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Nmero de recambio
sin enzima (mol de Ps-1)
Nmero de recambio S P
con enzima (mol de Ps-1)
Actividad enzimtica
(mol de Ps-1)
Actividad enzimtica
La actividad de una enzima se expresa en el Sistema
Internacional de Unidades en katales (kat). Un Katal
representa la cantidad de enzima necesaria para
incrementar el nmero de recambio de una reaccin en un
mol por segundo.
1 Kat = 1mols-1
Actividad enzimtica
Sin embargo, la Comisin de Enzimas de la Unin
Internacional de Bioqumica recomienda es uso de la Unidad
Internacional (UI) para expresar la actividad enzimtica,
puesto la magnitud de un katal es muy grande para la mayor
parte de las enzimas. Una UI es la cantidad de enzima que
cataliza la transformacin de 1 mol de sustrato por minuto
bajo condiciones estndares.
1UI = 1 molmin-1
Actividad enzimtica
Cmo se determina la actividad enzimtica ?.
Considere la reaccin: V
s p
v
r P
S
Fs, s, p
Realizando un balance de masa:
dp ds
vr
dt dt
Actividad enzimtica
Por lo tanto, para un reactor por lotes
dp ds
v r t 0 Act. enzimtica
dt t 0 dt t 0
0.5
0.4
P (mmol/L)
0.3
0.2
=Velocidad
0.1 inicial
0
0 10 20 30
Tiempo (min)
Actividad enzimtica
Por qu la actividad enzimtica se cuantifica a travs
de la velocidad inicial de reaccin?
- Inactivacin enzimtica
- Desnaturalizacin del sustrato
- Inhibicin por productos
- Desplazamiento del equilibrio
- Cambios de pH
- etc.
vr Act Act
s pH Temp
Sustrato saturante pH ptimo Temperatura ptima
Ejemplo: Actividad enzimtica
Se desea determinar la actividad de un preparado liquido de
invertasa. Experimentalmente se han obtenido el resultados que
mostrados en la tabla:
Invertasa
Sacarosa Glu cos a Fructosa
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min)
Resolucin
g glucosa 1mol glucosa 106 mol mol
vr 0.0854 474.44
L min 180g glucosa 1mol L min
Nmero de recambio vr V
mol 0.010 L mol
Nmero de recambio 474.44 47.75
L min 1 min
Vr V
Actividad especfica fd
VEnz
mol
47.75
min mol UI
Actividad especfica 7 668.5 668.5
0.5 mL enzima minmL enzima mL enzima
Datos:
Peso molecular glucosa (PM) = 180 g/gmol
Volumen de reaccin= Vol enzima + Vol sustrato
Volumen de reaccin = 10 mL
Factor de dilucin = 7
Anlisis cintico
Consiste en la evaluacin del efecto de cada uno de los
factores que intervienen en la expresin de la actividad
enzimtica. Dichos factores son evaluados
cuantitativamente, a travs de la determinacin de la
velocidad inicial de reaccin.
mA + nB qC
1 da 1 db 1 dc
vr
m dt n dt q dt
- a y b representan la concentracin de A y B
respectivamente.
- k es la constante de velocidad
A+ A A2 (reaccin elemental)
A+ A A2
+ A2BC + D E
2A + B + C + D E (reaccin no elemental)
Ley de Velocidad
Ejemplo: Suponga que experimentalmente se ha determinado
que los exponentes u y t son ambos iguales a 1. Por tanto, la
ley de velocidad para la reaccin es:
vr k a b
As se tiene que:
Velocidad
Velocidad
a a a
Cintica de Michaelis-Menten
La cintica enzimtica fue motivo de gran inters a
principios del siglo XX; intrigando a los cientficos ya que
dependiendo de la concentracin de sustrato sta muestra
diferentes ordenes de reaccin.
Orden cero
vr
Primer orden
s
Cintica enzimtica
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron un
mecanismo que explica el comportamiento cintico de la
mayor parte de las enzimas :
k1 kcat
E+S k-1
ES E+P
Donde:
k1 es la constante de velocidad de formacin del complejo
ES
k-1 es la constante de velocidad de disosiacin del
complejo ES
kcat es la constante de velocidad de formacin de producto
(P).
Mecanismo de Michaelis-Menten
Michaelis-Menten se propusieron la hiptesis equilibrio rpido,
la cual establece que la primera parte del mecanismo:
k+1
E+S k-1 ES
vr k cat es
K M es K
Se obtiene que e0 es 1 M es
s s
Mecanismo de Michaelis-Menten
En consecuencia la velocidad de generacin del
producto es:
e0
vr k cat
K
1 M
s
Reorganizando los trminos
k cat e0 s Vmax s
vr
KM s KM s
Donde :
Vmax k cat e0
Cintica enzimtica
Como se ha dicho, el mecanismo cintico de una enzima
se puede ser explicado en base a las hiptesis de equilibrio
rpido (Michaelis-Menten). Sin embargo, no es la nica
hiptesis que lo explica. En 1925 Briggs-Haldane propusieron
la hiptesis de estado pseudo estacionario para el complejo
ES (Briggs-Haldane), la cual tiene mayor sustento terico.
Hiptesis de estado estacionario
La hiptesis de estado
pseudo estacionario asume
que luego de un estado
transiente inicial muy breve,
se alcanza un estado pseudo
estacionario donde la
variacin de la
concentracin del complejo
ES en el tiempo resulta
insignificante frente a la
variacin de S y P.
Hiptesis de estado estacionario
consideran do que : s e0 es
d(es) Hiptesis de
k1 e s k 1 es k cat es 0 estado
dt pseudoestacionario
k1 e s (k 1 k cat ) es
(k 1 k cat ) e s
k1 es
Hiptesis de estado estacionario
Realizando un balance a la enzima
e0 e es e e0 es
(k 1 k cat )
(e0 es) s es
k1
(k k cat )
e0 s 1 s es
k1
e0 s
es
(k 1 k cat )
s
k1
Hiptesis de estado estacionario
Luego si :
vr k cat es
se obtiene que :
e0 s (k cat e0 ) s V s
vr k cat max
(k 1 k cat ) (k k cat ) KM s
s 1 s
k1 k1
donde :
Vmax k cat e0
k 1 (k 1 k cat )
KM dado que : k 1 k cat
k1 k1
Cintica enzimtica
A partir de las hiptesis de equilibrio rpido y estado pseudo
estacionario, llegamos a la ecuacin
VMax * s
vr =
KM + s
vr
Vmax
KM S
Interpretacin de KM
VMax
k cat
e0
VMax s 1 KM 1 1
vr
KM s v r VMax s VMax
Problemas:
1
vr
VMax
1
KM
KM
1
VMax 1
s
Linealizacin de Hanes-Wolf
Reordenando la ecuacin de Michaelis-Menten.
VMax s s K Max 1
vr s
KM s v r VMax VMax
s
vr
1
KMax VMax
KM
VMax
s
Linealizacin de Eadie-Hofstee
Reordenando la ecuacin de Michaelis-Menten.
VMax s vr
vr vr KM VMax
KM s s
KM VMax
KM
vr
s
Mtodos de linealizacin
1 y = 0.0873x + 0.14
0.8 R = 0.9987
1/vr
0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8 10 12 Hanes-Wolf
1/s 2
y = 0.1428x + 0.084
1.5 R = 0.9998
s/vr
1
0.5
0
0 5 10 15
s
Ej: Determinacin parmetros cinticos
Eadie-Hofstee
8
y = -0.6028x + 7.041
6
R = 0.9888
S
0
0 2 4 6 8 10 12
vr//s
inhibidor
Los efectores pueden negativos
inactivador
Temperatura
Inactivadores pH
Solventes orgnicos
Inhibicin competitiva
Inhibidores Inhibicin no competitiva
Inhibicin mixta, etc.
15 40 75
Temperatura
Donde:
A es la constante preexponencial
k
Eact d Einact
Ea,d
k d A exp
RT
Dado que Ea,d>>Ea, aumentos en la temperatura incrementan en mayor
medida la velocidad de inactivacin que la de reaccin.
Efecto del temperatura
Estabilidad
Actividad
Temperatura
Efecto del pH
Vr
Vr
E. libre
tiempo
Inmovilizacin enzimtica
- Desarrollo de sistemas continuos - Costos adicionales: soportes,
reactivos y operacin de
- Uso mas eficiente del catalizador inmovilizacin.
(Reutilizacin)
- Perdida de actividad
- Efluentes libres de catalizador
- Restricciones difusionales e
- Menor costo de mano de obra impedimentos estricos
Velocidad de reaccin
Estabilidad de la enzima (soluble/inmovilizada)
Costos
Propiedades fsico-qumico
Propiedades mecnicas e hidrodinmicas.
Seleccin de la modalidad de reaccin.
otras
Inmovilizacin enzimtica
Capa estancada
biocatalizador
Efectos de la inmovilizacin
Efectos conformacionales: relacionados con la alteracin de
la estructura de la molcula enzimtica
- Efectos de particin
- Restricciones difusionales (internas y externas)
Cintica de las enzimas
inmovilizadas
Cintica intrnseca: aquella que se observara en ausencia
de efectos de particin y de restricciones difusionales.
E.
H+ Inmovilizada
-
Actividad
- -
- -
E. Libre
- -
pH
Efectos de particion
Las propiedades hidrofbicas y /o electrostticas del soporte
pueden modificar considerablemente la concentracin de las
especies qumicas al interior del catalizador, generando un
microambiente significativamente diferente al del seno del
liquido.
Restricciones
Difusionales
internas
Restricciones
Difusionales
externas
Restricciones difusionales
Restricciones difusionales externas (RDE):
'
VMax s s
h (s0 ss )
'
KM ss
Donde:
h es el coeficiente volumtrico de transferencia de masa en la pelcula estancada [L3T1]
s0 , ss son la concentracin de sustrato en el seno del liquido y en la superficie del catalizado
[ML-3 ]
VMax es la velocidad mxima de reaccin intrnseca [ML-3 T1].
KM es la constante de afinidad intrnseca [ML-3 ]
S
0 - S
1 S
Restricciones difusionales
externas
S0 Reordenando:
Ss
s
0 - s = =
1 + s
Donde:
i es la concentracin adimensional de sustratos (si/ KM)
es el nmero de adimensional Damkoehler (VMax / (KMh))
es la velocidad de reaccin adimencional
Restricciones difusionales
'
VMax
h K 'M
Vmax ' s
KM s (1 0 )
Vmax ' s 0 0 (1 )
K M s0
Restricciones difusionales
Restricciones difusionales
Internas
Seno del Capa
Biocatalizador
lquido estancada
P0 S0 s0 ss
0 R
p0 ps
R 0
Restricciones difusionales
Restricciones difusionales internas (RDI):
Geometra del
Ecuacin diferencial
catalizador
d 2s Vmax " s
Lamina Deff - 0
dx 2 KM s
Geometra del
Ecuacin diferencial adimensionalizada
catalizador
d 2
Lamina - 2 0
dz 2 1
d 2 2 d
Esfera - 9 2 0
d 2 d 1
x r Vmax "
Con z L eq
L R K M Deff
Restricciones difusionales
El largo equivalente Leq se define como la razn entre el
volumen y la superficie del catalizador.
1 1
A dz 2 d
1 1
G 0
dz G 0
3 2 d
1 1
0 0
A dz 2 d
0 0
Restricciones difusionales
Lamina Esfera