Implementao e Validao de Mtodos Analticos

Alexandra Sofia Reynolds Mendes

Laboratrio Regional de Controlo da Qualidade da gua
Estao da Alegria
9050-FUNCHAL
E-mail: xana@iga.pt

Resumo

Este artigo tem como principal objectivo descrever as principais etapas

associadas implementao e validao de um mtodo analtico.
Apresenta-se um exemplo: implementao e validao de um mtodo em
Absoro Atmica com Cmara de Grafite para determinao da
concentrao de alumnio em aguas de consumo humano

1. Introduo

A validao de um mtodo analtico um aspecto crucial da garantia da

qualidade analtica pelo tem recebido uma ateno considervel por parte
da comunidade cientifica, comits industriais e entidades reguladoras. Isso
ocorre pela necessidade de uniformizar os critrios utilizados com o fim de
demonstrar que um mtodo de ensaio, nas condies em que praticado
tem as caractersticas necessrias para assegurar a obteno de resultados
com a qualidade exigida.

Um mtodo de ensaio um processo que envolve manipulaes

susceptveis de acumularem erros (sistemticos e/ou aleatrios), o que, em
algumas situaes, pode alterar de forma significativa o valor do resultado
final.
 Implementao e Validao de Mtodos Analticos

A implementao de um mtodo analtico pode por vezes ser entediante,

mas as consequncias de no se fazer correctamente podem ser
desastrosas pois se traduzem em perda de tempo, de dinheiro e outros
recursos.

2. Mas ento o que a validao de um mtodo?

Segundo a Norma NP EN ISO/IEC 17025, Validao a confirmao,

atravs de exame e apresentao de evidncia objectiva, de que os
requisitos especficos relativos a uma dada utilizao so cumpridos.

A validao de um mtodo analtico permite demonstrar que o mtodo

adequado ao uso pretendido.

Sempre que um laboratrio execute ensaios ter que instruir um processo

de validao do mtodo durante a sua implementao, ou sempre que
ocorra uma alterao relevante do mesmo, o qual incluir todos os registos
obtidos. A validao de um mtodo deve ser adaptada caso a caso, sendo
progressivamente mais exigente para as seguintes situaes:
Extenses e/ou modificaes de mtodos normalizados;
Mtodos normalizados utilizados fora do mbito de utilizao
prevista;
Mtodos No Normalizados;
Mtodos criados e desenvolvidos pelo prprio laboratrio.

A validao inclui:
A especificao dos requisitos;
A determinao das caractersticas do mtodo;
 Metrologia e Qualidade

Uma verificao de que os requisitos podem ser satisfeitos

utilizando o mtodo em causa;
Uma declarao de validade.

Os parmetros de validao de um mtodo analtico incluem:

A gama de linearidade;
Limiares analticos (limite de deteco e limite de quantificao);
A repetibilidade/reprodutibilidade;
A exactido;
A selectividade do mtodo;
A robustez a influncias externas;
A incerteza dos resultados.

A LINEARIDADE PODE SER AVALIADA POR:

Representao grfica e clculo do coeficiente de correlao

D ep en d en tes

Dependentes
Variveis

Variveis

Variveis Independentes Variveis Independentes

r=
{(x x )( y y )}
i i

[ (x x ) ][ ( y y ) ]
i
2
i
2

1 r 1
 Implementao e Validao de Mtodos Analticos

Anlise de residuais (ex.: razo entre os valores de y experimentais e os

valores de y estimados)

1,2

Dependentes
Variveis
1

0,8

Variveis Independentes

Aplicao da norma ISO 8466 Calibrao e Avaliao de Mtodos

Analticos e Estimativa das Caractersticas do Desempenho:

Teste da Homogeneidade das Varincias (comparao estatstica

da varincia do padro mais concentrado S2M com a do padro
menos concentrado S2m da curva, visto que estas normalmente
apresentam uma maior varincia).

O valor teste calculado pelas equaes:

sM2 sm2
VT = VT =
sm2 para s s
2
M
2
m e sM2 para s m2 s M2

E comparado com o valor tabelado na distribuio de Fisher. A deciso

estatstica a seguinte:

Se VT F a diferena entre as varincias no

significativa.
 Metrologia e Qualidade

Se VT > F a diferena entre as varincias significativa e

a gama de trabalho deve ser reduzida at que esta se
deva apenas a erros aleatrios.

Teste da Linearidade (comparao estatstica do valor teste com o

valor tabelado da distribuio de Fisher, para 1 g.l.)

O valor teste calculado pelas equaes:

DS 2 = ( N 2 )s y2 / x (1 ) (N 3)s y2 / x ( 2 )

DS 2
VT =
s y2 / x ( 2 )

onde :
s y / x (1 ) Desvio padro residual da curva de calibrao linear.

s y / x(2 ) Desvio padro residual da curva de calibrao no

linear.

A deciso estatstica a seguinte:

Se VT F, a funo de calibrao linear conduz a um

melhor ajuste dos pontos.

Se VT > F, a funo de calibrao linear no conduz a um

melhor ajuste dos pontos. A gama de concentraes deve
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ser reduzida ou ento aplica-se uma funo de calibrao

no linear.

3. Limiares Analticos

Os conceitos de limite de deteco (Ld) e de quantificao (Lq) devem ser

entendidos conforme recomendado pela IUPAC, isto :

o limite de deteco corresponde ao incio da gama em que

possvel distinguir com uma dada confiana estatstica
(normalmente 95 %), o sinal do branco do sinal da amostra, e
como tal indicar se o analito em questo est ausente ou presente;
a gama entre o Ld e o Lq deve ser entendida como uma zona de
deteco qualitativa, e no quantitativa, pelo que no se devem
reportar valores numricos nesta gama;

o limite de quantificao corresponde ao incio da gama em que o

coeficiente de variao (incerteza relativa) do sinal se reduziu a
valores razoveis (normalmente 10 %) para se poder efectuar uma
deteco quantitativa; deste modo, na prtica deve usar-se o Lq
como incio da zona em que se reportam valores numricos.

Assim, na gama baixa, o 1 padro de calibrao deve ser igual ou

ligeiramente superior ao limite de quantificao.

Podem ser usados dois mtodos para o clculo dos referidos limites:

a partir de uma srie de ensaios com um branco representativo

(ou um padro de baixa concentrao, caso o branco no tenha
flutuao significativa), e calculando a respectiva mdia e desvio-
padro; recomenda-se a que sejam utilizados brancos
 Metrologia e Qualidade

independentes para obter esta estimativa (dias diferentes,

condies de rotina):

LD = x0 + 3,3s0 LQ = x0 + 10s0

a partir da estatstica de mnimos quadrados da recta de

calibrao, admitindo-se que o desvio-padro da estimativa (Sy/x
ver ISO 8466-1) representa o desvio-padro do branco representa
o desvio padro do branco:
3,3s0 10 s0
LD = LQ =
declive declive

O LQ estimado dever ser confirmado experimentalmente com um padro

de concentrao semelhante.

4. Repetibilidade/Reprodutibilidade

repetibilidade a aproximao entre os resultados de medies

sucessivas da mesma mensuranda, efectuadas nas mesmas condies
de medio no mais curto espao de tempo, isto :
o mesmo laboratrio;
o mesmo analista;
o mesmo equipamento;
o mesmo tipo de reagentes.

reprodutibilidade a aproximao entre resultados das medies da

mesma mensuranda efectuada com alterao de pelo menos uma das
condies de medio, ou seja:
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o mesmo laboratrio ou diferentes laboratrios;

o diferentes analistas;
o diferentes equipamentos;
o e/ou diferentes pocas.

A repetibilidade e a reprodutibilidade podem exprimir-se

quantitativamente em termos das caractersticas da disperso dos
resultados.

(x x )
2
i
s= s xo
(n 1) CVxo =
x
100(%)

5. Exactido

A exactido definida como a aproximao entre o resultado da medio e

o valor verdadeiro da mensuranda.

A exactido de um mtodo analtico pode ser determinada:

atravs da participao em ensaios interlaboratoriais,
pelo estudo de materiais de referncia certificados,
atravs de ensaios fortificados,
por comparao com mtodos de referncia.

A exactido um parmetro qualitativo que pode ser avaliado por testes

de significncia estatstica.

t = (x ) n / s
 Metrologia e Qualidade

6. Selectividade

A selectividade do mtodo a capacidade deste para identificar e

distinguir um determinado analito numa mistura complexa, sem
interferncia de outros componentes. A selectividade do mtodo deve ser
estudada usando vrias amostras, desde solues padro a misturas de
matrizes complexas ou elementos considerados potenciais interferentes.

A selectividade do mtodo demonstrada como o desvio dos resultados

obtidos pela anlise do analito em causa em amostras fortificadas com
todos os potenciais interferentes e os resultados obtidos com amostras no
fortificadas, isto , contendo somente o analito. Quando se desconhecem os
interferentes, a selectividade do mtodo pode ser investigada por
comparao dos resultados obtidos com outros mtodos.

7. Robustez

A robustez do mtodo define-se pela capacidade que um mtodo tem para

resistir a pequenas variaes durante a sua execuo. Deve ser investigada
na etapa de desenvolvimento do mtodo. Os testes de robustez avaliam
essencialmente a alterao a parmetros identificados partida como
crticos. Deste modo, um teste de robustez bem conduzido, evidenciar as
etapas do mtodo em que o rigor critico e aquelas em que h alguma
tolerncia.

Para se determinar a robustez de um mtodo pode-se utilizar o teste de

YOUDEN ou, testar o mtodo em situaes de preciso intermdia, isto ,
fazendo variar as condies operatrias dentro do prprio laboratrio.
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8. Concluses

A validao de um mtodo um processo constante e dinmico. Um

processo de validao bem definido e documentado fornece evidncia
objectiva de que o sistema e o mtodo so adequados ao uso pretendido.

9. Bibliografia consultada

Validao de Mtodos Analiticos: Paula Teixeira. Joo Seabra Barros.

INETI DEECA. Maio 2003.

Vocabulrio Internacional de Metrologia. Termos Fundamentais e

Gerais. 2 Edio. Instituto Portugus da Qualidade (1996).

Guia para a Acreditao de Laboratrios em Ensaios Qumicos.

Instituto Portugus da Qualidade (2000).

NP EN ISO/IEC 17025 Requisitos Gerais de Competncia para

Laboratrios de Ensaio e Calibrao. Instituto Portugus da
Qualidade (2000).

Quantifying Uncertainty i Analytical Measurement. Eurachem/Citac

Guide 2 Ed. (2000).

ISO 5725-1:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement

methods and results Part 1. General principles and definitions

ISO 5725-2:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement

methods and results Part 2. Basic methods for the determination of
repeatability and reproductibility of a standard measurement
method.
 Metrologia e Qualidade

ISO 5725-3:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement

methods and results Part 3. Intermidiate measures of the precision
of a standard measurement method.

ISO 5725-4:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement

methods and results Part 4. Basic methods for the determination of
the trueness of a standard measurement method.

ISO 5725-6:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement

methods and results Use in practice of accuracy values.

Guia Relacre 13