EVALUACION FITOQUIMICA Y COMPARACION DEL EFECTO HIPOGLUCEMIANTE DE EXTRACTOS ACUOSOS DE Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle, Gentianella nitida, Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius en Rattus rattus

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
ESCUELA DE POSTGRADO
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS
EVALUACION FITOQUIMICA Y COMPARACION DEL EFECTO HIPOGLUCEMIANTE

DE EXTRACTOS ACUOSOS DE Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle,
Gentianella nitida, Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius en Rattus
rattus
TESIS
PARA OPTAR EL GRADO ACADEMICO DE
DOCTORA EN CIENCIAS BIOMEDICAS
AUTORA: Ms. LUDISLEYDIS BERMUDEZ DIAZ
ASESOR: Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA
TRUJILLO - PERU
2015
Nro. de Registro:__________
1
INDICE
RESUMEN...................................................................................................................... 6
ABSTRACT ..................................................................................................................... 7
I. INTRODUCCION .......................................................................................................... 9
1. Problema................................................................................................................. 16
2. Hiptesis ................................................................................................................. 16
II. MATERIALES Y METODOS ........................................................................................ 17
1. Objeto de Estudio .................................................................................................... 17
III. RESULTADOS .......................................................................................................... 29
IV. DISCUSION ............................................................................................................. 62
V. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 68
VI. RECOMENDACIONES............................................................................................... 70
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .............................................................................. 71
VIII. ANEXOS................................................................................................................ 75
2
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificacin de los principales hipoglucemiantes ....................................... 10
Tabla 2. Conformacin de los grupos de experimentacin y dosis administradas

en el presente estudio ................................................................................................24
Tabla 3. Tabla resumen de los parmetros de rendimiento del material vegetal...... 31
Tabla 4. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin diclorometnica (fraccin 1) de

los extractos obtenidos a partir de cada material vegetal ......................................... 33
Tabla 5. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin etanlica (fraccin 2) de los

extractos obtenidos a partir de cada material vegetal............................................... 33
Tabla 6. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin acuosa (fraccin 3) de los

extractos obtenidos a partir de cada material vegetal. .............................................. 36
Tabla 7. Cromatografa en capa fina de las diferentes fracciones obtenidas a partir

de los extractos acuosos de las especies vegetales en estudio. ................................. 38
Tabla 8. Prueba de homogeneidad de varianzas en los primeros trece das de

tratamiento y del 14 al 21 da de tratamiento a 06 horas de aplicado el
tratamiento en cada grupo de experimentacin........................................................34
Tabla 9. Prueba Tukey-b de comparacin de medias en los primeros trece das de

experimentacin a 06 horas de aplicado el tratamiento en cada grupo de
experimentacin. ........................................................................................................ 43
Tabla 10. Prueba Tukey-b de comparacin de medias del 14 al 21 da de

experimentacin. ........................................................................................................ 44
3
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fotografa de la cromatografa en capa delgada realizada a las diferentes

fracciones obtenidas a partir de los extractos acuosos de las especies vegetales en
estudio con el sistema de solventes BAW. Las flechas indican la posicin de las manchas
fluorescentes al observarse con luz UV. ................................................................................. 40
Figura 2. Comportamiento de glucemia promedio (mg/dl) en los primeros 13 das de

experimentacin a 06 horas de aplicado los tratamientos a los diferentes grupos............... 45
Figura 3. Comportamiento de glucemia promedio (mg/dl) del da 14 al 21 da de

experimentacin, a las 06 horas de aplicado los tratamientos en los diferentes grupos de
experimentacin. .................................................................................................................... 46
Figura 4. Macroscopa de pncreas de Rattus rattus perteneciente al grupo de animales

de experimentacin sanos control negativo. ......................................................................... 47

de experimentacin diabticos que fueron tratados con glibenclamida. .............................. 48

de experimentacin diabticos que fueron tratados con G. nitida........................................ 49

de experimentacin diabticos que fueron tratados con G. chamuchui. .............................. 50

de experimentacin diabticos que fueron tratados con S. sonchifolius............................... 51

de experimentacin diabticos que fueron tratados con G. bicolor. ..................................... 52

de experimentacin diabticos que no recibieron ningn tratamiento. ............................... 53
Figura 11. Microfotografa de corte histolgico de pncreas de Rattus rattus

perteneciente al grupo de experimentacin sano (grupo 01) a los 21 das de
4
experimentacin. De izquierda a derecha se muestran los cortes histolgicos de cola,
cuerpo y cabeza del pncreas, con un aumento de 450X. ..................................................... 55
Figura 12. Microfotografa de corte histolgico de pncreas de Rattus rattus

perteneciente al grupo de experimentacin que recibi el tratamiento con Glibenclamida
(grupo 02) a los 21 das de experimentacin. De izquierda a derecha se muestran los
cortes histolgicos de cola, cuerpo y cabeza del pncreas, con un aumento de 450X. ......... 56
Figura 13. Microfotografa de cortes histolgicos de pncreas de Rattus rattus

perteneciente al grupo de experimentacin que recibi el tratamiento con G.nitida
cortes histolgicos de cola, cuerpo y cabeza del pncreas, con un aumento de 450X. ......... 57

perteneciente al grupo de experimentacin que recibi el tratamiento con G. chamuchui
cortes histolgicos de cola, cuerpo y cabeza del pncreas, con un aumento de 450X .......... 58
Figura 15. Microfotografa de cortes histolgicos de Rattus rattus perteneciente al grupo

de experimentacin que recibi tratamiento con S.sonchifolius (grupo 05) a los 21 das de
experimentacin. De izquierda a derecha se muestran los cortes histolgicos de cola,
cuerpo y cabeza del pncreas, con un aumento de 450X ...................................................... 59

perteneciente al grupo de experimentacin que recibi tratamiento con G. bicolor (grupo
06) a los 21 das de experimentacin. De izquierda a derecha se muestran los cortes
histolgicos de cola, cuerpo y cabeza del pncreas, con un aumento de 450X ..................... 60
Figura 17. Microfotografa de cortes histolgicos de Rattus rattus perteneciente al grupo

de experimentacin tratado con STZ que no recibi ningn tratamiento (grupo 07) a los
21 das de experimentacin. De izquierda a derecha se muestran los cortes histolgicos
de cola, cuerpo y cabeza del pncreas, con un aumento de 450X ......................................... 61
5
RESUMEN
La medicina tradicional peruana ha empleado desde tiempos remotos a especies

de la familia Gentianaceae, as como al Smallanthus sonchifolius para el
tratamiento de Diabetes Mellitus. El objetivo de este trabajo fue comparar el
efecto hipoglucemiante de extractos acuosos de Gentianella bicolor, Gentianella
nitida, Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius en Rattus rattus. Se
conformaron 07 grupos de experimentacin de 07 animales cada uno; el grupo
01 estuvo conformado por animales sanos y el resto de los grupos por animales
con diabetes inducida por administracin de Estreptozotocina (60 mg/kg, i.p). Un
grupo de ratas diabticas fue tomado como control positivo, otro grupo recibi
10 mg/Kg de peso de glibenclamida y al resto de los grupos se le administr una
dosis diaria de 500 mg/kg de peso de extracto acuoso de Gentianella bicolor,
Gentianella ntida, Gentianella chamuchui, Smallanthus sonchifolius
respectivamente, durante 21 das. Los primeros 13 das no se observ
disminucin estadsticamente significativa de las glucemias de los animales de
experimentacin despus de la administracin de los extractos de las plantas en
ninguno de los grupos de experimentacin. A partir del da 14, se observ una
disminucin de la glucemia estadsticamente significativa en los grupos a los que
se le administr extractos de plantas de la especie Gentianella, obtenindose una
disminucin alrededor del 40% con la administracin del extracto acuoso de
Gentianella bicolor. No se observ una disminucin significativa de la glucemia
con la administracin del extracto acuoso de Smallanthus sonchifolius. En este
trabajo se corrobor el efecto hipoglucemiante de las especies de Gentianella,
observndose un efecto hipoglucemiante a largo plazo que pudiera deberse a la
regeneracin de las clulas beta del pncreas.
Palabras claves: Diabetes mellitus, Gentianella bicolor, Gentianella nitida,

Gentianella chamuchui, Smallanthus sonchifolius, efecto hipoglucemiante.
6
ABSTRACT
Peruvian traditional medicine has been used since ancient times to family
Gentianaceae species well as the Smallanthus sonchifolius for the treatment of
Diabetes Mellitus. The aim of this study is to compare the hypoglycaemic effect
of aqueous extracts obtained from Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex JS
Pringle, Gentianella nitida, Gentianella chamuchui and Smallanthus sonchifolius in
Rattus rattus. Rats were divided into seven experimental groups (healthy rats as a
control group, untreated STZ-diabetic (60 mg/kg B.W., IP), treated STZ-diabetic
with aqueous extract of Gentianella bicolor (500 mg/kg B.W.), treated STZ-
diabetic with aqueous extract of Gentianella nitida (500 mg/kg B.W.), treated
STZ-diabetic with aqueous extract of Gentianella chamuchui (500 mg/kg B.W.),
treated STZ-diabetic with aqueous extract of Smallanthus sonchifolius (500 mg/kg
B.W.) and treated STZ-diabetic with glibenclamide (10 mg /kg B.W.). All groups
were evaluated for 21 days. During the first 13 days, the blood glucose levels not
decreased significantly in any group of experimentation. From day 14, the blood
glucose levels was reduced significantly when there are compared with the
control group. In treated STZ-diabetic with aqueous extract of Gentianella bicolor
group the blood glucose levels was reduced about 40% after administration of
the extract. The hypoglycaemic effect of Gentianaceae family species used in the
study was confirmed, showing a long-term blood glucose decrease effect that
could be due to the regeneration of the pancreas beta cells, while the same effect
was not observed with the administration of the aqueous extract of Smallanthus
sonchifolius.
Keywords: Diabetes mellitus, Gentianella bicolor, Gentianella nitida, Gentianella

chamuchui, Smallanthus sonchifolius, hypoglycaemic effect.
7
8
I. INTRODUCCION
La Diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad endocrino-metablico-vascular

crnica, gentica, causada por un defecto absoluto o relativo de la produccin
y/o liberacin de la insulina efectiva que se produce en el pncreas o por un
aumento en la secrecin de las hormonas hiperglucemiantes: glucagn,
adrenalina y los glucocorticoides, provocando una alteracin en el metabolismo
de los carbohidratos, protenas y lpidos, lo cual se traduce a la larga por un
aumento de la glucosa en sangre y orina, y de los niveles de lpidos en la sangre
(1,2).
Segn datos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), se estima que para el

ao 2025 el 5,4 % de la poblacin mundial padecer Diabetes Mellitus,
reportndose 171 millones de personas con esta enfermedad en el 2000, cifra
que alcanzar los 336 millones de enfermos para el ao 2030, siendo
Latinoamrica el tercer lugar con mayor prevalencia en esta enfermedad (3).
Los pacientes que presentan esta enfermedad se clasifican clnicamente en

diferentes grupos: la mayora pertenecen al grupo de Diabetes Mellitus tipo 1 o al
grupo de Diabetes Mellitus tipo 2 (1).
En la actualidad, existen principalmente dos tipos de tratamientos para la

Diabetes Mellitus, uno consiste en la administracin subcutnea de insulina, el
cual es generalmente utilizado por los pacientes que presentan DM tipo 1. El otro
consiste en el uso de hipoglucemiantes orales, los cuales son compuestos que se
clasifican de diversas formas. Una de las ms aceptadas se basa en el tipo de
estructura qumica que presentan tal como se muestra en la Tabla 1 (4).
9
Tabla 1. Clasificacin de los principales hipoglucemiantes
La Glibenclamida es un medicamento hipoglucemiante oral de la clase de las

sulfonilureas que se utiliza en el tratamiento de la Diabetes mellitus tipo 2. La
glibenclamida bloquea los canales de potasio dependientes de ATP que hay en las
membranas de las clulas pancreticas beta, provocando despolarizacin,
entrada de calcio y liberacin de insulina (5). La glibenclamida disminuye adems
10
la glucogenlisis heptica y la gluconeognesis. Para marzo del ao 2007, este
frmaco era uno de dos hipoglucemiantes orales incluidos en la Lista de
Medicamentos Esenciales de la OMS (6).
La medicina tradicional ofrece una alternativa para el tratamiento de

padecimientos como la DM en los que actualmente son utilizados una gran
variedad de plantas y derivados de estas como el aguacate, ajo, t verde, goma
guar, espirulina, plantas pertenecientes a la familia de las leguminaceae,
curcubitaceae, dioscoreaceae, entre otras (7-9).
En los ltimos aos se han patentado algunos compuestos a partir de plantas

medicinales a los que se les ha demostrado su efecto hipoglucemiante entre los
que se encuentran: terpenoides tipo quinonas (10), sesquiterpenoides
(furanoeremophilano y eremophilanolido). Alcaloides tales como cryptolepina y
quindolina (11) y triterpenoides (12). Adems se han patentado flavonoides
glicosidados (13), polifenoles (14) y una protena con actividad antidiabtica (15).
A muchos de estos compuestos no se les ha podido establecer an sus
mecanismos de accin, ya que son molculas complejas.
A pesar de que, el uso de plantas como terapia complementaria y alternativa a

diversos padecimientos, representa una prctica comn y cotidiana con
antecedentes milenarios a nivel mundial, en muchos casos no se ha profundizado
lo suficiente en el conocimiento de las mismas, ni se han aislado y caracterizado
las molculas responsables de dichas acciones beneficiosas, ya que la mayora de
estos tratamientos alternativos no cuentan con un estudio clnico y toxicolgico
que respalden su uso (16).
En el Per existen diferentes tipos de plantas que son conocidas y empleadas

desde los antiguos peruanos para tratar la Diabetes Mellitus. Dentro de estas
plantas destaca la familia Gentianaceae, la cual est representada con alrededor
de 15 gneros y aproximadamente de 170 especies repartidas mayormente en
11
hierbas y arbustos, dentro de las cuales existen algunas especies endmicas del
Per (17-19).
Las especies de la familia Gentianaceae como la Gentianella umbellata y

Gentianella gramnea, presentan fitoconstituyentes como flavonoides, peptinas,
saponinas, triterpenos a los que se les atribuye el efecto hipoglucemiante (20,21).
A estas especies se les atribuye una serie de usos medicinales por los principios
amargos que todas ellas poseen. Las gentianellas son ricas en azcares: di y
trisacridos, gencianosa y genciobiosa adems de sacarosa respectivamente, que
en un proceso de hidrlisis parcial se convierten en glucosa y fructosa, esta ltima
es utilizada por los diabticos como alimento y puede ser beneficiosa en la
acidosis diabtica (21,22).
La Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle, conocida comnmente como:

corpus huay, campanilla, shashacuma, campanilla morada, es una planta
que crece entre los 3000 y 4500 m.s.n.m., que se ha reportado en la regin de La
Libertad y Cajamarca en Per y tambin en Bolivia (19). Es una planta descrita
botnicamente como hierba bianual, perenne, de hasta 60 cm de altura, de raz
leosa, raras veces arbustiva. Hojas casi siempre opuestas, de bordes enteros,
cortamente pecioladas, lanceoladas, acuminadas, las basales linera-rosuladas.
Flores solitarias o dispuestas en cimas paucifloras axilares o terminales,
tetrmeras o pentmeras, hermafroditas, actinomorfas. Cliz tubuloso
gamospalo, corola gamoptala, azules o moradas, blanco lilceas o blanco
moradas. Fruto cpsula bivalvar con numerosas semillas.
El corpus huay es conocido desde los antiguos peruanos, entre sus usos
etnomedicinales destacan su empleo como antianmico, antidiabtico,
antipirtico, purificador de la sangre y para trastornos hepticos (18). Tambin se
le ha reportado efecto hipocolesterolmico (20) y se ha empleado en el
tratamiento de la gastritis, artritis, diabetes y reumatismo (21,22).
12
Se ha logrado aislar de la planta secoiridoides, xantonas, sesquiterpenoides y
flavonoides de especial inters para el desarrollo de fitofrmacos (20).
La Gentianella ntida, conocida comnmente como hercampuri, es una especie

endmica del Per que se ha reportado entre los 3500 y 4500 m.s.n.m. en las
regiones de La Libertad, Junn y Hunuco. Es una hierba cespitosa, formando
rosetas, conocida de varias localidades como humedales. En el centro del Per se
puede encontrar desde la Cuenca de Santa Cruz en Hunuco hasta la Cuenca del
Apurmac en Huancavelica (19).
Desde los tiempos de Imperio Incaico, el hercampuri ha sido utilizado para aliviar
dolores estomacales y combatir las fiebres producidas por el paludismo. El
extracto acuoso de la planta entera ha sido empleado dentro de la etnomedicina
peruana como un remedio para las afecciones hepticas, vesiculares y
pancreticas, como colagogo y digestivo, para el tratamiento de la obesidad por
su accin hipocolesterolmica y adems es utilizada como regulador del
metabolismo (23,24), antidiabtica, diurtica, y para prevenir la formacin de los
clculos biliares (19,24,25).
Por otra parte se ha demostrado que el extracto etanlico de G. nitida posee

principalmente actividad antifngica, siendo los microorganismos ms
susceptibles: Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum
gypseum (26).
Dentro de sus componentes qumicos se encuentran sustancias amargas de tipo

glucosdicas, como eritaurina (sustancia amarga de tipo glucosdica),
amarogencina y genciopicrina, eritrocentaurina, genciopicrsidos (lactonas
insaturadas), alcaloides, saponinas, taninos, resinas, hemicelulosa y minerales;
asimismo, aceites voltiles, azcares, muclagos, cido gencinico, terpenoides y
entre ellos los monoterpenos del pentano-secoiridoides (secologansido,
13
amarosverina, amarogentina) y sesterpenoides (alborosin). Adems la presencia
de sales de aluminio, calcio, potasio, magnesio, sodio y cloro (27-29).
La Gentianella chamuchui, es una planta endmica del Per, conocida

comnmente como chamochui, chinchimali, genciana, lirambo,
hapallashakoc, corpus hui macho, shalcadino, que se ha reportado entre
los 3000 y 4500 m.s.n.m. dese el sur de Cajamarca hasta el norte de Ancach (19).
Es una hierba anual o perenne, tpica de ambientes paramunos, de 20 hasta 60
cm de altura, de raz leosa, tpica, pivotante, y fusiformes. Tallos cilndricos con
nudos y entrenudos perfectamente diferenciados. Hojas de dos tipos: las basales
dispuestas en rosetas, ssiles, connadas en la base, lanceoladas, ovales, de
bordes enteros, cortamente pecioladas, las caulinares numerosas, opuestas,
lanceoladas, ovales, de bordes enteros, cortamente pecioladas, las caulinares
numerosas, opuestas, lanceoladas cuneiformes. Flores dispuestas en umbelas
paucifloras, pentmeras, hermafroditas, actinomorfas, pedunculadas, terminales
o axiales de 2-3 cm de longitud. Entre sus usos etnomedicinales destacan su
accin antidiabtica, antipaldica, colagoga, contra enfermedades nerviosas,
digestivas, emanagoga, febrfuga, hepatoprotectora, purificadora de la sangre y
tnica (20).
Entre las plantas empleadas por la medicina folclrica del Per para el
tratamiento de la Diabetes Mellitus, destaca el empleo de la especie Smallanthus
sonchifolius, del gnero Asteraceae, comnmente conocida en el Per como
llacn, yacn, jacn, aricoma, Yacuma, planta que se desarrolla entre los
50 y 3000 m.s.n.m. en la regin andina de todos los departamentos del Per. Es
una hierba o sufrtice perenne que presenta races tuberosas, fusiformes,
jugosas y dulces que pueden pesar hasta 2 Kg cada una. La planta puede alcanzar
hasta 2,9 m de alto (18). Es un alimento funcional debido a la gran cantidad de
oligofructanos de reserva, que es un sustituto del azcar natural, con un valor
considerable para los diabticos. Efectivo antidiabtico por su activa potencia
14
hipoglucmica y adems reduce los niveles de colesterol y triglicridos (30,31).
Tambin se utiliza contra el raquitismo y como antioxidante por contener 122 %
ms actividad antioxidante que la vitamina C (32,33).
Basados en los antecedentes de que muchas plantas del Per poseen actividades
potencialmente teraputicas contra la Diabetes Mellitus, las cuales, en algunos
casos, pudieran deberse a la presencia de metabolitos primarios y/o secundarios
de inters teraputico, que la medicina tradicional peruana ha empleado desde
tiempos remotos a especies de la familia Gentianaceae para el tratamiento de
Diabetes Mellitus, as como al Smallanthus sonchifolius, en este trabajo se
realizar el estudio fitoqumico y la comparacin del efecto hipoglucemiante de
extractos a partir de Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle,
Gentianella ntida, Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius en Rattus
rattus. Adems se realizar un estudio antomo-patolgico de los pncreas de los
animales correspondientes a cada grupo de experimentacin en estudio para
determinar las condiciones de los mismos al finalizar el estudio. Una vez
comprobada la actividad hipoglucemiante de los extractos acuosos de las plantas
incluidas en el estudio, se podrn iniciar nuevas investigaciones para identificar
los principios activos responsables de dicha actividad.
15
1. Problema
Tendrn efecto hipoglucemiante en Rattus rattus los extractos acuosos
obtenidos a partir de las especies Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S.
Pringle, Gentianella ntida, Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius de
forma semejante a la glibenclamida?
2. Hiptesis
Los extractos acuosos obtenidos a partir de las especies Gentianella bicolor
(Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle, Gentianella ntida, Gentianllela chamuchui y
Smallanthus sonchifolius tienen actividad hipoglucemiante semejante a la
glibenclamida en Rattus rattus.
16
II. MATERIALES Y METODOS
1. Objeto de Estudio
1.1 Objetivo General
Comparar el efecto hipoglucemiante de extractos acuosos de Gentianella bicolor

(Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle, Gentianella nitida, Gentianella chamuchui y
Smallanthus sonchifolius con la glibenclamida en Rattus rattus.
1.2 Objetivos Especficos
1. Colectar, identificar y establecer una materia prima con calidad a partir de las
especies Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle, Gentianella ntida,
Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius.
2. Preparar extractos acuosos dosificados que permitan las evaluaciones

biolgicas como hipoglucemiante de las cuatro especies vegetales seleccionadas.
3. Evaluar la posible actividad hipoglucemiante de los extractos acuosos de las

especies Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle, Gentianella ntida,
Gentianella chamuchui, Smallanthus sonchifolius y compararlo con el efecto de la
glibenclamida.
4. Realizar el anlisis histopatolgico de los pncreas de los animales que forman

parte de cada grupo de experimentacin.
17
2. Materiales
2.1. Material Vegetal
Se recolectaron las plantas Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle

Corpus Huay y Gentianella chamuchui Genciana, las cuales fueron
identificadas y depositadas en el Herbarium Truxillense de la Universidad
Nacional de Trujillo (UNT). La Gentianella nitida Hercampuri fue adquirida a
travs de un poblador de las alturas de Huancavelica y fue examinada e
identificada por el botnico Jos Mostacero, quien tambin identific la raz de
Smallanthus sonchifolius Yacn empleada en este estudio.
2.2. Animales de experimentacin
Los animales de experimentacin que se utilizaron en este estudio fueron de la

especie Rattus rattus, cepa Sprague Downley, procedentes del Bioterio de la
Universidad Peruana Cayetano Heredia, con la certificacin de salud
correspondiente (Anexo 1).
2.3. Materiales generales
La enzima Streptozotocina que se utiliz en la experimentacin fue de la marca

Sigma Aldrich (USA), lote #SLBH0076V.
18
El equipo para medir los niveles de glucosa en sangre fue un glucmetro marca
ACCU-CHEK Active de Roche (Alemania), que emplea tiras reactivas ACCU-CHEK
especficas para dicho glucmetro.
Equipos y Reactivos usuales para el trabajo de laboratorio de acuerdo a lo

descrito en los procedimientos.
3. Mtodos
3.1. Mtodos fitoqumicos
3.1.1. Recoleccin y procesamiento inicial del material vegetal
Los ejemplares seleccionados de cada especie en estudio, fueron recolectados y

separados de forma manual. Las hojas y ramas utilizando tijeras de corte. Debido
a la lejana del lugar de recoleccin de las especies, todo el material vegetal
empleado, a excepcin de la raz de S. sonchifolius, se sec a la sombra y
posteriormente una vez recibido en el laboratorio se complet el secado en
estufa con aire recirculado a temperatura inferior a los 50 C. En el caso del S.
sonchifolius, se emple la raz fresca para la elaboracin del extracto acuoso, por
lo que se adquiri justo antes de la preparacin del mismo.
19
3.1.2. Descripcin micromorfolgica y macromorfolgica del
material vegetal
Se emplearon mtodos fsico qumicos para la determinacin de los parmetros

de calidad de la droga, describiendo a simple vista la forma, el color, tamao,
superficie y textura superficiales de la planta entre otros. Adems, con el empleo
del microscopio, se observaron las caractersticas ms importantes de las clulas
vegetales y de su contenido, segn los Mtodos de Control de Calidad de Drogas
Vegetales establecidos por la OMS (34).
3.1.3. Condiciones de secado del material vegetal
El material vegetal fue secado a la sombra y en estufa con temperatura

controlada de 40C con recirculacin de aire, siguiendo el proceso por la prdida
en peso del material que se somete a la evaluacin y el tiempo necesario para
obtener un peso aproximadamente constante para dicha prdida de peso.
Para el secado en la estufa, la droga se coloc esparcida directamente en

bandejas esmaltadas cubiertas con papel Kraft y fueron removidas cada cierto
tiempo. El punto exacto del secado se determin segn la friabilidad y fractura de
las partes vegetales. Las plantas secadas finalmente se trituraron y pasaron por
un tamiz con poros de 0,2 mm de dimetro antes de ser almacenadas en bolsas
de nylon cerradas a temperatura ambiente hasta el momento de su
procesamiento (35). Con el objetivo de determinar la prdida de humedad de las
especies vegetales, las mismas fueron pesadas antes y despus de ser sometidas
al proceso de secado.
20
3.1.4. Preparacin de extractos acuosos a partir de cada material
vegetal en estudio
Todo el material vegetal recolectado, secado y triturado, de forma independiente

fue colocado en un matraz con tapa hermtica, se mezcl en proporcin 1:3 con
agua destilada y se dej reposar por 24 horas. Al da siguiente se calent a 50-60
oC durante 15 minutos y se filtr. A continuacin se aadi ms agua destilada al
material vegetal en la misma proporcin del da anterior, se calent por 15
minutos a 50-60 oC y se filtr, repitindose el proceso una vez ms. El filtrado
resultante se concentr con vapor de agua hasta sequedad. El residuo se guard
en refrigeracin a 4C hasta su redisolucin para las evaluaciones biolgicas (35).
3.1.5. Fraccionamiento y purificacin de los componentes

presentes en los extractos acuosos obtenidos a partir de cada
material vegetal
Para el fraccionamiento se emple 5g de extracto acuoso seco total y se

realizaron extracciones por el mtodo de maceracin con diferentes solventes,
calentando el extracto al final de cada extraccin, antes de filtrar (34,35):
Extraccin Disolventes Tiempo de extraccin
1 Diclorometano 24 hrs
2 Etanol 24 hrs
3 Agua 12 hrs
21
Las fracciones se concentraron por destilacin y se analizaron sus igualdades o
diferencias por cromatografa en placa delgada, segn se describe ms adelante.
3.1.6. Tamizaje fitoqumico de las fracciones obtenidas a partir de

los extractos acuosos de cada especie vegetal en est udio
Para evaluar la posible composicin qumica de las plantas que se estudian en el

presente trabajo, se efectu el tamizaje fitoqumico a las fracciones que se
obtuvieron segn metodologa descrita en el acpite 6.2.1.5, siguiendo la
metodologa descrita por Miranda M. y Cuellar A. (35).
3.1.7. Cromatografa en capa delgada de las fracciones obtenidas

a partir de los extractos acuosos de cada material vegetal en
estudio
Como tcnica de anlisis cualitativo se utiliz la cromatografa en capa delgada

(TLC) con placas pre- elaboradas de slice gel G F-254 sobre soporte de aluminio
(Merk, Alemania).
Se trabajaron con los siguientes disolventes/sistemas de corrimiento:
A- Metanol: Hexano (1:1)
B- Metanol/Acetona (1:1)
C- BAW (n-Butanol: cido actico glacial: Agua) (4:1:5)
Las cmaras se ambientaron con estos disolventes durante 15 minutos antes de

realizar las correspondientes corridas. Las placas se secaron al aire sometindose
22
luego al proceso de revelado con luz UV para la deteccin de los componentes
presentes.
3.2. Determinacin de la respuesta hipoglucemiante de los

extractos acuosos de las especies seleccionadas.
Se realiz el ensayo de induccin de hiperglucemia con la administracin de una

dosis de 60 mg/kg de Estreptozotocina (STZ) (SIGMA, USA) va intra peritoneal
(i.p.), en ratas adultas, sanas, con un peso entre 20010 g, mantenidas 24 horas
en ayuno. La STZ se disolvi en una solucin amortiguadora de citrato de sodio
0,1M (pH 4,5) que se prepar justo antes de ser administrada. El grupo Control
recibi una inyeccin i.p. de 2 mL/Kg de solucin amortiguadora de citrato de
sodio (0,1M; pH 4,5).
Los animales se mantuvieron 7 das antes, y durante el ensayo (28 das en total),
con pienso de la misma composicin y agua ad libitum, a una temperatura de
204oC, un foto-perodo de 12 horas, y una humedad relativa de 505%.
Condiciones de alojamiento y alimentacin segn lo establecido. Se conformaron
siete (07) grupos de experimentacin de 07 animales cada uno, tal como se
describe en la Tabla 2.
23
Tabla 2. Conformacin de los grupos de experimentacin y dosis administradas en el
presente estudio
Grupos Dosis empleadas
Control Control negativo (no diabtico) tratado con agua destilada.
Control positivo tratado con STZ 60 mg/Kg va i.p. (dosis nica)

STZ
No recibieron ningn tratamiento.
Tratado con STZ 60 mg/Kg va i.p. (dosis nica)

STZ + ext. Acuoso
de G. bicolor Extracto acuoso (500 mg/Kg), una administracin oral diaria durante
21 das.

STZ + ext. Acuoso
de G.nitida Extracto acuoso (500 mg/Kg), una administracin oral diaria durante
21 das.

STZ + ext. Acuoso
de G.chamuchui Extracto acuoso (500 mg/Kg), una administracin oral diaria durante
21 das.

STZ + ext. Acuoso
de S.sonchifolius Extracto acuoso (500 mg/Kg), una administracin oral diaria durante
21 das.

STZ +
glibenclamida 10mg/Kg de glibenclamida disuelto en 1mL de suero fisiolgico, una
administracin oral diaria durante 21 das.
24
Transcurridas 48 horas se procedi a la determinacin de las concentraciones de
glucosa en sangre para lo cual se les realiz una pequea incisin en la punta de
la cola para la toma de las muestras de sangre. Las muestras fueron colocadas en
el glucmetro para realizar las mediciones correspondientes. Las ratas cuyo valor
de concentracin de glucosa en sangre estuvieron por encima de 250 mg/dL,
fueron seleccionadas y se dividieron en grupos de 07 animales para la
administracin de los extractos acuosos correspondientes y de la glibenclamida,
adems del grupo control hiperglucmico que no recibi ningn tratamiento.
La administracin de los extractos acuosos y de la glibenclamida se realiz en

todos los casos utilizando cnulas intragstricas de 0,7mm.
Para determinar los niveles de glucosa en sangre se colectaron las muestras por
incisin en la cola de los animales de experimentacin a las: 03, 06 y 24 horas
despus de la administracin oral de los extractos de cada planta y de la
glibenclamida.
3.3. Extraccin y fijacin de los pncreas de los animales de

experimentacin
A los 21 das de experimentacin se sacrificaron 02 animales de cada grupo de

experimentacin, los que fueron seleccionados al azar, con la finalidad de extraer
los pncreas y hacer un anlisis antomo-patolgico y determinar el efecto sobre
las clulas del tratamiento aplicado en cada grupo de experimentacin. Luego
del sacrificio de las ratas seleccionadas, se procedi a la diseccin de las mismas y
a la extraccin de todo el sistema digestivo junto con el pncreas para la fijacin
en una solucin de formaldehido al 10%, pH=7,6, segn procedimiento reportado
en estudio anterior (37). Al da siguiente se procedi a la separacin de los
25
pncreas del resto de los rganos en fijacin y se colocaron en recipientes con
nueva solucin fijadora para garantizar un adecuado proceso de fijacin.
3.4. Cortes histolgicos de los pncreas de los animales de

experimentacin
Una vez finalizado el proceso de fijacin, se procedi al lavado de los

especmenes y se realiz una deshidratacin creciente con alcohol etlico de los
pncreas a analizar histolgicamente. Posteriormente se sumergieron los
especmenes en xilol durante 4 horas antes de ser sumergidos en una solucin de
Histosec a 56C por un perodo de 4 horas segn procedimiento descrito
previamente (37). Una vez finalizada la etapa de penetracin del Histosec, se
procedi a la etapa de inclusin definitiva o formacin del bloque en la cual se
llev a cabo el vertimiento de Histosec fundido a una temperatura de 60-65C en
moldes de metal y luego se colocaron los especmenes orientados
apropiadamente. Despus de 30 minutos, se solidificaron los bloques y se
recortaron en forma de pirmide cuadrangular truncada antes de realizar los
cortes de cada especmen en secciones de 06 micrmetros. Se realizaron varios
cortes de la cabeza, cuerpo y cola del pncreas de cada animal seleccionado para
el estudio histolgico.
Para garantizar que el espcimen qued adherido durante el procesamiento

ulterior, la superficie de los portaobjetos fueron recubiertos previamente con
glicerina y albmina de Jelly antes de colocar las secciones cortadas. Una vez que
el agua se evapor y habiendo quedado extendida la seccin en el portaobjetos,
se procedi a un secado exhaustivo de los mismos en estufa a 40C durante toda
la noche, quedando de esta manera listos para el procedimiento de coloracin.
26
3.5. Coloracin de los cortes histolgicos de los especmenes
mediante el mtodo de Hematoxilina de Harris y Floxina B
Se escogi el mtodo de Hematoxilina de Harris - Floxina B porque se obtienen

imgenes de las clulas del de pncreas ms ntidas y brillantes que con la
tincin de Hematoxilina-Eosina.
En tal sentido, se incluyeron los portaobjetos en xilol I durante 5 minutos y luego

en xilol II durante otros 5 minutos con el objetivo de desparafinar los
especmenes. A continuacin se realiz el proceso de hidratacin empleando
alcohol etlico al 96% durante 5 minutos y agua destilada durante otros 5
minutos. Luego se realiz la coloracin con hematoxilina de Harris durante 2
minutos. Se lav el exceso de colorante con agua corriente durante 5 minutos, se
aadi solucin diferenciadora durante 5 segundos y se realiz otro lavado con
agua corriente durante otros 5 minutos. A continuacin se realiz la coloracin de
los especmenes con Floxina B durante 5 minutos y luego se aadi alcohol etlico
al 80% por unos segundos antes de pasar al proceso de deshidratacin. Se realiz
el proceso de deshidratacin en 2 pasos: primero se procedi a tres baos con
alcohol etlico de 96%, de 5 minutos de duracin cada uno y luego se realizaron
tres baos ms con etanol absoluto, de 5 minutos ms cada uno. Por ltimo, se
procedi a diafanizar los especmenes realizando tres baos en xilol de 5 minutos
cada uno antes de proceder al montaje definitivo en blsamo del Canad (37).
27
3.6 Observacin y anlisis histopatolgico del pncreas de los
animales de experimentacin
Una vez terminado el proceso de coloracin, se procedi a la observacin de

todos los cortes histolgicos realizados de la cabeza, cuerpo y cola de los
pncreas de los animales seleccionados, empleando un microscopio ptico marca
Carl Zeiss (Alemania), con aumentos de 65X, 200X y 450X. A continuacin se
realizaron las microfotografas correspondientes empleando una cmara de alta
resolucin marca Carl Zeiss (Alemania).
3.7 Procesamiento estadstico
Para el procesamiento estadstico de los datos se calcularon diferentes

parmetros descriptivos para las variables analizadas (media y desviacin
estndar).
Para comparar los grupos de trabajo en una variable en cuestin se utiliz un

Anova de clasificacin simple, seguido de una prueba de comparacin mltiple
(Tukey-b). Para las transformaciones que cumplen con los supuestos de
normalidad y homogeneidad de varianza se emple el estadstico de Levene.
Los datos fueron procesados con el paquete estadstico Statistica versin 5.01
para Windows.
28
III. RESULTADOS
1. Recoleccin y procesamiento inicial del material vegetal
Todas las especies vegetales fueron recolectadas y procesadas segn se describi

en el acpite 6.2.1.1. La Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle Corpus
Huay fue recolectada en las alturas de Quiruvilca, Santiago de Chuco,
Departamento de La Libertad a 3500 m.s.n.m, en la maana del 22 de agosto del
2013. La Gentianella chamuchui Genciana fue recolectada en las alturas de
Cajamarca a 3100 m.sn.m, en la maana del 28 de agosto del 2013. Ambos
especmenes fueron correctamente identificados y depositados en el Herbarium
Truxilense de la Universidad Nacional de Trujillo (UNT) con los cdigos de
herbario: HUT-57361 y HUT-57360 respectivamente. La Gentianella nitida
Hercampuri fue adquirida a travs de un poblador de las alturas de
Huancavelica el 16 de agosto del 2013 y fue examinada y correctamente
identificada por el botnico Jos Mostacero, quien tambin identific la raz de
Smallanthus sonchifolius Yacn que se emple en este estudio, la cual fue
adquirida el 25 de agosto del 2013 en el Mercado Palermo de la Ciudad de
Trujillo.
2. Descripcin micromorfolgica y macromorfolgica del

material vegetal
La descripcin micromorfolgica y macromorfolgica de cada especie vegetal

coincidi con lo reportado por Mostacero y cols. para dichas especies (19), con lo
29
cual se garantiz que el material vegetal recolectado perteneca a las especies
que se requeran analizar en este estudio.
3. Condiciones de secado del material vegetal
Las condiciones de secado establecidas fueron las adecuadas para las especies
vegetales, ya que se logr un correcto secado de las mismas, lo cual permiti
conservar la calidad necesaria de las drogas para los procedimientos posteriores.
Se recolect 165 gramos de G. bicolor, de los cuales quedaron 90,7 gramos al
finalizar el proceso de secado, perdindose el 45% del peso en forma de agua. En
el caso del G. nitida, se recolectaron 80,1 gramos de material fresco de los cuales
quedaron 78 gramos al finalizar el proceso de secado, perdindose el 2,6% del
peso inicial en forma de agua. Por otra parte, se recolectaron 150 gramos de G.
chamuchui, de los cuales quedaron 148,1 gramos al final del proceso de secado,
perdindose el 1,27% en forma de agua. En el caso de la raz de S. sonchifolius, se
parti de 640 gramos de fruto fresco, de los cuales el 92% del peso se perdi en
forma de vapor de agua (Tabla 3).
4. Preparacin de extractos acuosos a partir de cada material

vegetal en estudio
Se prepararon los extractos acuosos de cada especie vegetal, secados segn el

procedimiento descrito el acpite 7.1.3. Se parti de 78 gramos de G.nitida,
obtenindose 26 gramos de extracto acuoso seco para un 33,3% de rendimiento.
En el caso de G. chamuchui se parti de 141,6 gramos de muestra, obtenindose
23,6 gramos de extracto acuoso seco, lo que representa un rendimiento del
30
16,64%. Para preparar el extracto acuoso de G. bicolor se parti de 90,7 gramos
de muestra, obtenindose 35,2 gramos de extracto acuoso seco, lo cual
representa un rendimiento del 38,8%. En el caso de la raz de S. sonchifolius se
parti de 640 gramos y se obtuvieron 52 gramos de extracto acuoso seco, lo que
representa un rendimiento del 8,1 %. El resumen de los parmetros de
rendimiento del material vegetal se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3. Tabla resumen de los parmetros de rendimiento del material vegetal
Parmetros/Sp. G. bicolor G. chamuchui G. nitida S. sonchifolius
Peso planta fresca 165 gr 160.8 gr 96 gr 640 gr*
Peso planta seca 90,7 gr 141.8 gr 78 gr -
Prdida en peso
Durante el secado 5 gr 19 gr 18 gr 95 %*
Slidos totales o
sustancias solubles 35.2 gr 23.6 gr 26 gr 52 gr
Rendimiento 38.8 % 16.64 % 33.3 % 8.1 %
*En el caso del Smallanthus sonchifolius se emple la raz
31
5. Fraccionamiento y purificacin de los componentes
presentes en cada extracto acuoso obtenido a partir de cada
material vegetal
Con el objetivo de evaluar los metabolitos secundarios presentes en los extractos

acuosos obtenidos a partir de cada especie vegetal, se procedi al
fraccionamiento de los componentes presentes en los mismos. Se prepararon
tres fracciones: la fraccin que contena los componentes solubles en
diclorometano (fraccin 1), la fraccin que contena los componentes solubles en
etanol al 95% (fraccin 2) y la fraccin que contena los componentes solubles en
agua (fraccin 3) (Tabla 7).
6. Tamizaje fitoqumico de las tres fracciones obtenidas a

partir de los extractos acuosos de cada especie vegetal en
estudio
Para determinar la presencia o ausencia de metabolitos secundarios, se efectu

el tamizaje fitoqumico a las fracciones obtenidas a partir de los extractos acuosos
secos de cada especie vegetal, siguiendo la metodologa descrita por Miranda M.
y Cuellar (35). A la fraccin diclorometnica (fraccin 1), obtenida a partir de los
extractos de cada planta en estudio, se le realizaron los ensayos estndares para
determinar la composicin cualitativa de los mismos. Tal como se muestra en la
Tabla 4, todas de las evaluaciones realizadas dieron negativas a la presencia de
quinonas y positivas a la presencia de triterpenos y esteroides, a excepcin de la
fraccin obtenida a partir del S. sonchifolius que dio negativa.
32
Tabla 4. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin diclorometnica (fraccin 1) de los
extractos obtenidos a partir de cada material vegetal
Ensayo/Sp. Vegetal G. bicolor G. Chamuchui G. nitida S. sonchifolius
Borntrager (quinonas) - - - -
Lieberman
-Burchard +- +- +- -
(triterpenos, esteroides)
A la fraccin etanlica (fraccin 2) preparadas a partir de los extractos de cada

especie vegetal, se le realizaron los ensayos estndares para este tipo de fraccin
tal como se muestra en la Tabla 5. Todas las fracciones etanlicas resultaron
positivas a la presencia de fenoles y taninos, antocianidinas, azcares reductores
y aminocidos.
33
Tabla 5. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin etanlica (Fraccin 2) de los extractos
obtenidos a partir de cada material vegetal
Shinoda (flavonoides) ++ ++ ++ -
FeCl3 (fenoles y taninos) ++ ++ ++ -+
Lieberman-Burchard
(triterpenos, esteroides) - - - -
Antocianidinas +++ ++ + +
Ninhidrina (aminocidos) + ++ + ++
Borntrager (quinonas) + - ++ +
Resinas - - ++ -
Fehling (A. reductores ) + ++ + ++
Dragendorff (alcaloides) - - - -
Mayer (alcaloides) - - - -
Wagner (alcaloides) - - - -
Catequinas + + + -
Baljet (lactonas) + + + -
34
Por otra parte, todas las fracciones etanlicas resultaron negativas a la presencia
de alcaloides, triterpenos y esteroides. Adems, slo las fracciones etanlicas de
los extractos preparados a partir de las especies de Gentianellas resultaron
positivos a la presencia de flavonoides, catequinas y lactonas. La fraccin
etanlica obtenida a partir de G. nitida result positiva a la presencia de resinas,
mientras que se observ la presencia de quinonas en todas las fracciones
etanlicas excepto en la fraccin preparada a partir de G. chamuchui.
Tambin se le realiz la marcha fitoqumica a la fraccin acuosa (fraccin 3)

preparada a partir del extracto de cada especie vegetal. Tal como se muestra en
la Tabla 6, todas las fracciones acuosas resultaron positivas a la presencia de
antocianinas, azcares reductores, taninos y fenoles, mientras que todas
resultaron negativas a la presencia de alcaloides y saponinas. Por otra parte, slo
las fracciones acuosas preparadas a partir de extractos de las especies de
Gentianella resultaron positivas a la presencia de flavonoides.
35
Tabla 6. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin acuosa (fraccin 3) de los extractos
obtenidos a partir de cada material vegetal.
Shinoda (flavonoides) +++ + ++ -
FeCl3 (taninos y fenoles) +++ + ++ -+
Antocianidinas + + + +
Fehling (A. reductores) ++ ++ ++ ++
Dragendorff (alcaloides) - - - -
Mayer (alcaloides) - - - -
Wagner (alcaloides) - - - -
Espuma (saponinas) - - - -
36
7. Cromatografas en capa delgada realizadas a las fracciones
obtenidas a partir de los extractos acuosos de cada material
vegetal en estudio
Se utilizaron placas pre-elaboradas de slica gel G F-254 sobre soporte de

aluminio (Merk, Alemania) para realizar las cromatografas en capa fina (TLC). Se
emplearon los disolventes/sistemas de corrimiento descritos en el acpite
6.2.1.7.
Para calcular el valor de referencia (Rf) para cada mancha observada en los
cromatogramas resultantes, primeramente se midi el corrimiento total de la
cromatografa desde la aplicacin de la muestra hasta el frente del solvente de
corrimiento, que en todos los casos estuvo alrededor de 7,5 cm. Luego se midi la
distancia desde la aplicacin de la muestra hasta el centro de cada mancha por
separado y se dividi entre el corrimiento total de la cromatografa. Los
resultados de las cromatografas en capa fina de las diferentes fracciones
obtenidas a partir de los extractos acuosos de las especies vegetales en estudio
se muestran en la Tabla 7.
Con todos los disolventes/sistemas de corrimiento se observ una mayor

cantidad de manchas en los cromatogramas correspondientes a las fracciones
obtenidas de los extractos de plantas de las especies de Gentianella en estudio
que en las fracciones obtenidas de S. sonchifolius. Por otra parte, se observ una
mayor cantidad de manchas en los cromatogramas cuando se emple el sistema
BAW (n-butanol: cido actico glacial: agua) en la proporcin 4.1:5 (Tabla 7),
pudindose observar incluso manchas que solo fueron visibles con luz UV y que
no se observaron cuando se emplearon los otros sistemas de corrimiento. Dichas
manchas fluorescentes se resaltan en la Figura 1.
37
Tabla 7. Cromatografa en capa fina de las diferentes fracciones obtenidas a partir de los
extractos acuosos de las especies vegetales en estudio.
Nro. de bandas y RF*obtenidas con cada solvente/sistema de corrimiento en los

cromatogramas realizados.
Sistema Fraccin G. ch G. bi G.ni S. so
1 (DCM) 0,81 0,74 0,81 0
2 (EtOH) 0,11 0,11 0,65 0,6

Metanol/Hexano (1:1)
0,64 0,66 0,79
0,68 0,76
3 (H2O) 0,12 0,12 0,2 0,55
0,66 0,68 0,75
0.75 0,77
1 (DCM) 0,76 0,71 0,71 0
0,83 0,77 0,8

Metanol/Acetona (1:1)
2 (EtOH) 0,07 0,08 0,07 0
0,49 0,59 0,51
0,66 0,66 0,62
0,79 0,79 0,68
0,79
3 (H2O) 0,11 0,1 0,13 0,1
38
0,56 0,6 0,64 0,47
0,79 0,77 0,77
1 0,67+ 0,34+ 0,73+ 0
(DCM)
0,76 0,53+ 0,85
0,74
2 0,38 0,34 0,38 0,34+
(EtOH)
0,52+ 0,53+ 0,66+
0,68 0,68 0,81+

BAW (4:1:5)
0,76+ 0,77+ 0,95
0,93 0,95
3 (H2O) 0,29 0,27 0,27 0,24+
0,49+ 0,45+ 0,53
0,67 0,57 0,69+
0,73+ 0,63+
0,93 0,93
Leyenda:
G. bi: G. bicolor; G. ch: G. chamuchui; G.ni: G. nitida; S.so: S. sonchifolius
*
Frente de corrida
+
Rf de manchas que slo fueron visibles con luz UV.
Fraccin 1 (DCM): Fraccin diclorometnica
Fraccin 2 (EtOH): Fraccin etanlica
Fraccin 3 (H2O): Fraccin acuosa
39
Figura 1. Fotografa de la cromatografa en capa delgada realizada a las diferentes fracciones
obtenidas a partir de los extractos acuosos de las especies vegetales en estudio con el sistema de
solventes BAW. Las flechas indican la posicin de las manchas fluorescentes al observarse con luz
UV.
40
8. Determinacin de la respuesta hipoglucemiante de los
extractos acuosos obtenidos a partir de las especies
seleccionadas
Se realiz el estudio de la respuesta hipoglucemiante segn lo descrito en acpite

3.2. Durante los primeros 13 das no se observ disminucin significativa de las
glicemias de los animales de experimentacin despus de la administracin de los
extractos de las plantas en ninguno de los grupos de experimentacin. El da 14
del estudio se observ una disminucin de la glucemia en los grupos a los que se
le administraron extractos de plantas de la especie Gentianella, al igual que en los
animales a los que se les administr la Glibenclamida que se mantuvo hasta el da
21 que termin la experimentacin. Dentro de los animales del grupo de
experimentacin a los que se le administr S. sonchifolius no se observ gran
variacin de sus glicemias y la mitad de los animales murieron antes de finalizar el
estudio.
A continuacin se detalla el anlisis estadstico de los datos de glucemia durante

todo el experimento.
Se realizaron comparaciones entre los grupos de experimentacin a los cuales se

les aplic los diferentes tratamientos utilizando diseos completamente
aleatorizados y mediante el anlisis de varianza, en las dos etapas del
experimento: los primeros trece das de tratamiento, donde no se observ
diferencias en los niveles de glucemia de los animales de experimentacin, y del
14 al 21 da de tratamiento, donde se observaron diferencias en las glucemias
promedios de los animales que sobrevivieron en los diferentes grupos.
41
El ANOVA que se aplic fue de una sola va sin interacciones en el tiempo de
aplicacin 06 horas despus de aplicado cada tratamiento, puesto que a las 06
horas fue cuando se observ la mayor variacin de los niveles de glucemia a
partir del da 14 hasta el da 21 de experimentacin. La Tabla 8 muestra que no
hay homogeneidad de varianzas en los diferentes grupos en los primeros trece
das de tratamiento (p<0.05) y del 14 al 21 da de tratamiento (p=0.05) s hay
homogeneidad de varianzas a las 06 horas de aplicado el tratamiento en cada
grupo de animales de experimentacin sobrevivientes.
Tabla 8. Prueba de homogeneidad de varianzas en los primeros trece das de tratamiento

y del 14 al 21 da de tratamiento a 06 horas de aplicado el tratamiento en cada grupo de
experimentacion.
Prueba de homogeneidad de varianzas

Estadstico de Levene gl1 gl2 Sig.
A 06h
(1 a 13 das) 6.47 6 35 0.000
A 06h
(14 a 21 das) 2.57 6 35 0.05
Se realiz la prueba de Tukey-b de comparacin de medias para determinar cul

fue el grupo que present mayor diferencia promedio respecto a los dems. En la
Tabla 9 se muestran los resultados de la prueba de Tukey-b de comparacin de
medias de los grupos durante los primeros 13 das de tratamiento, donde se
evidencia que el grupo control negativo es el que difiere de los otros grupos de
experimentacin; observndose subconjuntos homogneos, lo cual significa que
no hay diferencias significativas entre los grupos de experimentacin
conformados por ratas diabticas en los primeros trece das de experimentacin.
42
Tabla 9. Prueba Tukey-b de comparacin de medias en los primeros trece das de
experimentacin.
Prueba Tukey-B a 6h (1 a 13 das)

Subconjunto para alfa = .05
GRUPOS N 1 2
Control negativo (sano) 7 115.34
Diabticas + G. nitida 7 430.71
Diabticas sin tratamiento 7 434.51
Diabticas + Glibenclamida 6 436.47
Diabticas + G.bicolor 6 437.57
Diabticas + G. chamuchui 5 443.76
Diabticas + S.sonchifolius 4 449.05
La Tabla 10 se muestran los resultados de la prueba de Tukey-b de comparacin

de medias del da 14 al 21 de experimentacin, donde se evidencia que el grupo
control negativo difiere de los otros grupos de ratas diabticas y adems se
observa que los grupos que fueron tratados con G. bicolor, G. chamuchui, G.
ntida y Glibenclamida forman un grupo homogneo y los grupos que fueron
tratados con G. chamuchui, Glibenclamida, G. nitida, S. sonchifolius y el grupo que
no recibi ningn tratamiento forman otro grupo homogneo, diferencindose
de stos el grupo que recibi el tratamiento con G. bicolor. Al observar los
subconjuntos homogneos de la Tabla 10 y sus respectivos promedios, se puede
concluir que el grupo tratado con G. bicolor fue el que present el promedio ms
bajo (341.86 mg/dl) de glucemia y que se diferencia estadsticamente del resto de
los grupos, evidencindose que es el tratamiento que provoca el mayor efecto
hipoglucemiante respecto al resto, ya que con este tratamiento se logr una
disminucin de la glucemia alrededor del 40 %.
43
Tabla 10. Prueba Tukey-b de comparacin de medias del 14 al 21 da de experimentacin a
06 horas de aplicado el tratamiento en cada grupo de experimentacin.
Prueba Tukey-B a 6h (14 a 21 das)

Subconjunto para alfa = .05
GRUPOS N 1 2 3
Control negativo (sano) 7 101
Diabticas + G. bicolor 6 341.89
Diabticas + G.
chamuchui 5 380.27 380.27
Diabeticas +
Glibenclamida 6 398.06 398.06
Diabticas + G. nitida 7 414.52 414.52
Diabticas sin
tratamiento 7 426.62
Diabticas + S.
sonchifolius 4 458.17
En la Figura 2 se muestra la homogeneidad de los grupos de ratas diabticas y la

diferencia promedio del grupo control negativo respecto al resto de los grupos
de experimentacin a las 06 horas despus de aplicar los tratamientos
respectivos a cada grupo de experimentacin durante los primeros 13 das de
experimentacin.
44
Figura 2. Comportamiento de glucemia promedio (mg/dl) en los primeros 13 das de
experimentacin a 06 horas de aplicado los tratamientos a los diferentes grupos.
En la Figura 3 se muestran las diferencias promedios entre los grupos de

experimentacin del da 14 al 21 de experimentacin a 06 horas despus de
aplicar los tratamientos respectivos en cada grupo, observndose claramente que
el grupo que fue tratado con el extracto obtenido a partir de G. bicolor (Corpus
Huay) evidencia el mayor efecto hipoglucmico respecto a los dems.
45
Figura 3. Comportamiento de glucemia promedio (mg/dl) del da 14 al 21 da de
experimentacin, a las 06 horas de aplicado los tratamientos en los diferentes grupos de
experimentacin.
En conclusin, se observ una diferencia promedio significativa entre los grupos

de experimentacin a las 06 horas despus de administrar los tratamientos
respectivos a partir del 14 al 21 da de experimentacin, demostrndose
estadsticamente que el tratamiento que produce mayor efecto hipoglucemiante
es el tratamiento con extracto acuoso obtenido a partir de G. bicolor, con el cual
se obtuvo la mayor disminucin de los niveles de glucosa en la sangre alrededor
del 40 %, incluso mayor que con el tratamiento con Glibenclamida.
46
9. Macroscopa de los pncreas de animales pertenecientes a
cada grupo de experimentacin
Se les aisl el pncreas junto con el resto de las vsceras anexas a los animales
sacrificados pertenecientes a cada grupo de experimentacin, el da 21 de
experimentacin tal como se muestra en las Figuras de la 4 a la 10:
Figura 4. Macroscopa de pncreas de Rattus rattus perteneciente al grupo de animales de

experimentacin sanos control negativo.
47
experimentacin diabticos que fueron tratados con glibenclamida.
48
experimentacin diabticos que fueron tratados con G. nitida.
49
experimentacin diabticos que fueron tratados con G. chamuchui.
50
experimentacin diabticos que fueron tratados con S. sonchifolius.
51
experimentacin diabticos que fueron tratados con G. bicolor.
52
de experimentacin diabticos que no recibieron ningn tratamiento.
Como se puede observar en las figuras anteriores, el pncreas de los animales

sacrificados no mostr signos de deterioro, o dao, lo cual tampoco se observ
en el resto de los rganos anexos.
Posteriormente a la extraccin de los rganos se procedi a la fijacin de los

mismos en una solucin de formaldehdo, tal como se describi en el acpite 3.3.
53
10. Anlisis histopatolgico de los cortes de pncreas de
animales de experimentacin
Se realizaron los cortes histolgicos de pncreas y la coloracin respectiva de los

mismos con Hematoxilina de Harris y Floxina B segn el procedimiento descrito
en los acpites 3.4 y 3.5. Con este procedimiento se logr una tincin color azul
oscuro-violeta en los ncleos y de distintos tonos de rojo en el citoplasma de las
clulas de los islotes de Langerhans del pncreas.
A continuacin se muestran las imgenes de los cortes histolgicos realizados, as

como el anlisis histopatolgico del pncreas, tanto de la regin cabeza, cuerpo
como de cola del pncreas de los animales seleccionados por cada grupo de
experimentacin. En la Figura 11 se muestran los cortes histolgicos de pncreas
realizado a de un animal de experimentacin sano (grupo 01 de
experimentacin). El espcimen est dividido en lbulos, lobulillos y por tabiques
conectivos y constituido por numerosos acinos glandulares casi iguales entre s.
Se observa un tejido pancretico conservado con los acinos glandulares bien
formados En el corte aparecen como formaciones redondeadas o alargadas cuyas
clulas piramidales y oscuras, con ncleos redondeados y basales, delimitan una
luz estrecha o virtual. Es posible determinar la existencia de clulas que se sitan
en el centro entre ellos y la luz del acino, correspondientes a las clulas
centroacinosas. Los islotes de Langerhans estn formados por cordones celulares
que se anastomosan y en conjunto forman una red entre cuyas mallas se
encuentran numerosos capilares sanguneos.
54
Figura 11. Microfotografa de corte histolgico de pncreas de Rattus rattus perteneciente al
grupo de experimentacin sano (grupo 01) a los 21 das de experimentacin. De izquierda a
derecha se muestran los cortes histolgicos de cola, cuerpo y cabeza del pncreas, con un
aumento de 450X.
En la Figura 12 se muestran microfotografas de cortes histolgicos de las tres

regiones del pncreas de un animal de experimentacin perteneciente al grupo al
cual se le administr glibenclamida. Se observa un tejido pancretico normal con
islotes de Langerhans pequeos que estn evolucionando hacia un islote atrfico.
Se aprecia la presencia de vasos congestivos, la disminucin del nmero de acinos
pancreticos e indicios de infiltrado linfoide.
55
Figura 12. Microfotografa de corte histolgico de pncreas de Rattus rattus perteneciente al grupo
de experimentacin que recibi el tratamiento con Glibenclamida (grupo 02) a los 21 das de
experimentacin. De izquierda a derecha se muestran los cortes histolgicos de cola, cuerpo y
cabeza del pncreas, con un aumento de 450X.
En la Figura 13 se observan los cortes histolgicos de pncreas de un animal de

experimentacin perteneciente al grupo que recibi el tratamiento con G. nitida.
Se puede observar un tejido pancretico normal pero con la presencia de islotes
de Langerhans pequeos y atrficos. Adems se aprecia la presencia de vasos
congestionados con infiltrados linfoides perivaculares.
56
Figura 13. Microfotografa de cortes histolgicos de pncreas de Rattus rattus perteneciente al
grupo de experimentacin que recibi el tratamiento con G.nitida (grupo 03) a los 21 das de
En la Figura 14 se muestran cortes histolgicos de pncreas de un animal de

experimentacin que recibi tratamiento con G. chamuchui. Como se puede
apreciar los islotes de Langerhans estn atrficos y de tamao muy reducido,
sobretodo en la regin de la cabeza del pncreas. Tambin se observa presencia
de vasos congestionados, sobretodo en la regin del cuerpo del pncreas.
57
grupo de experimentacin que recibi el tratamiento con G. chamuchui (grupo 04) a los 21 das de
En la Figura 15 se muestran los cortes histolgicos de pncreas de un animal de

experimentacin que recibi el tratamiento con S. sonchifolius. Como se observa,
morfolgicamente hay una disminucin progresiva del tamao de los islotes de
Langerhans, evidencindose atrofia de los acinos pancreticos, sobretodo en la
regin de la cabeza del pncreas, con presencia de vasos congestionados que
estn en mayor nmero en la regin del cuerpo del pncreas.
58
grupo de experimentacin que recibi tratamiento con S.sonchifolius (grupo 05) a los 21 das de

experimentacin perteneciente al grupo que recibi tratamiento con G. bicolor.
En la regin de cola y cuerpo de pncreas se puede observar una estructura
pancretica homognea, con presencia de islotes de Langerhans prcticamente
de tamao normal. No se observa presencia de infiltrados linfoides y tampoco es
abundante la presencia de vasos congestivos. Se aproxima morfolgicamente a
un corte histolgico de pncreas normal en las regiones de cola y cabeza, sin
embargo, la regin de cabeza de pncreas muestra islotes pequeos en mayor
nmero que en cortes anteriores y se observa la presencia de clulas primitivas
(clulas madres), lo que evidencia signos de regeneracin morfolgica en esta
regin.
59
grupo de experimentacin que recibi tratamiento con G. bicolor (grupo 06) a los 21 das de

experimentacin perteneciente al grupo diabtico que no recibi ningn
tratamiento. Se puede apreciar un tejido pancretico con una disminucin
marcada de la cantidad de islotes de Langerhans, observndose slo 1 a 2 por
campo microscpico. Alteraciones morfolgicas del ncleo mostrando: picnosis,
carirrexis y cariolisis. Hipertrofia y Atrofia de las clulas beta (aumento y
disminucin del volumen celular). Se aprecia degranulacin de las clulas beta e
hipertrofia con disminucin del tamao de los islotes. La morfologa insular est
alterada, mostrando contornos estrellados o disgregados con presencia de
congestin vascular. Tambin se observa necrosis de los islotes de Langerhans y
lesiones degenerativas de las clulas beta del pncreas.
60
Figura 17. Microfotografa de cortes histolgicos pncreas de Rattus rattus perteneciente al grupo de
experimentacin tratado con STZ que no recibi ningn tratamiento (grupo 07) a los 21 das de
61
IV. DISCUSION
La medicina tradicional ofrece una alternativa para el tratamiento de

enfermedades metablicas tales como la Diabetes Mellitus. Las plantas son
fuentes de sustancias bioactivas, sin embargo, algunas de ellas son altamente
txicas y perjudiciales para el ser humano. Por ello, es importante hacer estudios
qumico-biolgicos que evalen la efectividad de estas plantas en el tratamiento
de enfermedades as como la posible toxicidad que pueden presentar, para que
se pueda recomendar su uso de una manera segura. En este trabajo se plante
la evaluacin del efecto hipoglucemiante de 3 especies de la familia
Gentianaceae y del S. sonchifolius puesto que son plantas empleadas
ancestralmente en el Per y a las que se les atribuyen propiedades teraputicas
para combatir diversas enfermedades, entre ellas la Diabetes Mellitus (17). Con
este objetivo, primero se recolectaron las especies, las cuales fueron
debidamente identificadas y posteriormente se prepararon extractos acuosos a
partir de las mismas, ya que la poblacin consume las plantas en forma de
disoluciones acuosas.
Los extractos acuosos obtenidos a partir de cada material vegetal incluido en

este estudio, se prepararon segn protocolo anteriormente descrito,
obtenindose un rendimiento del 35 % para G. bicolor y G. nitida, mientras que se
obtuvo un rendimiento del 16 % para G. chamuchui y de un 8 % para S.
sonchifolius. El ms bajo rendimiento de S. sonchifolius respecto al resto, se debe
al hecho de que se emplearon las races de esta planta para preparar el extracto y
casi todo el contenido de las mismas es agua.
62
Al realizar el tamizaje fitoqumico de las fracciones diclorometnicas que se
prepararon a partir de los extractos acuosos de cada especie vegetal en estudio,
no se observ la presencia de quinonas en los mismos y slo las especies de
Gentianella dieron un resultado levemente positivo a la presencia de triterpenos
y esteroides. Por otra parte, al realizar la marcha fitoqumica a la fraccin
etanlica de los extractos obtenidos a partir de cada material vegetal, se observ
que las fracciones de las especies de Gentianellas en estudio compartan la
positividad a la presencia de flavonoides, fenoles, lactonas, catequinas en igual
intensidad, mientras que se observ una mayor presencia de antocianidinas en
las fracciones de G. bicolor y G. chamuchui en comparacin con el resto de las
fracciones. Por otro lado, se observ una mayor presencia de aminocidos y
azcares reductores en la fraccin etanlica de G. chamuchui respecto a los
dems. Todas las fracciones fueron positivas a la presencia de azcares
reductores, lo cual es evidente en las races comestibles de S. sonchifolius. Hay
que destacar que todas las fracciones resultaron negativas a la presencia de
alcaloides y que, tal y como se observ en la fraccin diclorometnica, en la
fraccin etanlica tampoco se observ presencia de triterpenos y esteroides. Los
mismos resultados observados en la fraccin etanlica se replicaron en la fraccin
acuosa, observndose la presencia de flavonoides, taninos, antocianidinas y
azcares reductores en las fracciones acuosas obtenidas a partir de las especies
Gentianella y la negatividad a la presencia de alcaloides. Es importante destacar
que no se observ la presencia de flavonoides ni lactonas en las fracciones
etanlica y acuosa obtenidas a partir de la raz de S. sonchifolius, siendo sta la
principal diferencia observada respecto a las fracciones obtenidas a partir de los
extractos de plantas de las especies Gentianella en estudio. Existen pocos
estudios publicados sobre la identificacin de los metabolitos bioactivos
presentes en las especies Gentianella que forman parte de este estudio, lo cual
puede deberse en gran medida a que la mayora de estas plantas son endmicas
del Per. Sin embargo, se encontraron estudios anteriores donde se identificaron
63
metabolitos importantes a partir de Gentianella nitida como secoiridoides,
xantonas y un sesterpenoide con la capacidad de incrementar la actividad del gen
de Interleuquina 2 (IL-2) en clulas T humanas (29,38).
Como primer acercamiento a los fitoconstituyentes presentes en las especies en

estudio, se realizaron cromatografas en capa delgada a las fracciones preparadas
a partir de los extractos de cada material vegetal en estudio, a las que
anteriormente tambin se les realiz la marcha fitoqumica para determinar la
presencia de metabolitos secundarios. Se utilizaron 3 sistemas de solventes para
evaluar cada fraccin y se observ que las fracciones diclorometnicas
preparadas a partir de cada material vegetal presentaron un nmero reducido de
manchas en todos los sistemas de solventes. Hay que resaltar que todos las
fracciones diclorometnicas preparadas a partir de las especies de Gentianella
presentaron bandas comunes con Rf muy similares que no se observaron en la
fraccin preparada a partir de la raz de S. sonchifolius, lo cual pudiera deberse a
la presencia de un compuesto(s) comn(es) en dichas especies. Hay que destacar
la presencia de manchas con Rf muy similares slo observadas en las fracciones
etanlicas y acuosas de las especies de Gentianella, lo cual sugiere que se trata de
compuestos comunes en estas especies y que no se identificaron en las
fracciones preparadas a partir de la raz de S. sonchifolius. Por otro lado, cuando
se emple el sistema de solventes BAW, en la proporcin 4:1:5, se pudieron
identificar una mayor cantidad de bandas que con los otros sistemas de
corrimiento evaluados. Adems se observaron bandas fluorescentes presentes
en mayor cantidad en todas las fracciones preparadas a partir de las especies de
la familia Gentianella. Tambin se observ una banda fluorescente tanto en la
fraccin etanlica como en la acuosa preparada a partir de la raz de S.
sonchifolius con un Rf muy similar a una banda observada en las fracciones
preparadas a partir de las especies de Gentianella en estudio, lo cual podra
significar que se trata de un compuesto(s) comn(es) en todas las plantas
64
incluidas en el estudio. Cabe destacar que todas las bandas fluorescentes solo
fueron visibles bajo luz ultravioleta y que no se pudieron observar con luz visible,
lo cual sugiere que se trata de compuestos insaturados (35).
Para realizar el estudio de la respuesta hipoglucemiante, primero se provoc la

diabetes mediante el empleo de la enzima Estreptozotocina a una dosis de 60
mg/kg de peso va intraperitoneal. La seleccin de la dosis se debi a la
informacin reportada en estudios previos que emplearon la misma dosis en
Rattus rattus, cepa Sprague Dowley, que fue la misma cepa que se emple en
este estudio. En estudios se report que con esa dosis a las 48 horas despus de
la induccin, los animales presentaban glucemias promedios de 300mg/dL (39,40)
sin embargo cuando se realiz la induccin con esa dosis en los animales de
experimentacin, a las 24 horas se observaron glucemias promedios por encima
de los 400mg/dL, por lo que se les provoc una diabetes tipo 1 severa, que a
medida que avanzaron los das de experimentacin lleg a valores por encima de
los 600mg/dL de glucemia.
Durante los 21 das de experimentacin, se administr por va intragstrica

500mg/Kg de peso de cada extracto acuoso correspondiente a cada material
vegetal incluido en el estudio. Adems un grupo de animales recibi 10 mg/Kg de
peso de glibenclamida, siendo considerado este grupo como control positivo.
Durante los primeros 13 das de experimentacin no se observ un efecto
hipoglucmico significativo con ninguno de los tratamientos administrados y
tampoco se observ una disminucin de la glucemia en el grupo que recibi
tratamiento con glibenclamida. Estudios anteriores donde han evaluado el efecto
hipoglucemiante de Gentianella umbellata y Gentianella thyrsoidea, especies de
la familia Gentianaceae, han observado un efecto hipoglucemiante agudo a las
05 horas despus de administrar el extracto diclometnico de esta especie desde
el primer da de experimentacin (21,41). Hasta la fecha no se ha encontrado un
65
estudio anterior donde se haya empleado plantas de la familia Gentianaceae y se
haya reportado el mismo comportamiento observado en este estudio.
Segn los reportes de la poblacin que emplea estas plantas por sus efectos
hipoglucemiantes, se evidencia un efecto hipoglucemiante agudo con el empleo
tanto de las plantas de la familia Gentianella en estudio como con el empleo de
la raz de S. sonchifolius (24,25). Sin embargo, en este estudio se observ un
efecto hipoglucemiante a partir del da 14 de experimentacin que se mantuvo
hasta el da 21 de experimentacin, el cual fue ms notorio y estadsticamente
significativo a las 06 horas despus de administrar los extractos acuosos de G.
bicolor y G. chamuchui . Hay que destacar que no se observ un efecto
hipoglucemiante en el grupo de experimentacin que recibi el tratamiento con
la raz de S. sonchifolius, al contrario se observ un incremento en las glucemias
de los animales que conformaron este grupo a medida que pasaron los das, lo
cual provoc una mortalidad del 50% en este grupo al finalizar la
experimentacin. Trabajos anteriores observaron un efecto hipoglucemiante con
la administracin de la raz de S. sonchifolius (42,43). Por otra parte, Habib et al
en el 2011 realizaron un estudio donde observaron el efecto hipolipemiante de la
raz de S. sonchifolius en ratas con diabetes inducida con la administracin
intraperitoneal de Streptozotocina, pero no observaron un efecto
hipoglucemiante significativo (44). En este trabajo tampoco se observ un efecto
hipoglucemiante estadsticamente significativo con la admiminstracin del
extracto acuoso obtenido a partir de la raz de S. sonchifolius (44).
Hay que destacar que a medida que avanz la experimentacin, los niveles de
glucemia de los animales incluidos en el estudio llegaron en muchos casos por
encima de los 600 mg/dL y lograr una disminucin hasta 341 mg/dL (alrededor
del 40 %), como ocurri con el tratamiento con G. bicolor, es una disminucin
importante y estadsticamente significativa. El hecho de no observar una
disminucin de la glucemia en los animales de experimentacin durante los
66
primeros 13 das y luego observar una disminucin de las glucemias a partir del
das 14 en casi todos los grupos que recibieron tanto tratamiento con extractos
acuosos de las 3 especies de Gentianella en estudio as como en el grupo que
recibi glibenclamida, sugiere que el efecto hipoglucemiante de estas plantas es
crnico y probablemente si se hubiera prolongado el tiempo de experimentacin
se hubiera podido observar una disminucin mucho mayor de las glucemias, as
como una mayor recuperacin del tejido pancretico, de los islotes de
Langerhans y por tanto un aumento de la produccin de insulina por las clulas
del pncreas.
Tal como se observ en los cortes histolgicos, los pncreas de los animales de
experimentacin a los cuales se le administraron los extractos acuosos de las
especies de Gentianella, en especial los extractos obtenidos a partir de G. bicolor
y de G. chamuchui, muestran un tejido pancretico muy conservado,
morfolgicamente similar al tejido pancretico de animales de experimentacin
sanos, lo cual sugiere una recuperacin y/o regeneracin de las clulas beta del
pncreas que explicaran el comportamiento de las glucemias de los animales de
experimentacin que recibieron dichos tratamientos. La teora planteada se
refuerza con un trabajo previo publicado por Alimohammadi et al en el 2013,
donde se evidenci que el extracto hidroalcohlico de la especie Nigella sativa L.
administrado en ratas con hiperglucemia inducida por la administracin de
Streptozotocina no solo tuvo un efecto hipoglucmico a partir del da 16 de
experimentacin, sino que adems se observ en los cortes histolgicos
realizados el da 36 (final) de experimentacin, un incremento del nmero de
clulas Beta de los islotes de Langerhans as como de la produccin de insulina en
el tejido pancretico de las ratas diabticas tratadas con dicha especie (39).
67
V. CONCLUSIONES
- El extracto acuoso obtenido a partir de Gentianella bicolor, a una dosis de 500

mg/Kg de peso, tiene un efecto hipoglucemiante estadsticamente significativo
mayor que el extracto acuoso obtenido a partir de Gentianella chamuchui,
Gentianella nitida, Smallanthus sonchifolius a la misma dosis y que la
Glibenclamida, a una dosis de 10 mg/Kg de peso, logrando una disminucin de la
glucemia alrededor del 40 %.
- Se logr colectar, identificar y establecer una materia prima con calidad a partir
de las especies de Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex Pringle, Gentianella
nitida, Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius.
- Se prepararon extractos acuosos dosificados que permitieron las evaluaciones

biolgicas como hipoglucemiante de las cuatro especies vegetales seleccionadas
para este estudio.
- El efecto hipoglucemiante observado a partir del da 14 de experimentacin, con

la administracin de 500 mg/Kg de peso del extracto acuoso obtenido a partir de
Gentianella bicolor fue superior al observado con la administracin de 500 mg/Kg
de peso del extracto acuoso obtenido a partir de Gentianella chamuchui, quien a
su vez provoc un efecto hipoglucemiante mayor que el que se observ con la
administracin de 10mg/Kg de peso de Glibenclamida. No se observ un efecto
hipoglucemiante estadsticamente significativo con la administracin de 500
mg/Kg de peso del extracto acuoso obtenido a partir de la raz de Smallanthus
sonchifolius.
68
- Se observ una mayor recuperacin y/o regeneracin de las clulas beta de los
islotes de Langerhans de los pncreas de los animales de experimentacin a los
que se le administr 500 mg/Kg de peso del extracto acuoso obtenido a partir de
Gentianella bicolor, recuperacin que fue menos notoria con la administracin de
500 mg/Kg de peso del resto de los extractos acuosos obtenidos a partir de
especies de Gentianella y que no fue observado con la administracin de 500
mg/Kg de peso del extracto acuoso de raz de Smallanthus sonchifolius.
69
VI. RECOMENDACIONES
- Realizar la separacin e identificacin de los metabolitos presentes en los

extractos acuosos de G. bicolor, G. chamuchui y G. nitida que pudieran ser
responsables del efecto hipoglucemiante observado.
- Realizar la evaluacin el efecto hipoglucemiante de extractos acuosos obtenidos

a partir de G. bicolor, G. chamuchui y G. nitida de en animales de
experimentacin que tengan glucemias promedios entre 250-350 mg/dL para
determinar si el efecto hipoglucemiante es agudo o crnico en el caso de
diabetes tipo 2 o menos severa.
- Separar e identificar los compuestos fluorescentes observados en las

cromatografas en capa fina que son comunes en las fracciones etanlicas y
acuosas de las plantas de la familia Gentianella y determinar si tienen efecto
hipoglucemiante.
- Realizar ensayos inmunohistoqumicos con anticuerpos monoclonales anti-

insulina para identificar la presencia de insulina en las clulas beta de los islotes
de Langerhans de pncreas de los animales que recibieron tratamiento con
extracto acuoso de G. bicolor y comprobar la recuperacin de la funcionalidad del
tejido pancretico regenerado.
70
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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73
41. Tomas G. Estudio fitoqumico y farmacolgico de la Gentianella thyrsoidea Hooker fabris.
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42. Castaeda B, Castro de la Mata R, Manrique R, Ibez L, Fujita R, Barnett E. Estudio

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(yacon) roots on diabetic rats: Biochemical approach. Chemico-Biological Interactions
194 2011; 3139.
74
VIII. ANEXOS
ANEXO 1:
Certificado de salud de los animales de

experimentacin empleados en el
estudio.
75
76
ANEXO 2:
Especies de la familia Gentianaceae

estudiadas
77
Gentianella bicolor (Corpus Huay)
78
Gentianella chamuchui (Chamuchui)
79
Gentianella nitida (Hercampuri)
80
81

EVALUACION FITOQUIMICA Y COMPARACION DEL EFECTO HIPOGLUCEMIANTE DE EXTRACTOS ACUOSOS DE Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle, Gentianella nitida, Gentianella chamuchui y Smallanthus sonchifolius en Rattus rattus

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

EVALUACION FITOQUIMICA Y COMPARACION DEL EFECTO HIPOGLUCEMIANTE

DOCTORA EN CIENCIAS BIOMEDICAS

AUTORA: Ms. LUDISLEYDIS BERMUDEZ DIAZ

ASESOR: Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA

Tabla 1. Clasificacin de los principales hipoglucemiantes ....................................... 10

Tabla 2. Conformacin de los grupos de experimentacin y dosis administradas

Tabla 3. Tabla resumen de los parmetros de rendimiento del material vegetal...... 31

Tabla 4. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin diclorometnica (fraccin 1) de

Tabla 5. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin etanlica (fraccin 2) de los

Tabla 6. Marcha fitoqumica realizada a la fraccin acuosa (fraccin 3) de los

Tabla 7. Cromatografa en capa fina de las diferentes fracciones obtenidas a partir

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Figura 2. Comportamiento de glucemia promedio (mg/dl) en los primeros 13 das de

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1.1 Objetivo General

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1.2 Objetivos Especficos

2. Preparar extractos acuosos dosificados que permitan las evaluaciones

3. Evaluar la posible actividad hipoglucemiante de los extractos acuosos de las

4. Realizar el anlisis histopatolgico de los pncreas de los animales que forman

2.1. Material Vegetal

Se recolectaron las plantas Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle

2.2. Animales de experimentacin

Los animales de experimentacin que se utilizaron en este estudio fueron de la

2.3. Materiales generales

La enzima Streptozotocina que se utiliz en la experimentacin fue de la marca

Equipos y Reactivos usuales para el trabajo de laboratorio de acuerdo a lo

3.1. Mtodos fitoqumicos