Prctica N1: Tcnicas de Aislamiento de cidos Nucleicos:

Preparacin de muestras

Los cidos nucleicos son polmeros de nucletidos unidos por enlace fosfodister
que almacenan la informacin gentica de los organismos vivos y son los responsables
de la transmisin hereditaria. Existen dos tipos bsicos, el ADN y el ARN. El ADN es un
polmero de desoxirribonucletidos que constituye el material gentico de todos los
seres vivos pues es el componente qumico primario de los cromosomas, el material del
que los genes estn formados.
Quizs de los procedimientos en biologa molecular, el ms bsico es la
purificacin de cidos nucleicos. Por lo tanto se requieren mtodos seguros para la
separacin de estos componentes de las clulas. Para lograr esto, se utilizan diversos
mtodos de extraccin dependiendo del tipo de tejido a emplear, fresco, seco o
congelado.
Objetivos:
1. Comparar e identificar el procedimiento adecuado de preparacin de la muestra
de clulas o tejido para extraccin de ADN.
2. Preparar los reactivos, buffers y materiales necesarios para una adecuada
extraccin de ADN de la muestra establecida.
3. Obtener y preparar las muestras de clulas o tejidos para su homogeneizacin.
Teora:
El primer paso en cualquier protocolo de aislamiento es el rompimiento del
material inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El mtodo utilizado
para romper la clula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor
dao posible al ADN. El mtodo para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las
caractersticas de ste. Para grandes volmenes de tejidos blandos, suelen usarse
licuadoras esencialmente similares a las licuadoras domsticas. Para volmenes
menores, en general es suficiente un MORTERO y un piln. La principal ventaja de este
mtodo es que se adapta bastante bien a tejidos muy diversos
Tejidos ms resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos
mecnicos especiales. Aquellos tejidos con clulas cuya pared celular es resistente, como
por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren tambin condiciones drsticas. En
vegetales, uno de los mtodos ms utilizados consiste en congelar la muestra en
nitrgeno lquido o hielo seco y, mantenindola congelada, pulverizarla con un mortero.
As, adems de desintegrar la muestra, se logra que sta se mantenga a muy baja
temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la accin de enzimas endgenas
que pudieran degradar el material de inters.
 Tambin se puede utilizar la degradacin enzimtica de la pared celular (si est
presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares, as, el uso de enzimas
como la proteinasa K o lisozima es frecuente para extraccin de ADN de bacterias y
arqueas de muestras ambientales.

Materiales y Reactivos:
1. Tris-HCl 1M pH 8
2. EDTA 0.5M
3. SDS 10%
4. NaCl 5M
5. Proteinasa K 20 mg/ml
6. Etanol absoluto
Procedimiento:
1. Realizar los clculos adecuados para preparar los siguientes buffers y soluciones a
partir de las soluciones stock anteriormente citadas en materiales y reactivos:
- 10 ml Buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1 mM)
- 10 ml Buffer High TE (Tris-HCl 25mM, pH 8; EDTA 20 mM)
- 2 ml Buffer Low TE (Tris-HCl 50mM, pH 8; EDTA 1 mM)
- 10 ml Solucin de precipitacin de protenas (Acetato de amonio 10M)
- 5 ml Buffer de lisis para aislar ADN E. coli (High TE; NaCl 0.15 M; SDS 0.2%)
- 30 ml Buffer de lisis para aislar ADN genmico animal (Tris-HCl 100 mM, pH 8;
EDTA 5mM; SDS 0.2% NaCl 200 mM; Proteinasa K 0.1 mg/ml)
- 5 ml Buffer maceracin (Tris-HCl 200mM pH 8; EDTA 25mM; SDS 0.5%; NaCl 0.25
M)
- 10ml Etanol 70%
2. Preparar las soluciones cuidadosamente asegurndose de rotular apropiadamente los
envases que las contengan (Nombre, composicin, fecha, laboratorio)
3. Obtener y pesar las muestras que se usarn en la prctica y prepararlas cortando
cada tejido en pequeos trozos para su homogeneizacin en el mortero.
Cuestionario
1. Explique en qu consiste la sonicacin. En qu tipo de muestras es empleada?
2. Qu consideraciones deben tenerse para extraer ADN de bacterias Gram positivas?
En qu difiere de un protocolo de extraccin de ADN de Gram negativas?
3. Para qu se realiza la incubacin a 55C de una muestra biolgica?
4. Consulte otra tcnica de ruptura de tejido vegetal y explique el fundamento
Bibliografa
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