UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE AGRONOMA
REA TECNOLGICA
SUBREA MANEJO Y MEJORAMIENTO DE PLANTAS
LABORATORIO CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
ING. AGR. Msc. EDGAR FRANCO RIVERA

INFORME DE INVESTIGACIN

Evaluacin de dos tipos de explante foliar (hoja madura e inmadura), para la

formacin de callo en cultivo de Caf (Coffea arabiga).

Jos Asdrubal Tuch Mndez

201408004

Jornada Lunes/Matutina

Guatemala, mayo de 2017

INDICE

Contenido
INTRODUCCION..................................................................................................................................2
JUSTIFICACION...................................................................................................................................2
MARCO TEORICO................................................................................................................................2
MARCO REFERENCIAL........................................................................................................................3
OBJETIVOS..........................................................................................................................................3
General...........................................................................................................................................3
Especficos......................................................................................................................................4
HIPOTESIS...........................................................................................................................................4
METODOLOGIA...................................................................................................................................4
Mtodologa Experimental.............................................................................................................4
Diseo Experimental..................................................................................................................4
Tratamientos..............................................................................................................................4
El tamao de la unidad experimental es de 4 secciones de 1 cm 2 del material vegetal
contenidos dentro 20 ml de medio de cultivo MS en un frasco de compota..............................5
Variables Respuesta....................................................................................................................5
Metodologa de Campo..................................................................................................................5
Metodologa de laboratorio...........................................................................................................5
Preparacin del medio Murashige y Skoog (MS)................................................................5
Reguladores de crecimiento...............................................................................................6
pH.......................................................................................................................................6
Desinfeccin de material vegetal........................................................................................6
Preparacin para la siembra de explantes..........................................................................6
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.......................................................................................................6
RESULTADOS Y DISCUSIN.................................................................................................................7
1. Contaminacin.......................................................................................................................7
2. Formacin de Callo, a partir de frascos no contaminados......................................................8
CONCLUSIONES..................................................................................................................................9
RECOMENDACIONES........................................................................................................................10
BIBLIOGRAFA...................................................................................................................................10
ANEXOS............................................................................................................................................10

INTRODUCCION
La propagacin en vitro de caf es una actividad que se ha venido realizando
desde los aos 70, ya que en aquellas pocas fue cuando surgi por primera vez
los estudios en formacin de callo y embriognesis en cultivo en vitro. Por otra
parte, debido a la contaminacin que sufre los materiales debido al hongo
Hemileia vastatrix, la propagacin por medios sexuales ha sido un problema
durante los ltimos aos.

La utilizacin de tcnicas de cultivo in vitro ha sido una potencial solucin a este

problema. Sin embargo se ha estudiado que existe una relacin en cuanto al tipo
de explante y el nivel de contaminacin del mismo, por lo que la determinacin de
del tipo de explante puede ayudar al aumento en % de formacin de callo en los
diferentes explantes. As tambin, se ha estudiado que existen diferencias en
cuanto al tipo de medio a utilizar pero no son significativas y no se evaluaran en
esta investigacin.

JUSTIFICACION
La importancia en cuanto a la investigacin del tipo de explante a utilizar para la
propagacin in vitro del caf se hace necesario por el aumento de la demanda del
cultivo por medio de estas tcnicas debido a los beneficios que trae. Los
beneficios directos son la obtencin de plantas sanas, esto se obtiene por la
determinacin del tipo de explante a utilizar.

MARCO TEORICO

Tipos de explante foliar e induccin de callognesis

Existen varios tipos de explante para poder generar callos en caf, entre ellos se
pueden generar a partir de meristemos, hojas, races, etc.

Explantes extraidos de meristemos

La propagacin por medio de meristemo, existe un alto porcentaje de
contaminacin, siendo hasta un 85% de contaminacin por bacterias despus de
la siembra de los explantes. Para el caso de hongos se ha determinado que puede
existir hasta un 7% en los primeros 6 das despus de la siembra. La tasa de
multiplicacin por medio de este mtodo es de unos 6.3 brotes por esqueje
utilizado.[ CITATION Loz14 \l 4106 ]

Explantes extrados de hojas.

Existe una relacin directa en cuanto al porcentaje de contaminacin as como de

formacin de callo respecto al tipo de hoja utilizada. Las hojas jvenes son las que
predominan en cuanto a su utilizacin debido a que presentan niveles ms bajos
de contaminacin, y tambin los niveles ms altos en cuanto a la formacin de
callo.[ CITATION Lp10 \l 4106 ]

Las hojas maduras poseen un contenido ms alto de contaminacin y poca

formacin de callo. La cantidad de unidades formadores de colonias de bacterias
es mucho mayor en los tejidos donde existe mayor contenido lignnico.

Influencia del tipo de medio de cultivo utilizado

Se pueden utilizar diferentes tipos de medios para llevar a cabo la propagacin. El

medio Murashige y Skoog (MS), es el ms utilizado. En cuanto a crecimiento no
existe prueba que indique una variacin [ CITATION Lp10 \l 4106 ].

MARCO REFERENCIAL

OBJETIVOS

General
Evaluar dos tipos de explantes extrados de hojas para la formacin de callo
en el cultivo de caf (Coffea arbiga),
Especficos
Determinar el porcentaje de contaminacin del medio de cultivo a los 30
das despus de la siembra
Determinar el porcentaje de formacin de callo a los 30 das despus de la
siembra

HIPOTESIS
De acuerdo a la investigacin previa del tipo de explantes a utilizar, se estable
preliminarmente que el explante extrado de hojas jvenes presentar los mejores
resultados para la propagacin in vitro del caf, siendo superior en mayor
porcentaje de formacin de callo y menor contaminacin

METODOLOGIA

Mtodologa Experimental

Diseo Experimental
Se utiliz un diseo completamente al azar debido a que se estarn utilizando
condiciones controladas en laboratorio. Se establecen 2 tratamientos y 9
repeticiones para un total de 18 unidades experimentales. El modelo estadstico
lineal para este diseo experimental es:

Y ij =+ i + ij

Donde

i=1,2 k tratamientos

j= 1,2 n repeticiones

Yij=Magnitud de la variable respuesta obtenida en la ij-sima unidad experimental

=Media general

ti=Efecto del i-simo tratamiento

Eij= Error aleatorio asociado a la j-sima repeticin en el tratamiento i-simo

Tratamientos
Los tratamientos utilizados fueron dos. El tratamiento 1 fueron hojas jvenes, las
que se estn generando de los nuevos brotes de plantas de caf. El tratamiento 2
fueron las hojas que tengan un grado mayor de maduracin.

Unidad Experimental
El tamao de la unidad experimental es de 4 secciones de 1 cm 2 del material
vegetal contenidos dentro 20 ml de medio de cultivo MS en un frasco de compota

Variables Respuesta
% de Contaminacin: Se evalu la cantidad de unidades experimentales
que ha existido contaminacin respecto al nmero total de unidades
experimentales. Se determin a travs de la frmula

frascos contaminados
Contaminacin= 100
total de unidades expe rimentales /trat

% de formacin de callo: Se evalu de la misma manera que la

contaminacin. A cada tratamiento se le cont las unidades en las cuales ha
existido formacin de callo respecto al total de unidades. La frmula es la
siguiente:

unidad experimental con presencia de callo

Callognesis= 100
total de unidadesexperimentales /trat

Metodologa de Campo
Se recolect las hojas jvenes y maduras de plantas sanas de la plantacin de
caf establecida en el Centro Experimental Docente de Agronoma (CEDA). Se
colocan en bolsas plsticas para su llevado a laboratorio

Metodologa de laboratorio

Preparacin del medio Murashige y Skoog (MS)

La cantidad de unidades experimentales es 19, y se necesitaron 15 ml medio MS

por frasco. Por lo que en total se requiere un volumen de 380. Por cuestiones
prcticas se prepararon 450 ml por la facilidad de los clculos.

Cantidad
agregar
Componente Concentracin
por 450
ml
Macro A 10x 45ml
Macro B 10x 45ml
Macro C 10x 45ml
Fe 50x 9ml
Micro A 100x 4.5ml
 Micro B 100x 4.5ml
Micro C 2000x 0.22ml
Mio 10x 45ml
Vitamina 1000x 0.45ml
Azucar (3%) 13.5 g
Agar (0.6%) 2.7 g

Reguladores de crecimiento.
Se agreg 2,4-D 0.5 mg/l y BAP a razn de 1.12 mg/l.

pH
Se trabaj a un pH de 5.8, de acuerdo a literatura consultada.

Desinfeccin de material vegetal

Se utilizar la solucin de hipoclorito de sodio 0.5% (10% de cloro comercial para
limpieza). Se lavarn los explantes con jabn antibacterial. Se agregarn los
explantes a un beaker de 250 ml y se agregar la solucin de hipoclorito por 10
minutos. En un cmara de flujo laminar se lavarn con agua y utilizando cristalera
esterilizada. Se colocarn en cajas petr previamente esterilizadas.

Preparacin para la siembra de explantes

Se utilizar bistur, pinzas, mecheros, cmara de flujo laminar. Se proceder a
realizar cortes de 1 cm2 en tamao para la siembra de estos en el medio de
cultivo preparado. A cada unidad experimental se le agregarn 4 secciones de 1
cm2.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
FECH
ACTIVIDAD A
Preparacin de medios de cultivos 3-abr
Desinfeccin cristalera 3-abr
Siembra de Explantes 4-abr
Toma de Datos 1-may
Presentacin Informe Final 3-may

RESULTADOS Y DISCUSIN
 1. Contaminacin
Hojas jvenes

3 frascos contaminados
de Contaminacin= 100=33.3
9 frascos totales

% de Contaminacin Hojas jovenes

Contaminado
33.33
No Contaminado
66.66

En el grfico se detallan los resultados obtenidos de la evaluacin en el nivel de

contaminacin de hojas jvenes. Se puede observar que existe una clara
diferencia entre lo contaminado y no contaminado. De los 9 unidades
experimentales 3 sufrieron contaminacin en la lectura despus de los 30 das,
con lo que un 33.3% sufri contaminacin en trminos de porcentaje.

Hojas Maduras

8 frascos contaminados
de Contaminacin= 100=88.8
9 frascos totales

% de Contaminacin Hojas maduras

Contaminado
No Contaminado
En el grfico se puede observar que en lo que respecta a las hojas maduras, estas
sufrieron an mayor contaminacin que las hojas jvenes. Aqu se contaminaron 8
unidades experiementales de 9 colocadas, es decir que existi un 88.8% de
contaminacin. Un 55.5% ms que en parte inmadura.

La contaminacin en induccin de callo y embriognesis viene dado por distintos

factores, los cuales son el estado fisiolgico del explante y de las soluciones
desinfectantes cuando se realiza la siembra, es decir la preparacin del explante
previo a su siembr.

Para el caso de la presente investigacin, se parti del supuesto que las hojas
inmaduras se contaminan menos que las maduras [ CITATION Lp10 \l 4106 ].
Esto es debido a la cantidad de ceras presentes en la cutcula foliar que
impermeabilizan los tejidos maduros, entonces una hoja madura, no permitir la
penetracin del agente desinfectante, siendo hipoclorito de sodio al 10% en este
caso. Y as se pudo observar en los resultados que reflejan que existi mayor
contaminacin en las hojas maduras.

2. Formacin de Callo, a partir de frascos no contaminados

Hojas jvenes

6 frascos con callo

de Callo= 100=100
6 frascos totales

Formacin de callo hojas jvenes %

Callo
No callo

En el grfico se observa que se logr el desarrollo de callo embriognico en los

explantes de hoja de caf. Se tomaron en cuenta nicamente las unidades
experimentales que no se contaminaron, es decir que de 6 frascos no
contaminados, todos ellos presentaron formacin de callo.
Hojas maduras

0 frascos con callo

de Callo= 100=0
1 frascos totales

Formacin de callo en hojas maduras %

Callo
No callo

En el grfico se observa que no existi formacin de callo en las unidades

experimentales de hoja madura. De 1 unidad experimental que no se contamino,
esta al trmino de 30 das no present formacin de callo visible.

Para la formacin de callo en las hojas jvenes e inmaduras, la cantidad de

unidades experimentales fue muy poca para la evaluacin de callo, por lo que un
aumento en el nmero de unidades experimentales tomando en cuenta la
contaminacin que ocurri hubiese sido mejor para la confiabilidad de los
resultados. En el caso de formacin de callo en hoja madura, no se puede concluir
que no existe formacin de callo en hoja madura debido a que se tom en cuenta
partir de 1 sola unidad experimental, por lo que un existo de esta ltima hubiese
significado 100% de formacin y un fracaso el 0%, existe demasiada variacin, por
lo que el aumento en las unidades experimentales hubiese sido una mayor
confiabilidad de datos.

CONCLUSIONES
1. La contaminacin en tejidos inmaduros provenientes de hojas jvenes y
tejidos maduros provenientes de hojas de avanzada edad, se diferenci
claramente debido a que existi una contaminacin del 33.3% para el caso
del tejido foliar joven y el 88.8% para los tejidos maduros. Se concluye que
los resultados estn influenciados por el contenido de ceras presenten en la
cutcula que no permiten la penetracin de la solucin de desinfectante.

2. Se determin la formacin de callo en los tejidos jvenes y los maduros el

cual presentaron una formacin de 100% para lo joven y 0% para la hoja
 madura, sin embargo debido a la cantidad de unidades experimentales que
se tomaron en cuenta, la confiabilidad de los resultados es muy baja.

RECOMENDACIONES
Se recomienda para futuras investigaciones respecto a la formacin de
callo en hojas de caf, se utilicen un nmero mnimo de 20 unidades
experimentales por tratamiento debido a que la contaminacin que se
presenta es alta especialmente en tejidos maduros.

BIBLIOGRAFA

1. Lpez Gmez, P., Donjuan, L. I., Castellanos Jurez, M., Mndez Lpez, I.,
Sandoval Esquivez, A., Aguirre Medina, J., y otros. (15 de julio de 2010).
Influencia del explante y medio de cultivo en la embriognesis somtica de
hojas de caf. Revista fitotecnia mexicana, 33(3).

2. Lozano Kretzchmar, G. A. (2014). Propagacin in vitro de caf (Coffea

arabica) - variedad Lempira - a partir de meristemos. Tesis de grado,
Universidad Zamarano, Tegucigalpa.

ANEXOS

Ilustracin 1 Siembra de explantes

Ilustracin 2 Finalizacin de la Siembra

Ilustracin 3 Unidad Experimental de hoja madura contaminada