramientas de laboratorio durante su
uso como lo son cajas de petri; asas; probetas etc. Tambin se realizo la preparacin de dos tipos de
agar en nuestro caso correspondi el agar Plate Count, utilizado para cultivar bacterias y el agar
saboreaud para cultivar hongos. Una semana despus en el laboratorio de microbiologa se tomaron
muestras de yogur, de la boca de un compaero, tambin se hizo muestreo de superficies en la sede de
ingeniera ambiental, en manos de un compaero y otra al ambiente, por ltimo se sembraron en los
agares saboreau y plate count para cultivar las muestras anteriormente mencionadas. Ahora bien una
semana despus se revisaron las muestras y se hizo el reconocimiento morfolgico de las bacterias
cultivadas de yogur, boca, ambiente, superficie y manos a travs de la tincin de gram y observando en el
microscopio. Finalmente para la prctica siete se analizaron los hongos cultivados en la practica 2 y se
hizo su respectiva identificacin.

Palabras Clave: Esterilizacin, hongos, bacterias agar

ABSTRACT

In the microbiology laboratory were performed the steps and met the minimum requirements to operate
properly sterilized and work tools, in practice the methods met a total elimination of bacteria that
contaminate the laboratory tools for use as are petri dishes, handles, cylinders etc. Also we made the
preparation of two types of agar in our case accounted Plate Count agar, used to grow bacteria and fungi
to grow Saboreaud agar. A week later at the microbiology laboratory yogurt samples were taken from the
mouth of a partner, was also sampled surfaces at the headquarters environmental engineering in the
hands of a partner and the other to atmosphere, and finally planted in the and plate count agars saboreau
to grow the samples above. But a week after the samples were revised and became the morphological
recognition of bacteria cultured yogurt, mouth, atmosphere, surface and hands through Gram staining and
observing under the microscope. Finally, to practice seven cultivated mushrooms were analyzed in
practice 2 and their respective identification was made.

Keywords: Sterilization, fungi, bacteria agar

OBJETIVO GENERAL 6. Aprender a realizar un montaje

microscpico para la observacin de
Realizar prcticas de laboratorio a travs de las hongos unicelulares y pluricelulares.
guas y especificaciones dadas por la profesora 7. Aprender a realizar un microcultivo
de microbiologa. para la observacin de estructuras
fngicas intactas.
OBJETIVOS ESPECFICOS 8. Reconocer las diferentes estructuras
fngicas vegetativas y de reproduccin.
1. Esterilizar los materiales de laboratorio.
2. Cultivar hongos y bacterias a travs de
los agares dados en la prctica.
3. Realizar muestreos para aislar 1.1: Materiales Prctica 1.1: Esterilizacin
microorganismos. 1. Papel Kraft
4. Preparar eficientemente agares para el 2. Horno Elctrico
cultivo de hongos y bacterias. 3. Cajas de petri
5. Identificar las especies de hongos y 4. Pipetas
bacterias encontrados en el laboratorio
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1: Metodologa Prctica 1: Esterilizacin
Se realizo la limpieza del mesn de trabajo con
alcohol, despus se tomaron tiras de papel Kraf
y se envolvieron las pipetas con mucho cuidado
de que quedaran bien empacadas, luego se
envolvieron en grupos de 3 cajas de petri en fila
una encima de otra y se envolvieron,
observamos de que estuvieran bien envueltas,
finalmente el material se marco con los nombres
de los integrantes y se llevo el hasta el horno
elctrico que elimina todo tipo de vida incluidas
las endoesporas a travs de calor seco para
esto se calibro la temperatura del horno a 160
grados centgrados que es la utilizada en la
tcnica de esterilizacin de material de
laboratorio y se cronometro un tiempo de dos
horas para la eliminacin total de
microorganismos que se encontrasen en ese
momento en las cajas de petri y pipetas ya para
finalizar con mucho cuidado se retiro el material
con guantes y se dejo enfriar para su posterior
uso.
1.2 Materiales Practica 1.2 Esterilizacin
medios de cultivo
1. Agua Destilada.
2. Medio de cultivo Standard Plate Count
Agar
3. Medio de cultivo Sabouraud Dextrosa
Agar / Potato Dextrose Agar
(SDA/PDA)
4. Cajas de Petri.
5. Frascos tapa rosca.
6. Cinta indicadora.
7. Balanza.
8. Estufa.
9. Autoclave.
1.2 Metodologa Practica 1.2 Esterilizacin
medios de cultivo
Los medios de cultivo para microorganismos se
venden en forma deshidratada, de modo que su
preparacin implica nicamente mezclarlo con
agua destilada, pesando la cantidad
recomendada por el fabricante.
1. Se pes la cantidad requerida del cultivo
deshidratado de acuerdo a las instrucciones
de la etiqueta.
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2. Se transfiri el polvo a un recipiente de
vidrio resistente al calor se agrego el agua
destilada medida en una probeta.
3. Se calent el medio de cultivo hasta su
ebullicin.
4. En el caso del PDA o SDA adicionar el
cloranfenicol despus de la ebullicin,
inmediatamente antes de ingresar el medio
al autoclave.
5. Se Coloc tapa rosca sin apretar, o papel
aluminio, para esterilizar el medio en
autoclave.
6. Se coloc cinta indicadora sobre la tapa del
recipiente.
PROCESO DE ESTERILIZACION
Con el fin de eliminar todos los microorganismos
contaminantes y obtener el crecimiento
nicamente de los organismos que nos
interesan, los medios de cultivo son sometidos a
un tratamiento trmico conocido como
esterilizacin hmeda por medio de un equipo
conocido como autoclave.
El autoclave es un equipo hermtico que
permite la entrada de vapor de agua a presin.
El uso de calor hmedo permite la muerte de los
microorganismos incluidas las endoesporas
bacterianas. Experimentalmente se ha
determinado que el tiempo requerido para matar
las endoesporas bacterianas es de 10-20
minutos y la temperatura de 1210C, razn por la
cual los autoclaves se han diseado para
alcanzar esta temperatura. El autoclave utiliza la
presin para lograr esta temperatura, siendo la
presin de 15 libras por pulgada cuadrada, la
requerida para lograr 1210C de temperatura.
1.3 Metodologa Practica1.3 Esterilizacin de
cultivos
1. Se coloco un pequeo trozo de cinta
indicadora a cada uno de los elementos a
esterilizar, con el fin de confirmar al final del
ciclo de esterilizacin, que la temperatura
de 1210C fue alcanzada en cada uno de los
materiales esterilizados.
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2. Se introdujeron los elementos en el 7. Agar Plate Count.

autoclave dejando suficiente espacio entre 8. Cajas de petri.
ellos, para permitir un adecuado contacto 9. Gotero.
con el vapor. 10. Yogur

3. El tiempo de esterilizacin de los medios de 2.1 Metodologa

cultivo vienen definidos por el fabricante en
la etiqueta correspondiente, generalmente
es de 10-15 minutos.
4. Una vez cumplido el tiempo de
esterilizacin y nicamente cuando el
indicador de presin marque cero, podemos
abrir el autoclave, dejando la puerta o tapa
entreabierta por 15 minutos.
5. Utilizando alguna proteccin para el calor,
se retiro el medio de cultivo nos permiti
que se enfre ligeramente, al ambiente (No
colocarlo en agua o en una superficie muy
fra).
6. Cuando tenga una temperatura cercana a
los 500C, lo verti en las cajas de Petri,
esterilizadas previamente en el horno, en
una superficie previamente desinfectada y
siempre cerca de la llama.
7. Se marcaron las cajas con las inciales del
medio de cultivo utilizado, en la tapa.
8. Una vez el medio se encuentre a una
temperatura por debajo de 450C, se
solidifica y puede ser utilizado.
9. Si el medio no se ha de utilizar
inmediatamente se guardo en forma
invertida en la nevera.
10. Se tom una caja de cada tipo de medio y
se coloc en la incubadora a 30C como
prueba de esterilidad del medio de cultivo.
11. Se observ las cajas a las 24 horas. Si el
procedimiento ha sido adecuado no debe
aparecer ningn tipo de crecimiento en las
cajas incubadas.
2.1 Materiales Practica 2.1 Morfologa
bacteriana
1. Crystal Violeta.
2. Lugol.
3. Alcohol Acetona.
4. Fuscina.
5. Microscopio.
6. Mechero.
Morfologa Bacteriana
En esta prctica se tomaron muestras del sarro
dental de un compaero de laboratorio, de
yogur natural y contaminacin ambiental
brindada por el laboratorio. Ahora esas
muestras tomadas a travs de un asa metlica y
un algodn se esparcen en una lamina de vidrio,
luego se le aplica una gota de agua y se seca
las muestras con el mechero, ya secas la
muestras se le realiz el proceso de la tincin
de gram que consiste en identificar el tipo
bacterias a travs de una serie de qumicos que
se le aplican en el siguiente orden y tiempo de
exposicin:
Tabla 1: Tincin de Gram
Compuesto Tiempo de
Exposicin
Crystal Violeta 1 Minuto
Se lava la muestra Se lava la muestra
Lugol 1 Minuto
Se lava la muestra Se lava la muestra
Alcohol Acetona 15 30 Segundos
Se lava la muestra Se lava la muestra
Fuscina 1 Minuto
Hay dos tipos de bacterias, gram positivas y
gram negativas. Las bacterias gram positivas se
pueden apreciar en el microscopio de coloracin
morada, las bacterias gram negativas se
pueden mirar en el microscopio de color rosada,
ahora bien esto es porque las bacterias se
componen de peptidoglucano, en las bacterias
gram positivas se determinan que absorben
hasta un 90% de peptidoglucano, mientras que
las bacterias gram negativas absorben un 10%
de peptidoglucano
Despus de que se realiz la tincin de gram las
tres muestras se marcaron y se dejaron secar
para su correspondiente anlisis en el
laboratorio de microscopia, en donde se
determino el tipo de bacteria por su coloracin y
su forma esto con ayuda de bibliografa para
determinar con precisin e identificar el nombre
de las bacterias.
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2.2 Metodologa
Muestreo de Ambientes y Superficies
Se prepar agar para cultivar bacterias y agar
para cultivar hongos, se escogi agar plate
count para aislar las bacterias y agar saboreaud
para cultivar los hongos. El agar Plate count(1)
esta hecho de nutrientes de suplemento de
tryptone, vitaminas de extractos y glucosa que
le dan energa para el crecimiento de las
bacterias, su preparacin normal es 25g del
agar deshidratado en 1 litro de agua destilada,
hervir lentamente y agitar hasta que se disuelva,
esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a
una temperatura de 121 C y finalmente servir
en las cajas de petri. Ahora el agar
Saboreaud(2) se utiliza para cultivar hongos y
levaduras, este agar esta hecho a partir de
muestras de alimentos, derivados de leche y
cosmticos. Algunos procedimientos sealan
bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido
tartrico al 10 %, para inhibir el crecimiento
bacteriano. Su preparacin recomendada es
39g del medio en un litro de agua destilada,
calentar y hervir 1 minuto y esterilizar en el
autoclave a 121 C y dejar enfriar durante 15
minutos a una temperatura de 40 45 C y
servir en las cajas de petri estriles. Las
muestras son tomadas en manos de un
compaero, ambiente y superficies, se hizo
muestreo de superficie el en borde de la
baranda de una escalera, la de ambiente se
hizo al aire libre en un pequeo patio y la de
manos se pas el isopo entre los nudillos y las
uas de las manos de un compaero, se tomo
un tubo de ensayo con agua destilada y se
sumergi la muestra, tambin se hizo lo del tubo
de ensayo con la muestra de superficies.
Despus de hacer esto se realiz el respectivo
cultivo en el agar para bacterias dentro de las
cajas de petri y en el agar de los hongos en la
respectiva caja de petri . Se determino la
temperatura de crecimiento de las bacterias a
37 C, durante 24 48 horas y para los hongos
de 8 dias de incubacin a una temperatura de
25 28 C. En total se hizo esto en 6 cajas de
petri, 3 para hongos y 3 para bacterias. Luego
se realizo el proceso de esterilizacin en una
cmara a travs de un horno que funcionaba
con bombillos halgenos, primero se limpio el
mesn con alcohol, despus se acomodaron las
6 cajas de petri una encima de otra, finalmente
se encendi la cmara y se espero un lapso de
tiempo de 10 minutos para retirar las cajas de
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petri y volver a limpiar el mesn con alcohol, ya
para terminar se dejaron las cajas de petri
marcadas con la fecha, agar y tipo de
muestreo, es decir ambiente, manos y
superficie.
7. Materiales Prctica Micromycetos.
1. Portaobjetos
2. Cuabreobjetos.
3. Asas Micolgicas.
4. Tincin de Azul de Lactofenol
5. Cultivos fngicos.
6. Acido lctico.
7. Solucin estril de glicerina al 5%.
8. Caja de petri con cmara hmeda para
montaje de microcultivo.
9. Bisturs.
10. Alcohol al 70%.
11. Pipetas estriles.
12. Microscopio.
13. Mechero.
7.1 Metodologa Prctica Micromycetos.
Montaje
Se desinfect el mesn de trabajo con alcohol
en concentracin al 70%, Luego se paso el
bistur por el mechero para eliminar
contaminacin y se hizo un corte cuadrado de 1
cm2 en el agar ya preparado de P.D.A para
hongos, el cuadrado de agar cortado se coloc
sobre una lmina de la cmara hmeda y se
paso por el mechero un cubreobjetos y se puso
por encima de la superficie del agar, despus se
aplic 2 ml de solucin estril de glicerina al 5%,
en el fondo de la cmara hmeda , se tom la
muestra de los hongos cultivados desde la
practica 2, se escogi la muestra de ambiente,
se abri la caja de petri del cultivo de hongos de
ambiente cerca del mechero para que no se
contaminara y se realiz la toma de muestra a
travs de un asa previamente flameada en el
mechero, ya con la pequea porcin de muestra
se sembraron 4 puntos en el agar y se le puso
el cubreobjetos, para finalizar la muestra se
incuba en un tiempo de 5 8 das, la caja se
invierte y se marca con los nombres de los
integrantes del grupo, se somete a temperatura
ambiente para su posterior anlisis en el
microscopio.
Observacin de microcultivo
Pasada una semana despus de someter una
muestra ambiente de hongo a la cmara
hmeda se retira el cubreobjetos, ahora bien
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previamente en el laboratorio de microscopia se
aplica una gota de azul de lactofenol a la lamina
de vidrio y graduar el aumento del microscopio a
10x y 40x y se registro las estructuras del
hongo.
Resultados. Practica: 1 Esterilizacin
A la semana de la prctica de esterilizacin
gracias a la accin del papel kraf que protegi el
material de vidrio utilizado, es decir las cajas de
petri y las pipetas del ambiente para que no se
contaminaran, estos permanecieron estriles y
listos para usarse en el laboratorio. Tambin
porque las grandes temperaturas del horno
eliminaron toda forma de vida porque cambia
bruscamente el ambiente de las bacterias e
inhibe que estas puedan generar endoesporas,
al no poder hacer esto entran en un fase de
muerte por falta de nutrientes para su
supervivencia.
Para preparar los agares en el laboratorio de
microbiologa es muy necesario seguir las
indicaciones en la etiqueta de los frascos, ser
muy cuidadosos en aspectos tan fundamentales
en su preparacin como lo son temperatura,
presin, cantidad disuelta, volumen a preparar,
en caso de no encontrar el agar preparado
conseguir la ficha tcnica para su preparacin y
seguir las recomendaciones anteriores. Esto es
importante para el optimo desarrollo de las
bacterias y hongos a cultivar. Resultados
Prctica 7: Micromycetos
Resultados Prctica 7: Micromycetos
Imagen 1: Hongo muestra de manos
Morfologa Macroscpica.
Medio de cultivo: saboreaud manos
Temperatura de incubacin: ambiente
Tiempo de incubacin: 9 febrero 2012 8
marzo 2012
Dimetro de la colonia: 4
Color del anverso de la colonia: gris oscuro
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Color del reverso de la colonia: negro
Presencia de pigmentos difusibles: no
Presencia de plegamientos o surcos: si
Presencia de zonacin: ocupa un gran espacio
Textura: aterciopelada
Imagen 2: Hongo muestra de superficie
Medio de cultivo: saboreaud
Temperatura de incubacin: ambiente
Tiempo de incubacin: 9 febrero 2012 8
marzo 2012
Dimetro de la colonia: 0.7
Color del anverso de la colonia: rosado
Color del reverso de la colonia: anaranjado
Presencia de pigmentos difusibles: no
Presencia de plegamientos o surcos: no
Presencia de zonacin: muy remoto y
pequeo el espacio
Textura: cremosa
Imagen 3: Hongo muestra de ambiente
Medio de cultivo: saboreaud
Temperatura de incubacin: ambiente
Tiempo de incubacin: 9 febrero 2012 8
marzo 2012
Dimetro de la colonia: 5.5
Color del anverso de la colonia: gris claro
Color del reverso de la colonia: negro
Presencia de pigmentos difusibles: no
Presencia de plegamientos o surcos: si
Presencia de zonacin: de la caja de petri
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Textura: algodonoso
Morfologa Microscpica
Imagen 4: Hongo de muestra de manos
Hongo levaduriforme: no
Hongo micelial o filamentoso: si
Hifas cenocticas o aseptadas: cenociticas
Hifas septadas: si
Presenta estructuras de reproduccin:
fragmospora
Presenta cuerpos fructferos: cuerpos
globosos o piriformes que en el interior
contienen conidias: si
Presenta cuerpos fructferos que en el
interior contienen ascos y ascosporas: si
Imagen 5: Hongo muestra de superficie
Hongo levaduriforme: si
Hongo micelial o filamentoso: no
Hifas cenocticas o aseptadas:
Hifas septadas: no
Presenta estructuras de reproduccin:
amerosporas
Presenta cuerpos fructferos: cuerpos
globosos o piriformes que en el interior
contienen conidias: si
Presenta cuerpos fructferos que en el
interior contienen ascos y ascosporas: si
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Imagen 6: de la muestra de ambiente
Hongo levaduriforme: no
Hongo micelial o filamentoso: si
Hifas cenocticas o aseptadas: cenociticas
Hifas septadas: no
Presenta estructuras de reproduccin:
escolespora
Presenta cuerpos fructferos: cuerpos
globosos o piriformes que en el interior
contienen conidias: no
Presenta cuerpos fructferos que en el
interior contienen ascos y ascosporas: si
Discusin de Resultados Prctica de
esterilizacin.
La esterilizacin es el proceso por el que todas
las clulas vivas, esporas viables virus y
viroides son destruidos o eliminados de un
objeto o hbitat. Un objeto esterilizado esta
totalmente libre de microorganismos viables,
esporas y otros agentes infecciosos (Prescott M,
2004),(3)
En el presente trabajo se eliminaron los
microorganismos que pudieran estar presentes
en los implementos de trabajo los cuales son las
cajas de petri y las pipetas a travs del
autoclave permitiendo la inhibicin de
endoesporas de las bateras
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Tabla 2: Experimento terico de destruccin Discusin de Resultados Prctica de

trmica microbiana Micromycetos.
minutos Numero MO Mo Log De
inicial Destruidos sobrevivientes supervivientes
En la mayora de los hongos se presenta
MO en 1 min. formacin de de una estructura externa que
(90% del envuelve las esporas sexuales protegiendolas
total) de las condiciones adversas. Este tipo de
estructutras se denominan, segn el caso,
1 106 9 * 105 105 5 Zigote, Ascocarpo, dando el nombre a los tres
grandes grupos de hongos Zigomycetes,
Ascomycetes y Basidiomycetes (Suarez M,
Muoz J,),(4)
2 105 9 * 104 104 4
De los tres hongos analizados en el laboratorio,
se observ en el microscopio por su morfologa
microscpica que presentan ascosporas con lo
3 104 9 * 103 103 3 cual se deduce que los hongos que se
estudiaron pertenecen al grupo de hongos
conocido con el nombre de Ascomycetes.

Los Ascomycetes protegen las esporas

4 103 9 * 102 102 2 sexuales dentro de un asco o asca. Los
Ascomycetes mas sencillos hacen la
reproduccin dentro de un asco desnudo, tal es
el caso de algunos levaduras como la Candida
5 102 9 * 101 10 1 guillermondii Otros Ascomycetes han adoptado
un proceso de proteccin mas elaborado para
sus esporas :los ascos se envuelven dentro de
un ovillo de hifas que forman el ascocarpo; este
segn su forma y la manera como libera las
101 9 1 0 esporas, recibe diferentes nombres nombres
6 como lo son: peritecio, apotecio y clesitotesio.
(Suarez M, Muoz J,), (4)

7 1 0.9 0.1
Se asume que la muestra inicial contiene 106
microorganismos vegetativos por ml, y el 90%
de los microorganismos se destruyen cada
minuto de exposicin. La temperatura es de 121
C (Prescott M, 2004)(3)
El tiempo que se utiliz para la esterilizacin del
material de laboratorio fue de 15 20 minutos a
la temperatura de 120 C y con la explicacin de
la tabla anterior no cabe duda que se elimin
totalmente microorganismos que se encuentre
en el material de vidrio de laboratorio. El equipo
Usado para esto fue el autoclave.
-1
En la morfologa microscpica de las muestras
de manos (figura 4) se puede establecer que
posee un proceso de proteccin mas elaborado
en sus esporas porque posee hifas septadas,
Tambin la muestra de ambiente(figura 6) se
observo que el hongo microscpicamente posee
hifas no septadas con las miasmas propiedades
de la muestra anterior. Por ultimo la (figura 5)
corresponde a una levadura ya que se observo
que no posee hifas y que su morfologa
microscpica evidencia que tiene crecimiento
radial y textura cremosa caractersticas tpicas
de las levaduras.
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CONCLUSIONES

1. La esterilizacin elimina con eficacia .

los microorganismos y sus esporas
garantizando buen manejo del material
en el laboratorio.

2. Los agares son el hogar de bacterias y

hongos para su ptimo desarrollo en el
laboratorio.

3. Los muestreos dan una informacin

fundamental a la hora de hacer
estudios con microorganismos.

4. Preparar el agar garantiza un ptimo

desarrollo de cultivos de bacterias y
hongos.

5. Con libros y el microscopio podemos

identificar especies de hongos.

6. Con la ayuda de qumicos como el

lactofenol se puede observar hongos a
la perfeccin.

7. Tener cuidado a la hora de realizar

procesos como extraccin de
muestras.

8. Teniendo bibliografa disponible se

puede identificar macroscpicamente y
microscpicamente diversas especies
de hongos.

BIBLIOGRAFA

1. Medicatec, Biokar Diagnostics Rue des

Quarante Mines, consultado el 11 abril de
2012http://www.medicatec.com/arg/?291,%
28bk144ha%29-plate-count-agar-
%28p.c.a.%29-500-grs.

2. Mcdlab, Especificaciones agar dextrosa y

papa, Mxico, consultado el 11 de abril
de2012http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_
dextrosa_papa.pdf.

3. Prescott M, Microbiologa. 5ed. Madrid,

McGraw Hill, 147 -149p.

4. Surez M, Muoz J,. Manual de

fundamentos de Micologa. Universidad
Javeriana, Falcultad de ciencias. 1999. 15
19p.
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