24 Biotecnologia

Marcadores moleculares e suas aplicaes no

melhoramento gentico
Claudia Teixeira Guimares'
[urandir Vieira de Magallies?
Marcelo /J.breu Lanza?
Iuan Scliuster'

Resumo - O melhoramento gel1ticotem sido um dos grandes responsveis pelos avan-

na agricultura, com o de:~nvolvmento de ~ultivares superiores, quer pela maior
I: "prodtieidd, ,qer pela melhor a'daptao aos ambientes adversos. O sucessd' de um

progranla de melhoramento gentico depende, fundamentalmente, de algumas etapas

como a escolha de gentores e a seleo de gentipos superiores. Desde o surgimento
dos marca dores RFLP, na dcada de 1980, as metodologias para a explorao dos po-
limorfismos de DNA tm sido alvo de grandes avanos na automao e na gerao de
dados em larga escala, fornecendo uma amostragem do genoma, cada vez mais ampla,
a um custo menor. Assim, com a tendncia do aumento crescente no volume de dados,
associada reduo nos custos, os marcadores moleculares firmam-se como estratgias
~6ldas paraauxar o melhoramento gentico, assim como estudos sobre clonagem e
\~jfuno de genes, fogen~i div~r6idde e estrutura gentica em espcies cultivadas e
'. silvestres. Sero apresentados marcos importantes na evoluo das tecnologias de mar-
cadores de DNA e algumas das suas aplicaes, com nfase nas anlises de diversidade,
mapeamento gentico e seleo assistida em plantas.

Palavras-chave: Mercador molecular, Modelo estatstico', Polimorfismo. Genoma.

INTRODUO distribudos aleatoriamente ao longo de trait locus (QTLs) e de QTLs expressos

Com o advento das tcnicas de bio-
logia molecular, tornou-se possvel a
manipulao do cido desoxirribonucleico
(DNA), culminando com o surgimento
dos rnarcadores moleculares na dcada de
1980. Desde ento, esses marcadores tm
acompanhado os avanos da era genmi-
ca, beneficiando-se do grande volume de
informaes de sequncias de DNA dis-
ponvel. Alm das vantagens apresentadas
sobre os marcadores morfolgicos. as tec-
nologias existentes fornecem um nmero
praticamente ilimitado de polimorfismos
todo o genoma, de forma automatizada
e a custos cada vez mais reduzidos, O
avano das tcnicas moleculares tem sido
acompanhado de perto pelo grande desen-
volvimento nas reas da bioinformtica, da
estatstica e da gentica quantitativa. Com
isso, encontram-se disponveis informaes
genrnicas ancoradas a mapas fsicos e
genticos altamente saturados, alm dos
inmeros genes diferencialmente expres-
sos, que so facilmente integrados por meio
da bioinformtica, Assim, o mapeamento
de caracteres quantitativos - quantitative
tem dado suporte para a identificao de
genes e para a seleo assistida, trazendo
um vasto contedo de informao gen-
tica para a maioria das espcies vegetais.
A aplicao dessas metodoJogias, para
acelerar e monitorar os programas de me-
lhoramento gentico, tem implicado em
avanos no desenvolvimento de variedades
melhoradas.
As limitaes em termos de saturao
do genoma, nmero de indivduos analisa-
dos e preciso na deteco de QTLs tendem
a ser minimizadas com a revoluo trazida

1 Eng' Agr D.Sc. Pesq. Embrapa Milho e Sorgo, Caixa Postal 15 l . CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. Correio eletrnico. claudiaiicnpms.embrapa.br
2Eng" Agr". D.Se, Pesq. Embrapa Milho e Sorgo, Caixa Posta! 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG, Correio e!etrnico:jllrandir@J:npms,el1lbrapa.br
3Eng" Agr". D.Sc, Pesq. UR, EPAMIG TP. Caixa Postal 351. CEP 38001-970 Uberaba-M'G. Correio eletrnico: mlan:a@epamig,br
"Eng Agr=, DSc. Pesq. COODETEC. Caixa Postal 301, CEI' 85813-450 Coscavel-PR. Correio eletrnico: ivan@coodetec,com,br

Informe Agropecurio, 8elo Horizonte, v.30, n.253, p.xx-xx, nov./dez. 2009

Biotecnologia 25

pelo sequenciamento em altssima escala. no tamanho dos fragmentos amplificados polymerase chain reaction (PCR). Assim, o
Tais avanos tm disponibiJizado um gran- devem-se s diferenas no nmero de ISSR assemelha-se ao RAPD, uma vez que
de nmero de polimorfismos de base nica- elementos simples repetidos, necessitando amplifica sequncias aleatrias no genoma,
single-nucleotide po/ymorphism (SNP). de gis de alta resoluo para a separao embora seja mais reproduzvel que o RAPD,
aleatrios no genoma ou em genes expres- dos fragmentos, uma vez que estes diferem considerando que os primers so maiores e
sos. que, por sua vez, tm possibilitado a por poucos pares de base. Em plantas, necessitam de temperatura de anelamento
construo de plataformas para anlise os microssatlites foram rapidamente mais elevada nas reaes de PCR. A tcnica
de centenas de milhares de marcadores implementados em vrias espcies e so surgiu em funo da dificuldade de gerar os
em paralelo, a um custo reduzido. Essas utilizados at hoje na construo de mapas primers especficos para amplificar os SSR
condies combinadas com modelos esta- genticos, nos estudos de diversidade e no (ZIETKIEWICZ; RAFALSK!; LABUDA,
tsticos, propostos para seleo com base melhoramento assistido.
1994), sendo tambm muito usado em
na genotipagern de genornas completos, Dentre as vantagens que tornaram
plantas e fungos.
iro contribuir cada vez mais para que a esses marcadores largamente utilizados
seleo assistida assuma um papel efetivo podem-se destacar a alta frequncia e a DArTs
no desenvolvimento de cultivares superio- distribuio ao acaso nos genomas eu-
Com o surgimento dos microarranjos
res, mais adaptadas e com caractersticas cariotos, alm de serem co-dominantes e
de DNA, Jaccoud et a!. (2001) propuse-
especiais. multiallicos, fornecendo um elevado nvel
ram uma adaptao dessa tecnologia para
de informao gentica por loco. A tcnica
a anlise de polimorfismos de DNA com
MARCADORES MOLECULARES de SSR de fcil execuo e altamente re-
a criao dos diversity arrays technology
produzvel, quando comparada com outras
(DArTs), onde fragmentos de DNA, que
RFLP, RAPD e AFLP metodologias, facilitando o intercmbio
representam o genoma de um organismo
de informaes entre diferentes grupos
Os marcadores do tipo restriction ou de uma populao. so digeridos com
de pesquisa. Uma limitao da tcnica
fragment length polymorphism (RFLP), duas enzimas de restrio, clonados e im-
a obteno dos primers especficos que
random amplified polymorphic DNA flanqueiam os microssatlites, requerendo
pressos em uma lmina de microarranjo
(RAPD) e amplified fragment length (Fig. 1). Os polimorfismos so detectados
a construo de bibliotecas genrnicas
polymotphism (AFLP) foram os marca- pela presena ou ausncia do fragmento
enriquecidas, o sequenciamento e o dese-
dores de DNA mais utilizados nas dcadas aps a hibridizao com o DNA genmi-
nho dos primers. Tal limitao tem sido
de 80 e 90, sendo ainda aplicados para al- superada com os avanos nas tcnicas mo- co de cada indivduo digerido e marcado
guns estudos genticos. Esses marcadores com fluorforos. Assim, a tcnica oferece
Ieculares, incluindo o sequenciamento em
foram responsveis pelo desenvolvimento grande escala. Com isso, existe uma grande uma ampla capacidade de amostragem
dos primeiros mapas genticos de muitas quantidade de pares de primers SSR com de milhares de marcadores aleatrios no
espcies cultivadas, alm da descoberta sequncias publicamente disponveis para genoma sem necessidade do conhecimen-
de genes e de inmeros estudos de diver- vrias espcies vegetais e animais. Apesar to prvio das sequncias alvo e de forma
sidade gentica. Cada um deles apresenta das possibilidades de automatizao e da automatizada.
vantagens e limitaes, cobrindo um amplo combinao de vrios primers em sequen- Apesar do grande progresso no sequen-
espectro de aplicaes. ciadores automticos, o nmero de locos ciamento de genomas com a descoberta de
analisados por reao ainda reduzido SNPs. esses avanos no atingem todas
Microssatlites ou SSR as espcies cultivadas. Nesse aspecto, os
diante dos novos desafios.
Os genomas eucariticos apresentam DArTs oferecem solues para a genotipa-
vrias classes de sequncias repetidas e ISSR gem em larga escala em espcies de rfs
uma delas consiste de repeties em tan- Os marcadores inter simple sequence como mandioca, feijo-de-corda iCajanus
dem de I a 6 nucleotdeos, sendo denomi- repeat(lSSR) utilizam um nicoprimerde- cajani, cevada e quinoa, alm de ser uma
nadas microssatlites ou simp/e sequence senhado com base nas sequncias repetidas fonte valiosa para a gerao de marcadores
repeat (SSR). As regies genrnicas que dos microssatlites na extremidade 5' com at mesmo para espcies cujos genomasj
flanqueiam as sequncias repetidas so alguns nucleotdeos extras na extremidade foram sequenciados como o sorgo (MACE
conservadas dentro de uma espcie, permi- 3'. Assim, os primers anelam-se dentro das et aI., 2008). Uma lista das espcies, que
tindo o desenho de pares de primers entre repeties e amplificam as regies genmi- possuem arranjos de DArTs disponveis
20 e 30 pb, que so utilizados para ampli- cas entre os SSRs, cujos tamanhos dos frag- para a genotipagem, encontra-se em
ficar os microssatlites. Os polirnorfismos mentos so limitados pela prpria tcnica da Diversity Arrays Technology (200-).

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------_ _---_._._._----_._-_
.. .._._------_.~_._--
Gx Gy Gn
Agrupamento do DNA de
indivduos representativos
de um poo! gnico
DNA genmico
digerido e
marcado: verde ~ "" """"
DNA controle ~.
marcado: vermelho "" .-
Figura 1 - Esquema da tcnica de DArTs
NOTA: DArTs ~ Diversity arrays technology;
FONTE: Dados bsicos: Joccoud et 01. (2001).
Marcadores com base em
informaes de sequncias
O sequenciamento de DNA passou
por duas grandes revolues: a tecnologia
dos dideoxinucleotdeos, que viabilizou a
autornatizao do processo e, mais recente-
mente, o surgimento das novas tecnologias,
tambm denominado sequenciamento
de prxima gerao, gerando bilhes de
etiquetas de DNA (454/Roche; Genome
'----"Analyzer/Illuminae e SOLiD/Applied Bio-
systems" \ Maiores detalhes podem ser
obtidos no artigo "Decifrando o genoma
em grande escala". Tais avanos viabili-
zaram os projetos de sequenciamento de
genomas completos e expressos, gerando
um volume enorme de informaes de se-
quncias de DNA. Com o surgimento dos
sequenciadores automticos de DNA, os
marcadores RFLP, RAPD e AFLP puderam
ser convertidos em primers especficos,
para utiIizao em reaes de PCR gerando
marcadores polimrficos diretamente nas
regies de interesse. Sondas genmicas
5Disponveis respectivamente nos sites: hnp.r/www.s Ss.com: http.r/www.illumina.com;
-_.._-------. ---_
Reduo da complexidade
do genoma pela digesto
* e ligao de adaptadores.
Fragmentos monomrficos
e polifrmicos (*)
Clonagem dos fragmentos
e impresso em lminas
de microarranjos
Ind 1 Genotipagem como O e 1.
O DNA de cada individuo
hibridizado em uma
lmina, juntamente com o
Ind 1
DNA controle
"""" """ --
DNA - cido desoxirribonucleico.
de RFLP utilizadas no mapeamento do
genoma humano foram os primeiros mar-
cadores a serem sequenciados para am-
plificao com primers especficos, sendo
denominados sequence tagged site (STS)
(OLSON et a!., 1989). A partir de ento, a
denominao STS tem sido aplicada para
qualquer marcador que tenha sido con-
vertido em primers de PCR por meio do
sequenciamento das regies alvo.
Os produtos de amplificao com
primers especficos podem ser sequencia-
dos, buscando polirnorfismos que gerem ou
eliminem stios de restrio. O polimorfis-
mo detectado pela digesto dos produtos
de amplificao com enzimas de restrio
adequadas, gerando ento o marcador
cleaved amplified polymorphic sequences
(CAPS) (KONIECZNY; AUSUBEL,
1993). Tais marcadores apresentam as van-
tagens prticas da tcnica do PCR, manten-
do anatureza.co-dominante do RFLP. Uma
alternativa para a genotipagem de SNP
a tcnica de derived cleaved amplified
polymorphic sequence (dCAPS), proposta
Informe Agropecurio,
Biotecnologia
.._----- _._------_ .. _-----_._.-
por Neff et al, (1998), onde a tcnica de
PCR utilizada para introduzir diferenas
de nucleotdeos e, assim, criar um poli-
morfisrno com base na mutao alvo. Essa
tcnica uma alternativa interessante nos
casos em que o SNP a ser genotipado no
cria ou elimina stios de restrio, inviabi-
lizando a utilizao da tcnica de CAPS.
Neff et al. (1998) desenvolveram o software
dCAPs Finder, que pode ser utilizado para
marcadores do tipo dCAPS.
A converso de marcadores RAPD em
pares de primers especficos foi inicial-
mente realizada por Paran e Michelmore
(1993), sendo denominada sequence
characterized amplified regions (SCAR),
com a vantagem da especificidade da am-
plificao para a regio alvo em relao ao
RAPD. Fragmentos gerados pela tcnica
de AFLP tm sido convertidos em STS
polirnrficos e especficos para locos de
interesse.
SNPs e InDe/s
Os polimorfismos de nucleotideos
nicos ou SNPs so as variaes mais
frequentes no genoma de qualquer orga-
nismo. Estima-se que a frequncia desse
polirnorfismo seja de uma substituio a
cada 3\ pares de base em regies no co-
dificadoras e a cada 124 pares de base em
regies codificadoras em milho (CHING et
al., 2002). Em soja, estima-se a frequncia
de um SNP a cada 2.038 pares de bases em
regies ccdificadoras, e um SNP a cada 19\
pares de bases em regies no codificado-
ras (ZHU et al., 2003). Por sua abundncia
no genorna e pela lenta taxa de mutao
dentro de geraes, os S'N'Psprometem ser
a futura gerao de rnarcadores genticos
de grande aplicao em processos de geno-
tipagem em larga escala (USECHE et al.,
2001). Outra classe de polimorfismo que
tem sido muito explorada a presena de
pequenas inseres e delees, que variam
de um a trs nucleotdeos. conhecidas na
literatura como InDels.
http://wwv.,3.appliedbiosystems.com
Belo Horizonte v.30, n.253, p.xx-xx, nov./dez. 2009
 Biotecnologia 27
------ _._---_ .._._._------_. _._-_._._ ...__ __ ._----
..

Os SNPs e os InDels so as bases ge- baixo custo, envolvendo uma nica rea- dos primers internos e a base do alelo
nticas da maioria das variaes allicas o de PCR seguida de eletroforese em alternativo do SNP, como mostrado na
e podem ser tratados como marcadores gis de agarose ou poliacrilamida, Essas Figura 2. Para aumentar a especificidade,
biallicos, possuindo amplas aplicaes caractersticas permitem a sua aplicao um segundo erro adicionado deliberada-
no mapeamento gentico de alta resoluo em programas de melhoramento gentico mente na posio -2, a partir do terminal 3'
e em testes diagnsticos. Tais marcadores vegetal, em laboratrios com estruturas (indicado por um asterisco na Fig. 2). O
podem ser identificados in silico, explo- mais simples. Dentre estas, destaca-se a sistema pode ser desenhado para ensaios
rando os bancos de dados pblicos e mais tcnica amplification refraciory mutation co-dominantes, com a amplificao simul-
recentemente pelo ressequenciamento de system (ARMS-PCR), descrita por Ye et tnea dos dois alelos (sistema de quatro
genomas completos. Useche et aI. (2001) al, (2001). O sistema ARMS-PCR consiste primers) ou amplificao em separado
identificaram 2.439 SNPs e 822 InDels no da amplificao com uma combinao de para cada um dos alelos (sistema de trs
banco pblico contendo 68 mil ESTs de dois primas alelo-especlficos, um para primers (BUNDOCK et al., 2006)). No
milho, utilizando algortmos com interfa- cada alelo SNP, e dois primers externos e sistema ARTvlS, importante notar que
ces especificas entre diferentes bancos de comuns (Fig. 2). Os dois amplicons alelo- o desenho de primers compatveis para

dados". Assim, tais marcadores tm gerado especficos so gerados pela combinao amplificao simultnea , muitas vezes,

x.> dados em larga escala, de maneira auto- de cada um dos primers externos com desafiador. Programas, com base em web!

matizada e a custos reduzidos, sendo teis cada um dos primers alelo-especficos. esto disponveis para essa finalidade e au-

para a construo de mapas genticos de A especificidade allica conferida por xiliam na escolha dos primers ideais, para

alta densidade, para estudos de associao uma diferena entre a base no terminal 3' o sistema de trs e quatro primas.

gentica e para seleo assistida com base

no genoma completo.
Uma vez identificados in silico, os -------------------------------.--------------------,
marcadores precisam ser convertidos em ~A
Moldede DNA
pares de primers especficos (STS), que
(AlelaG) -----~--------------------~.~~.,----------------------
amplifiquem apenas a regio que contm
Primer externo g*+-
Primers internos
a mutao, para posterior validao e Primer externo
---+ --+ f\
mapeamento destes. No caso de /nDels, Moldede DNA
(Alelo A)
----------------------~.A-------------------
---------------------------T-.---------------------
as inseres/delees de nucletdeos po-
dem ser reveladas diretamente em gis de
sequenciamento dos produtos de amplifi-
~ PCR
cao, uti lizando um dos primers marcados
Produtode PCR
com fluorescncia ou radioatividade. Para
no especfico G__
a deteco das substituies de base, que
'---"
ocorrem nos SNPs, tm sido desenvolvidas
Produtos de PCR
especficos para
==============c--
vrias estratgias, normalmente utilizando- cada alelo G e A
--A:=========
-r
se etapas adicionais de extenso de primas
que ancoram a uma base de distncia do
I Gel de
eletroforese
SNP, aps a amplificao do fragmento de
Homozigoto G/G Homozigoto A/A Heterozigoto G/A
DNA que contm a sequncia alvo. Vrias
tcnicas tm sido adaptadas para revelar os
SNPs, como a extenso de primers, que
utiliza a deteco por espectroscopia de
massa e PCR em tempo real. l ~
No entanto, importante o desenvol- Figura 2 - Esquema de amplificao pela tcnica ARMS utilizando quatro primers
vimento de sistemas para a visualizao FONTE: Ye et 01. (2001).
dos SNPs, que sejam mais simples e de NOTA: DNA - cido desoxirribonucleico; PCR- Po/ymerase chain reaction.

6 Ests= Expressed sequence tags.

7 Disponvel no site: http://wheat.pw.usda.gov/demosIBatchPrimer31

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 28 Biotecnologia

As tecnologias de sequenciamento de noma, sendo de grande potencial para a tlites para formao de grupos heterticos
prxima gerao tm disponibilizado uma avaliao da diversidade gentica, tanto em milho, obtiveram formao de grupos
quantidade muito grande de informaes para aplicaes filogenticas e evolutivas, semelhantes queles obtidos por meio de
de SNPs, que tem recebido plataformas quanto para fins prticos em programas de cruzamentos testes. No entanto, o agrupa-
para genotipagem simultnea de milhares melhoramento gentico e na manuteno mento que utilizou marcadores molecu-
de marcadores a custos reduzidos, como de bancos de germoplasma. Os gentipos lares foi realizado em um ms, enquanto
Golden Gate da Illuminae e OpenArray so avaliados por meio dos rnarcadores, as que a obteno dos resultados de avaliao
da Applied Biosystemsr. bandas comuns a todos os indivduos so dos cruzamentos testes necessitou de dois
interpretadas como semelhanas genticas ciclos da cultura do milho. Alm disso, na
SfP e as bandas no-comuns, como diferenas. avaliao fenotipica, muitos dados foram
Os microarranjos de DNA ou chips, Os resultados so codificados, a fim de ge- perdidos, em funo da instabilidade cli-
que contm oligonucleotdeos desenha- rar uma matriz de similaridade ou dissimi- mtica durante os perodos de avaliao.
dos para estudos de expresso gnica, laridade, interpretada por meio de anlise Um conjunto de 770 linhagens de milho,
esto sendo usados para a gerao de de agrupamento ou multivariada. representando germoplasmas melhorados
polimorfismos para genotipagem em A escolha dos genitores e o plane- do Mxico, China e Brasil, foi avaliado
'-.....-_t:?,rande
escala, denominados singlefeature jamento dos cruzamentos so etapas de com 1.034 SNPs, sendo possvel separar
polymorphism (SFP). Tais marcadores fundamental importncia para o sucesso claramente as linhagens temperadas e tro-
tm sido identificados com sucesso desde de um programa de melhoramento. Essas picais (LU et al., 2009). Entre as linhagens
genomas simples como arroz (KUMAR et etapas podem ser auxiliadas por marcado- da China e do Brasil foi possvel definir os
al., 2007), at genomas complexos como res moleculares e fornecem aos melhoristas agrupamentos em funo da genealogia,
trigo (BERNARDO et al., 2009), os quais informaes genticas adicionais e mais sendo tambm definido um conjunto de

apresentam elevada capacidade de amos- detalhadas dos gentipos, aumentando a SNPs mais informativos entre as colees
tragem genrnica, utilizando a mesma probabilidade de obteno de cultivares de germoplasma de diferentes origens.
estrutura e os chips de DNA aplicados em superiores. A seleo de genitores supe-
riores mais crtica em espcies perenes, DNA fingerprinting e
anlise da expresso global.
proteo de cultivares
Cada polimorfismo avaliado pela como fruteiras e essncias florestais, uma

presena ou ausncia de sinais derivados vez que o tempo para obteno de uma A caracterizao de variedades, linha-
da hibridizao do DNA genmico, mar- cultivar melhorada bastante longo. gens ou hbridos, por meio de marcadores
cado com os oligonucleotdeos impressos Oliveira (2009) obteve uma correlao de DNA, tem sido de grande importncia

nos chips, como os da Affymetrix". Alm de 63% entre as distncias genticas con- na proteo intelectual do obtentor, sendo

dos microarranjos j disponveis, existe a seguidas por marcadores microssatlites e utilizada como prova legal em processos

possibilidade de desenvolver chips para as distncias obtidas pela genealogia de 32 jurdicos nos pases onde vigoram as leis de

genotipagem por SFP pelo alinhamento das cultivares brasileiras de soja, originrias proteo de cultivares. Com a aprovao,

sequncias genmicas e de ESTs pblicas, de um nico programa de melhoramento. no Brasil, da Lei de Proteo de Cultivares

culminando com desenho de sondas de 70 A anlise de agrupamento realizada com (BRASIL, 1997), o Servio Nacional de

pares de base que cobrem todo o genoma dados de marcador es microssatlites Proteo de Cultivares (SNPC), vinculado

da espcie alvo. coincidiu perfeitamente com a origem das ao Ministrio da Agricultura, Pecuria e
cultivares, com base em sua genealogia. Abastecimento (tv'IAPA), ficou respon-
APLICAES DOS Esse autor ressalta, ainda, que os dados de svel pelo registro e proteo de novas
MARCADORES MOLECULARES genealogia nem sempre esto disponveis, variedades. Para que uma variedade seja
NO MELHORAMENTO enquanto as informaes dos marcadores protegida, necessrio demonstrar que
GENTICO sempre podem ser obtidas com acurcia. diferente de qualquer outra variedade da
A caracterizao de linhagens de milho mesma espcie. Apesar de o processo para
Diversidade gentica e
em grupos heterticos de fundamental a proteo de cultivares ser realizado com
seleo de genitores
importncia na escolha dos genitores base em descritores morfolgicos, os mar-
Os diferentes tipos de marcadores para a obteno de hbridos com elevada cadores moleculares tm sido estimulados
moleculares disponveis apresentam uma performance agronmica. Aguiar et al, e aceitos nos processos para a identificao
ampla capacidade de amostragem do ge- (2008), ao utilizarem marcadores microssa- de cultivares.

"Consultar o site: hup.r/www.affimetrix.com

Informe Agropecurio, Belo Horizonte, v.30, n 253, p xx-xx, nov./dez. 2009

 Biotecnologia
Um sistema com base em marcadores
de DNA perrn ite a identificao de um
padro nico de combinao allica, como
uma impresso digital (fingerprinting) para
cada cultivar, facilitando sua proteo e
assegurando os direitos de propriedade
intelectual. A capacidade de discriminao
dos mtodos de fingerprinting molecular
depende do nmero de marcadores utiliza-
dos e da frequncia allica para cada loco
dentro de uma populao representativa
da espcie. Ao avaliar um conjunto de 32
cultivares de soja de um mesmo programa
de melhoramento, portanto com grande
probabilidade de ser estreitamente rela-
"--' cionadas, Oliveira (2009) selecionou um
conjunto de li marcadores microssatlites,
que identificaram todas as cultivares com
no mnimo 99,9999% de probabilidade
de excluso. Foram distinguidas inclusive
duas cultivares que possuam 99,22%
de similaridade gentica, com base na
genealogia.
Anlise de pureza gentica
de sementes
Da mesma forma como os marca dores
de DNA so teis na identificao de cul-
tivares, tornam-se tambm uma importante
ferramenta na identificao das misturas
varietais em anlises de pureza gentica de
sementes, com a finalidade de certificao
ou fiscalizao de sementes. Comumente,
misturas varietais so identificadas com
base em grow out no campo ou em ca-
ractersticas morfolgicas de sementes e
plntulas ou, em alguns casos, pela eletro-
forese de protenas da semente. Em soja,
por exemplo, a anlise de pureza gentica
de sementes feita comumente pela cor do
hilo e do hipoctilo e reao peroxidase.
Esses caracteres so pouco informativos,
pois tanto a cor do hipoctilo, quanto a rea-
o peroxidase s permitem dois resulta-
dos possveis, sendo que a combinao de
ambos s permite classificar as variedades
em quatro grupos distintos.
9/mp://www.ufv.br/dbg/gqmol/gqmol.him
Informe Agropecurio, Belo Horizonte,
Cor de hilo apresenta um nmero maior
de resultados possveis. representados pe-
las diversas cores e tonalidades existentes,
que podem ser alteradas em funo de
condies ambientais. Por exemplo, va-
riedades com hilo preto imperfeito podem
ser confundidas com variedades de hilo
preto ou mesmo marrom. Anlises mole-
culares tem demonstrado que nem sempre
a diferena na cor do hilo significa mistura
varietal. Em alguns casos, sementes de hilo
preto imperfeito encontradas em lotes de
sementes de hilo marrom so geneticamen-
te idnticas.
Marcadores de DNA so uma ferra-
menta auxiliar e poderosa na anlise de
pureza gentica de sementes e outras fontes
de propagao, tais como mudas, estoles,
estacas, borbulhas, etc .. aplicvel sempre
que a caracterizao visual gerar dvidas.
Essa anlise tem sido feita explorando-
se ao mximo a representatividade do
genoma, pela utilizao de primers bem
distribudos em mapas genticos da esp-
cie. Schuster et al. (2004) descrevem uma
metodologia prtica para a utilizao de
marcadores microssatlites na avaliao
de pureza gentica de cultivares de soja
que pode ser facilmente estendida para as
demais culturas.
Mapeamento de genes e
caractersticas complexas
Os avanos nas reas dos rnarcadores
moleculares e das metodologias estatsticas
implementadas em programas computacio-
nais tm aumentado a saturao dos mapas
genticos e. consequenternente, a preciso
na identificao de marcadores associados
com as caractersticas de interesse. Para
um marcador ser utilizado no mapeamento
gentico, este deve ser polimrfico entre
os indivduos parentais e apresentar uma
segregao mendeliana esperada na pro-
gnie. Vrios tipos de populaes segre- marcadores moleculares funo da mag-
gantes podem ser utilizadas na construo
de mapas genticos, como F2' linhagens
recombinantes endogm icas - recombinant
v.3D, n.253, p.xx-xx, nov./dez. 2009
29
inbred fines (RILs) e de retrocruzamentos,
tendo cada uma vantagens e limitaes.
Vrios programas computacionais esto
disponveis para a construo de mapas
de ligao, sendo alguns pblicos como o
MapMaker (LANDER et aI., 1987), One-
Map (MARGARIDO; SOUZA; GARCIA,
2007) e GQMOL9.
O grande objetivo da construo de
mapas genticos identificar marcadores
moleculares associados s caractersticas
de interesse. H uma infinidade de tra-
balhos que reportam ao mapeamento de
genes e ao QTLs em diferentes espcies.
Resistncia a doenas tem sido uma ca-
racterstica alvo para esse tipo de estudo,
uma vez que a identificao de marcadores
ligados a genes de resistncia permite mo-
nitorar a introgresso e a piramidao de
dois ou mais genes de resistncia em uma
cultivar ou linhagem comercial.
Garcia et a!. (2008) e Silva et a!. (2008)
rnapearam os genes Rpp5, Rpp2 e Rpp4,
que conferem resistncia ferrugem da
soja. Adicionalmente, mapeamento de
genes um passo importante para a elo-
nagem de genes.
A maioria das caractersticas de impor-
tncia econmica est sob controle genti-
co complexo, envolvendo a ao de vrios
genes, o que torna difcil sua manipula-
o e compreenso. Regies genmicas
contendo locos gnicos associados a tais
caracteres quantitativos so denominados
QTLs. Marcadores moleculares analisados
por metodologias estatsticas implemen-
tadas em programas de mapeamento de
QTLs tm possibilitado a dissecao dos
caracteres complexos em fatores mende-
lianos simples. O rnapeamento de QTLs
possibilita estimar o nmero e a localizao
de genes que controlam a variao fenoti-
pica de um carter, a magnitude dos seus
efeitos e as interaes com outros QTLs. A
habilidade de detectar QTLs por meio de
nitude do efeito do QTL, do tamanho e do
tipo da populao e do nvel de saturao
do mapa gentico.
 30
-_ .... __ .... _---- --- ._---_ __Biotecnologia
_.
....

o mapeamento de QTLs baseia-se os alelos B e b, em frequncias de Ps e I -PB' Melhoramento gentico

em testes de associao entre marcadores ento, no equilbrio, mesmo que os locos assistido por marcadores
moleculares e os dados fenotpicos por estejam ligados, a frequncia esperada de moleculares
meio de vrias metodologias estatsticas, um determinado hapltipo o produto
Retrocruzamento assistido
cujos procedimentos podem ser vistos das frequncias dos alelos constituintes
com mais detalhes em vrios livros espe- desse hapltipo. Por exemplo, a frequncia A utilizao de marcadores rnolecula-
cializados como, Schuster e Cruz (2008), esperada do hapltipo AB, no equilbrio, res em programas de introgresso de genes
dentre outros. De f01111abastante resumida, PAS=PAXPB'O desequilbrio de ligao por meio de retrocruzamento um dos
os mtodos para mapeamento de QTLs a diferena D=PAB-(p"xPB)' No equilbrio, exemplos mais concretos de melhoramento
avanaram desde a associao com mar- D=O (MACKA Y; POWELL, 2007). assistido por marcadores. Germoplasmas
cas simples, passando pelo mapeamento O mapeamento por desequilbrio no-adaptados tm sido utilizados em pro-

por intervalo simples, mapeamento por gramas de melhoramento com o objetivo

de ligao, tambm conhecido como
intervalo composto, por mltiplos QTLs, de introduzir caractersticas de herana
mapeamenro de associao. detecta e lo-
simples, como resistncia a doenas ou
at o mapeamento por intervalos mltiplos. caliza Q1'Ls com base na intensidade da
transgenes. A seleo pode ser feita para
"rogramas especficos para o mapeamento correlao entre marcadores moleculares
monitorar o gene de interesse ou o genoma
'-de QTLs, contendo algortmos apropriados mapeados e as caractersticas fenotpicas.
recorrente, visando reduo do tempo
para implementar vrios dos procedimen- O desequilbrio de ligao entre dois locos
para obteno de linhagens convertidas e
tos estatsticos descritos esto dispcnveis funo do tempo (nmero de geraes)
aumento da eficincia do programa, princi-
para acesso pblico, como Q'Tl.Cartogra- decorrido, desde que se iniciaram as ge-
palmente quando se objetiva a piramidao
pher'" e GQMOL. raes de recornbinao e a frequncia de
de dois ou mais genes de interesse.
Mtodos de mapeamento de popula- recornbinao entre os locas. Aps vrias
Diferentes estratgias de retrocruza-
es derivadas de cruzamentos biparentais geraes de recornbinao, em uma popu-
mento assistido podem ser aplicadas de-
amestram apenas uma pequena frao de lao no estruturada, apenas correlaes
pendendo dos objetivos, sendo que o custo
todos os posstveis alel os em uma determi- entre QTLs e marcadores proximamente
com as genotipagens pode ser compensado
nada espcie. Por esse motivo, marcadores ligados devem permanecer, facilitando
pela reduo significativa no nmero de ge-
moleculares associados a Q1'Ls geralmente o mapeamento mais fino (MACKAY;
raes para recuperar o genorna recorrente,
s podem ser usados nas populaes em POWELL, 2007). principalmente com o alto valor agregado
que foram desenvolvidos. Recentemente, Para o rnapeamento por desequilbrio
de um evento transgnico (GUIMARES
a utilizao do desequilbrio de ligao, de ligao, no h necessidade de preparar et al., 2009). Ainda, considerando a sig-
ou seja, a associao no ao acaso entre uma populao de mapeamento e o genoma nificativa reduo dos custos das novas
alelos em locos ligados, tem sido utilizada inteiro avaliado para identificar regies tecnologias de marcadores, em situaes
para realizar o mapeamento por associa- associadas a um fentipo em particular. O onde o fentipo de avaliao complexa,
'-. o. Diferentemente do mapeamento de primeiro obstculo para essa anlise de as- a seleo com marcadores rnolecuiares
ligao (equilbrio de ligao), o mapea- sociao a presena, dentro da populao, fornece a vantagem adicional na reduo
mento por desequilbrio de ligao infere de subgrupos com distribuio desigual de dos custos e na seleo precoce dos indi-
a associao entre gentipos (hapltipos) alelos. Nesses casos, falsas associaes vduos de interesse.
e a caracterstica, pela avaliao do po- positivas entre marcadores e fentipo
limorfismo gentico que foi gerado em podem ser identificadas, mesmo que no SAM
diferentes backgrounds genticos e por haja ligao fsica entre os marcadores e A seleo de caractersticas simples
meio de muitas geraes de recombinao os genes (BUCKLER; THORNSBERRY, com o auxlio de marcadores moleculares
(DEKKERS; HOSPITAL, 2002). 2002). Por esse motivo, a primeira etapa tem grande utilidade, quando a caractersti-
O desequilbrio de ligao definido no mapeamento por associao (desequi- ca de difcil medio ou quando se deseja
como a associao no ao acaso, de alelos lbrio de ligao) identificar a existncia selecionar para di versas caractersticas
em locos diferentes do mesmo cromosso- de subgrupos. Isso pode ser feito pela simultaneamente, como no caso de pira-
mo. Se for considerado que um determina- construo de uma matriz de similaridade midao de genes. No entanto, a seleo
do loco possui os alelosA e a com frequn- gentica, estimada a partir dos marcadores assistida por marcadores (SAM) tem sua
cias de p A e l-p A' e um segundo loco possui moleculares. maior contribuio na seleo de caracte-

"Disponivel 110 site: http://statgel1.lIcsll.edu/qilcart/cartographahtrnl

Informe Agropecurio, Belo Horizonte. v.30, n.253, p.xx-xx, nov.ldez. 2009

Biotecnologia 31

rsticas quantitativas. Associaes entre computacionalmente mais simples do que melhorar a performance para diversas
alelos de marcadores moleculares e alelos o mtodo da mxima verossimilhana, caractersticas simultaneamente, o nmero
de QTLs podem ser usadas para selecionar, produzindo resultados muito similares de QTLs envolvidos em um programa de
indiretamente, alelos favorveis de QTLs. (LANDE; THOMPSON, 1990). melhoramento facilitado por marcadores
Para caracteres de baixa herdabilidade, a Os resultados de estudos tericos e ex- moleculares deve ser grande. Pela natureza
seleo fenotpica realizada em geraes perimentais permitem concluir que a SAM intrnseca dos QTLs e pelo fato de carac-
mais avanadas, pois a herdabilidade e pode ser utilizada para aumentar substan- teres quantitativos serem controlados por
a acurcia estatstica da estimao das cialmente a eficincia dos programas de um grande nmero de genes de pequeno
mdias das prognies aumentam com o melhoramento (ED\VARDS; STUBER; efeito, a seleo recorrente assistida por
aumento do nmero de repeties, gera- WENDEL, 1987; STUBER: EDWARDS; rnarcadores moleculares uma escolha
es, locais e anos de teste, o que leva a WENDEL, 1987; LANDE; THOMPSON, apropriada para o melhoramento de po-
um aumento muito grande do nmero de 1990). A eficincia da seleo assistida pulaes. Por meio de ciclos sucessivos
plantas a ser avaliado. Assim, os melhoris- por marcadores, comparada com a seleo de intercruzamentos e seleo, a seleo
tas devem optar entre produzir estimativas fenotpica, afetada por diversos fatores, recorrente favorece a quebra de ligaes
mais precisas da mdia de um nmero tais como, herdabilidade da caracterstica, genticas, o que facilita a recornbinao

menor de prognies ou amostrar um gran- cobertura do genoma pelos marcadores, entre genes e aumenta a frequncia de

de nmero de prognies, com estimativas identificao de associao entre marcado- alelos favorveis nas populaes de me-

menos precisas. A SAM apresenta-se como lhoramento. O uso da seleo assistida

res e QTLs, tamanho e nmero de famlias,
uma alternativa eficiente para permitir a por marcadores moleculares permite a
tipo de populao e escolha do mtodo
identificao de combinaes favorveis de
seleo precoce de caractersticas de baixa de seleo assistida por marca dores. A
alelos, permitindo maiores ganhos com a
herdabilidade. A seleo precoce diminui seleo que utiliza marcadores flanque-
seleo. Xie; Xu (J 998) apresentaram uma
o nmero de plantas a ser analisado por ando o QIL tambm mais eficiente do
comparao terica entre diversos mtodos
famlia, o que permite a avaliao de um que a seleo que se baseia em um nico
de seleo recorrente com base em fam-
nmero muito maior de prognies. A SAM marcado r. LAJ\1DE; THOMPSON (1990)
lias e seleo massal, utilizando SAM e
mais efetiva em geraes iniciais de sele- propuseram a teoria do ndice de seleo,
seleo fenotpica. A seleo recorrente
o entre prognies de cruzamentos entre utilizando marcadores, que maximizam a
assistida por marcadores foi duas vezes
linhas endogmicas. Nessas geraes, a taxa de ganhos genticos pela combinao
mais eficiente do que a seleo fenotpica,
herdabilidade baixa, pois o nmero de das informaes do polimorfismo nos locos
com famlias de tamanho pequeno, baixa
repeties limitado e o desequilibrio de dos marcadores genticos com dados da
herdabilidade e alta proporo da variao
ligao alto. O paradoxo que o poder variao fenotpica entre os indivduos.
fenotpica explicada pelos marcadores (P).
de mapeamento de QTLs decresce, Esse ndice pode ser usado tanto para a
Com o aumento do tamanho da populao,
medida que a herdabilidade decresce, e seleo individual, como para a seleo
aumento da herdabilidade e diminuio
menor justamente para caractersticas que de linhas. Porm, a utilizao desse ndice
de p. a vantagem da seleo assistida por
teoricamente sofreriam o maior impacto requer testes de prognies com repeties,
marcadores diminuiu. Seleo assistida
pela SAM (LANDE; THOMPSON, 1990). para a obteno dos valores fenotpicos. A por marcadores mais competitiva com a
Para evitar a deteco de falsas associaes seleo que se baseia apenas em marcado- seleo fenotpica tradicional, quando a ca-
entre marcadores e QTLs, um nvel de res pode ser utilizada e possui eficincia racterstica possui baixa herdabilidade. Se
significncia bastante alto utilizado para semelhante ao ndice, quando p>0,5 para o objeti vo do programa de melhoramento
se declarar associao entre um marcador e caractersticas de baixa herdabilidade, maximizar a resposta por unidade de custo,
um QTL. A utilizao de nveis de signifi- sendo p a proporo da varincia gentica a SAM pode ser inferior seleo fenor-
cncia bastante estringentes na escolha dos aditiva da caracterstica que associada pica, quando a herdabilidade superior a
marcadores aumenta a acurcia da SA\tl e com o loco marcador. 30% e o custo da avaliao fenotpica por
produz ganhos significativos desta sobre a Muitas caractersticas de importncia indivduo menor do que a genotipagem
seleo fenotpica. Trabalhos mais recentes econmica so afetadas por vrios QTLs. do loco marcador.
tendem a utilizar a regresso mltipla do Alm de. em muitos casos, os QTLs O nmero de artigos cientficos publi-
fentipo aos rnarcadores, como o mtodo para diferentes caractersticas apresenta- cados anualmente com o termo marker-
de identificar a associao entre marca- rem-se ligados (STUBER; EDWARDS; assisted selection ultrapassou a barreira
dores e QTLs, e estimar o efeito dos mar- WENDEL, 1987; EDWARDS; STUDER; de mil, no ano de 2003 (XV; CROVCH,
cadores (LANDE; THOMPSON, 1990). WENDEL, 1987). Como na maioria dos 2008). No entanto, a quase totalidade
Regresso mltipla um procedimento programas de melhoramento, o objetivo desses artigos procura demonstrar a apli-

Informe Agropecurio. Belo Horizonte, v.30, n.253, p.xx-xx, nov./dez. 2009

32 Biotecnologia

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