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Hidrogeles termosensibles y
fotopolimerizables derivados de
Pluronic para aplicaciones
biomdicas
Departamento
Qumica Orgnica
Director/es
Ros Latienda, Mara Blanca
Sierra Travieso, Teresa
Tesis Doctoral
HIDROGELES TERMOSENSIBLES Y
FOTOPOLIMERIZABLES DERIVADOS DE
PLURONIC PARA APLICACIONES BIOMDICAS
Autor
Director/es
UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Qumica Orgnica
2014
TESISDOCTORAL
HIDROGELESTERMOSENSIBLESYFOTOPOLIMERIZABLES
DERIVADOSDEPLURONICPARAAPLICACIONES
BIOMDICAS
Autor
ISABELJIMNEZPARDO
Directores
MARABLANCAROSLATIENDA
TERESASIERRATRAVIESO
Dpto.deQumicaOrgnica
FacultaddeCienciasICMA
UniversidaddeZaragozaCSIC
Zaragoza,enerode2014
TESISDOCTORAL
HIDROGELESTERMOSENSIBLESYFOTOPOLIMERIZABLES
DERIVADOSDEPLURONICPARAAPLICACIONESBIOMDICAS
MemoriapresentadaenlaUniversidaddeZaragozaparaoptaral
gradodeDoctor
ISABELJIMNEZPARDO
Dpto.deQumicaOrgnica
FacultaddeCienciasICMA
UniversidaddeZaragozaCSIC
Zaragoza,enerode2014
Prof.MARABLANCAROSLATIENDA,CatedrticadelDepartamentodeQumica
OrgnicadelaFacultaddeCienciasdelaUniversidaddeZaragozay
Dra. TERESA SIERRA TRAVIESO, Investigador Cientfico del Consejo Superior de
InvestigacionesCientficasdelInstitutodeCienciadeMaterialesdeAragndela
UniversidaddeZaragozaCSIC.
HACENCONSTAR:
Zaragoza,a30deenerode2014
Fdo.:Prof.MaraBlancaRosLatienda Fdo.:Dra.TeresaSierraTravieso
A mi familia, a Luis y a Clara
Agradecimientos
GRACIAS a mis compaeros del INA, por haber sido una verdadera
familia para mi, y por crear un gran ambiente de trabajo todos los
das. Eva G., tu llegada al INA fue una autntica revolucin positiva;
gracias por poner orden y sobre todo por tu positivismo contagioso en
el laboratorio. Gracias Emma, por estar siempre ah, dispuesta a
escuchar mis historias, tanto de trabajo como de cualquier otro asunto
que pasara por mi cabeza, y por supuesto gracias por tus consejos.
Julieta y Betta, gracias por ser unas compaeras geniales, por vuestra
ayuda dentro y fuera del laboratorio, y por escuchar con paciencia mis
historias de mi querido pueblo. Y aunque ahora ya no estis en el
grupo, gracias por seguir interesadas siempre por mi y por mi tesis en
estos ltimos meses. Gracias Luchi, por tu entusiasmo y alegra
contagiosa cada maana, por tus historias geniales y por estar siempre
dispuesta a tomar un caf conmigo. Alex ha llegado tu turno, espero
que los agradecimientos que llevas tanto tiempo esperando no te
defrauden, que el listn est muy altoGracias por aguantar con
humor las conversaciones de mujeres del INA, por los momentos que
hemos pasado tanto fuera (espero repetir este ao en Pamplona) como
dentro del laboratorio y por prestarme la molcula de rodamina.
Mariajo, como ya eres una ms del INA te incluyo aqu; gracias por tus
consejos y conversaciones sobre geles y otros temas de la vida, sobre
todo durante estos ltimos meses. Gracias tambin a los estudiantes
que han pasado por el INA: Eva, Diego, Chechu y Luca H. Gracias
Iigo, por facilitarnos el trabajo en el laboratorio.
Gracias a mi familia, mam, tato, tos y yaya, pero gracias sobre todo
a ti, mam. Gracias por comprenderme, escucharme, aconsejarme y
por confiar siempre en m y en todas mis decisiones, gracias por ser
como eres y transmitirme tus valores da a da. Me gustara acordarme
tambin de los que no estn, pap, yayos, tos, s que estarais
orgullosos de m. Tambin me gustara recordarte a ti, Clara, porque
aunque te fuiste muy pronto, en el tiempo que te conoc me enseaste
a luchar y a no rendirme ante los problemas, muchas veces sin
importancia real.
Y por ltimo, gracias a ti, Luis, por ser mi compaero de viaje, por tu
paciencia, compresin y apoyo en todos los momentos. Por hacerme
ver la vida desde otro punto de vista y por ser el motivo por el que
sonrer cada da. Gracias tambin por la realizacin de algunas de las
figuras y fotografas de esta tesis y por tu paciencia con los cambios de
ltima hora.
Gracias a todos!!!!
ACRNIMOS
13
CRMN ResonanciaMagnticaNucleardecarbono
1
HRMN ResonanciaMagnticaNucleardeprotn
ADN cidodesoxirribonucleico
AlfaMEM MinimunEssentialMedium
BA alanina
bisMPA cido2,2bis(hidroximetil)propinico
BSA BovineSerumAlbumin
CC Ensayosmecnicosconfinados
CGC ConcentracinCrticadeGelificacin
CMC ConcentracinMicelarCrtica
CMT TemperaturaMicelarCrtica
DCC N,Ndiciclohexilcarbodiimida
DCU N,Ndiciclohexilurea
DLS DynamicLightScattering
DMAP Dimetilaminopiridina
DMEM DulbeccosModifiedEaglesMedium
DPBS DulbeccosPhosphateBufferedSaline
DPTS ptoluensulfonatodeN,Ndimetilaminopiridinio
DSC (DifferentialScanningCalorimetry)CalorimetraDiferencial
deBarrido
DTT Ditiotreitol
ECM (ExtracellularMatrix)MatrizExtracelular
EDMA Dimetacrilatodeetilenglicol
EE EficienciadeEncapsulacin
EM EspectrometradeMasas
EPR EnhancedPermeationRetentionEffect
FBS (FetalBovineSerum)Suerofetalbovino
FDA FoodandDrugAdministration
FGF FibroblastGrowthFactor
FTIR EspectroscopiainfrarrojacontransformadadeFourier
GL Glicerol
GMAchitosan Quitosanometacrilado
GPC (GelPermeationChromatography)Cromatografade
PermeacinenGel
HeLa ClulasHomoSapiensCervixAdenocarcinoma
HEMA Metacrilatode2hidroxietilo
HMBC HeteronuclearMultipleBondCorrelation
HSQC HeteronuclearSingleQuantumCorrelation
I2959 Irgacure2959
IT IngenieradeTejidos
LCF LiberacinControladadeFrmacos
LCST LowerCriticalSolutionTemperature
LSU LightScatteringUnits
MALDIMS MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationMass
Spectroscopy
Mn Pesomolecularpromedioennmero
MSC (MesenchymalStemCells)ClulasMesenquimales
MTT Bromurode3(4,5dimetiltiazol2ilo)2,5difeniltetrazol
Mw Pesomolecularpromedioenpeso
NC Ensayosmecnicosnoconfinados
PBS PhosphateBufferedSaline
PCL Policaprolactona
PDI ndicedePolidispersidad
PEA Poliesteramidas
PEG Polietilenglicol
PEGDA Diacrilatodepolietilenglicol
PLA cidopolilctico
PLGA cidoPolilcticocogliclico
PNIPAAm PoliNisopropilacrilamida
PPG Polipropilenglicol
Py Piridina
RGD Arginina,glicina,cidoasprtico
RTG ReverseThermalGelation
S.D. Desviacinestndar
SA cidoSuccnico
SEM (ScanningElectronMycroscopy)Microscopaelectrnicade
barrido
TEA Trietilamina
TEG Tetraetilenglicol
TEM (TransmissionElectronicMycroscopy)Microscopa
electrnicadetransmisin
TsOH cidoptoluensulfnicomonohidrato
UCST UpperCriticalSolutionTemperature
UV Ultravioleta
W0 Pesoinicial
Wt Pesoatiempot
TGF TransformingGrowthFactor
G EnergadeGibbs
S Entropa
NDICE
CAPTULO1.ANTECEDENTES 1
1.1.HIDROGELESCOMOMATERIALESPARAAPLICACIONESENBIOMEDICINA 3
1.2.CARACTERISTICASDELOSHIDROGELESPARAAPLICACIONESBIOMDICAS 8
1.2.1.Hidrogelesconreticulacinfsica 9
1.2.2.Hidrogelesconreticulacinqumica 13
1.2.3.Hidrogelesnanoestructurados 22
1.3.PLURONICYSUSAPLICACIONESBIOMDICAS 25
CAPTULO2.OBJETIVOSYPLANTEAMIENTO 39
2.1.OBJETIVOS 41
2.2.PLANTEAMIENTODELTRABAJO 45
CAPTULO3.HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:POLIACRILATOS 49
3.1.SNTESISYCARACTERIZACIN 53
3.1.1.Derivadolineal 53
3.1.2.Derivadosdendrticos 55
3.2.DETERMINACINDELASPROPIEDADESSOLGEL 78
3.2.1.Mtododeinversindelvial 79
3.2.2.DSC 81
3.2.3.Discusindelosresultados 84
3.3.PREPARACINDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS 87
3.4.CARACTERIZACINDELAMORFOLOGAINTERNAPORSEM 89
3.5.ESTUDIODEDEGRADACINDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS 92
3.6.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR 96
3.6.1.Resultadosdeviabilidadcelulardederivadosacrilados 100
3.6.2.Resultadosdeviabilidadcelulardederivadoscongrupos
benciloehidroxiloterminales 107
3.7.CARACTERIZACINMECNICA 114
3.7.1.Ensayosdecompresinuniaxialmonotnica 116
3.7.2.Ensayosdecompresinuniaxialdecargarelajacin 119
3.7.3.Ensayosdefatiga 121
3.7.4.Comparacinconpropiedadesmecnicasdelcartlago 122
CAPTULO4:HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:TIOLENOS 125
4.1.DERIVADOSDEPLURONICCONGRUPOSTIOLTERMINALES 129
4.1.1.Sntesisycaracterizacin 129
4.1.1.1.Derivadolineal 129
4.1.1.2.Derivadostioladosdendrticos 134
4.1.2.Determinacindelaspropiedadessolgel 141
4.1.2.1.Mtododeinversindelvial 142
4.1.2.2.DSC 144
4.1.2.3.Discusindelosresultados 147
4.1.3.Ensayosdeviabilidadcelular 148
4.2.FORMULACIONESDEDERIVADOSF127SHnYRETICULANTES
ACRILADOS 154
4.2.1.MaterialesbasadosenmezclasdeF127SHnconF127Acn 154
4.2.1.1.Preparacindeloshidrogelesprecursoresy
estudiodesureticulacin 155
4.2.1.2.Determinacindelaspropiedadessolgel
dehidrogelespolimerizables 164
4.2.1.3.CaracterizacindelamorfologainternaporSEM 167
4.2.1.4.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados 171
4.2.1.5.Ensayosdeviabilidadcelular 173
4.2.2.MaterialesbasadosenmezclasdeF127SHnconotros
reticulantesacrilados 180
4.2.2.1.Preparacindeloshidrogelespolimerizables
ehidrogelesfotopolimerizados 181
4.2.2.2.Caracterizacindelamorfologainternapor
SEMdehidrogelespolimerizadosbasadosenF127NHAc2 182
4.2.2.3.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados 183
4.2.2.4.Ensayosdeviabilidadcelular 184
4.3.ESTUDIOCOMPARATIVOENTREHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS
DELCAPTULO3Y4 186
CAPTULO5:HIDROGELESNANOESTRUCTURADOS(NANOGELES) 189
5.1.PREPARACINDENANOGELES 195
5.1.1.DeterminacindelaCMC 195
5.1.2.Fotopolimerizacindelosnanogeles 198
5.1.3.Liofilizacindelosnanogelesfotopolimerizados 203
5.2.ENCAPSULACINENNANOGELES 205
5.3.CARACTERIZACINMORFOLGICA 208
5.4.ENSAYOSCELULARES 219
5.4.1.Viabilidadcelular 220
5.4.2.Ensayosdeinternalizacin 222
CAPTULO6:PARTEEXPERIMENTAL 235
6.1.SNTESISYCARACTERIZACINDELOSCOMPUESTOS 239
6.2.PROTOCOLOSDETRABAJO 259
6.3.MATERIALESYTCNICAS 271
CAPTULO7.CONCLUSIONES 275
ANEXOS 279
ANEXOI.CARACTERIZACINESTRUCTURAL 283
ANEXOII.CARACTERIZACINDEHIDROGELESPORDSC 288
ANEXOIII.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR 291
CAPTULO1
ANTECEDENTES
Captulo1
1.1.HIDROGELESCOMOMATERIALESPARAAPLICACIONESENBIOMEDICINA
Loshidrogelessonunaclasedematerialescapacesderetenerunagrancantidad
de agua como consecuencia de su estructura tridimensional, formada por
estructuraspolimricasentrecruzadas.1
Aprincipiosdelosaos50,enlabsquedadenuevosbiomateriales,Wichterley
Lim iniciaron un programa pionero para el desarrollo de hidrogeles para
aplicaciones biomdicas a partir de la copolimerizacin de metacrilato de 2
hidroxietilo(HEMA)ydimetacrilatodeetilenglicol(EDMA).2Estosmaterialeshan
mostradonumerosasaplicacionesenelcampodelaoftalmologa3(Figura1.1)y
lacirugaplsticadesarrolladaanivelclnico.4
Figura1.1.LentesdecontactodeHEMA/EDMA.3a
Elxitodeestosmaterialesimpulseldesarrollosimultneodegranvariedadde
hidrogeles con otras aplicaciones biomdicas tales como la reparacin de
1
(a)Li,Y.;Rodrigues,J.;Tomas,H.,ChemicalSocietyReviews2012,41(6),21932221.
(b)Kopeek,J.,Biomaterials2007,28(34),51855192.
2
Witchterle,O.,Lim,D.,Nature1960,185,117118.
3
(a) Kopecek, J., Journal of Polymer Science Part aPolymer Chemistry 2009, 47 (22),
59295946;(b)Krejc,L.;Harrison,R.;Withterle,O.,ArchOphthal1970,84(1),7682.
4
Voldrich,Z.;Tomnek,Z.;Vack,J.;Kopecec,J.,JBiomedMaterRes1975,9(6),675
685.
3
Captulo1Capitulok
Debidoalaltocontenidoenaguadeestosmateriales,queloshacesimilaresalos
tejidos naturales, su permeabilidad, porosidad, flexibilidad en la fabricacin y
posibilidad de variar su composicin para obtener las propiedades fsicas
necesarias en funcin de la aplicacin, o de diseo qumico que permita su
biocompatibilidad, los hidrogeles por s mismos o combinados con clulas, han
ampliado en la actualidad su espectro de aplicaciones biomdicas.1a As, los
hidrogelespuedenservirdeandamiajesoscaffoldsqueactancomounsoporte
paraelcrecimientocelular,6comomaterialesparalaencapsulacindeclulas,7
frmacos,8protenas9ogenes(terapiagnica),10comoadhesivosentretejidosy
superficies de materiales,11 como sistemas que permiten una respuesta
reversible ante un estmulo externo12 o como membranas porosas.13 En
particular,campostanactivoscomolaIngenieradetejidos(IT)14ysuusocomo
5
Kresa,Z.;Rems,J.;Witchterle,O.,ArchOtholaryngol1973,17,360.
6
(a)Puppi,D.;Chiellini,F.;Piras,A.M.;Chiellini,E.,ProgressinPolymerScience2010,
35 (4), 403440; (b) JagurGrodzinski, J., Polym. Adv. Technol. 2010, 21, 2747; (c)
Khademhosseini, A.; Langer, R., Biomaterials 2007, 28 (34), 50875092; (d) Drury, J. L.;
Mooney,D.J.,Biomaterials2003,24(24),43374351.
7
Wang,C.M.;Varshney,R.R.;Wang,D.A.,Adv.DrugDeliveryRev.2010,62,699710.
8
Hoare,T.R.;Kohane,D.S.,Polymer2008,49(8),19932007.
9
Vermonden,T.;Censi,R.;Hennink,W.E.,ChemicalReviews2012,112(5),28532888.
10
Oh,E.J.;Park,K.;Kim,K.S.;Kim,J.;Yang,J.A.;Kong,J.H.;Lee,M.Y.;Hoffman,A.S.;
Hahn,S.K.,JournalofControlledRelease2010,141(1),212.
11
(a) Sharma, B.; Fermanian, S.; Gibson, M.; Unterman, S.; Herzka, D. A.; Cascio, B.;
Coburn, J.; Hui, A. Y.; Marcus, N.; Gold, G. E.; Elisseeff, J. H., Science Translational
Medicine2013,5(167),167ra6;(b)Strehin,I.;Nahas,Z.;Arora,K.;Nguyen,T.;Elisseeff,
J.,Biomaterials2010,31(10),27882797.
12
Alarcon,C.d.l.H.;Pennadam,S.;Alexander,C.,ChemicalSocietyReviews2005,34
(3),276285.
13
Yang,Q.;Adrus,N.;Tomicki,F.;Ulbricht,M.,JournalofMaterialsChemistry2011,21
(9),27832811.
14
(a)OBrien,F.J.,MaterialsToday2011,14(3),8894;(b)Spiller,K.L.; Maher,S.A.;
Lowman,A.M.,Tissueengineering.PartB,Reviews2011,17(4),281299(c)Dankers,P.
Y.W.;Meijer,E.W.,BulletinoftheChemicalSocietyofJapan2007,80(11),20472073.
4
Captulo1
UnadelaslneasdetrabajodelaITeselusodeunandamiajeoscaffoldcomo
soportedeclulasenunentornotridimensional(Figura1.2).
Figura1.2.EsquemasimplificadodelconceptodeIngenieradeTejidos(IT),extradode
lapginawebdelaSociedadEspaoladeBioqumicayBiologaMolecular.17
Elandamiajeproporcionaunentornoadecuadoparalaadhesin,proliferacin,
diferenciacin (en el caso de utilizar clulas no diferenciadas) y formacin de
Matriz Extracelular (ECM) por parte de las clulas, actuando como plantilla o
template para la regeneracin de tejidos y rganos. Estos andamiajes con
15
Hamidi, M.; Azadi, A.; Rafiei, P., Hydrogel nanoparticles in drug delivery. Advanced
DrugDeliveryReviews2008,60(15),16381649.
16
Langer,R.;Vacanti,J.P.,Science1993,260,920926.
17
www.sebbm.es
5
Captulo1Capitulok
clulas en su interior se pueden cultivar in vitro para sintetizar tejidos que son
implantadosaposteriorienellugardaadooinvivo,implantandoelandamiaje
con clulas directamente en el lugar daado y utilizando el propio cuerpo
humano para inducir la regeneracin de tejidos y rganos. As, la IT se ha
utilizado para la sustitucin de diferentes tejidos u rganos, entre los que se
encuentran el hueso,18 el cartlago,19 los nervios,20 los vasos sanguneos,21 la
piel22ydiferentespartesdelossistemasgastrointestinalourogenital.23
18
Williams, J. M.; Adewunmi, A.; Schek, M. R.; Flanagan, C. L.; Krebsbach, P. H.,
Biomaterials2005,26(23),48174827.
19
Mercier,N.R.;Constantino,H.R.;Tracy,M.A.;Bonassar,L.J.,Biomaterials2005,26
(14),19451952.
20
Lietz, M.; Dreesmann, L.; Hoss, M.; Oberhoffner, S.; Scholosshauer, B., Biomaterials
2006,27(8),14251436.
21
Vaz,C.M.;VanTujil,S.;Bouten,C.V.C.;Baaijens,F.T.P.,ActaBiomaterialia2005,1
(5),575582.
22
Dai, N. T.; Williamson, M. R.; Khammo, N.; Adams, e. F.; Coombes, A. G. A.,
Biomaterials2004,25(18),42634271.
23
Kim, S. S.; Kaihara, S.; Benvenuto, M. S.; Choi, R. S.; Kim, B. S.; Mooney, D. J.,
Transplantation1999,67(2),227233.
6
Captulo1
Liberacinproblemticadefrmaco
Niveltxico
Liberacincontroladaideal
Nivelefectivomnimo
Tiempo
Figura1.3.Perfildeliberacincontroladaideal(lneapunteadaencolorazul)y
liberacinnocontrolada(lneapunteadaencolorgris).24
24
Ward,M.A.;Georgiou,T.K.,Polymers2011,3(3),12151242.
7
Captulo1Capitulok
1.2.CARACTERSTICASDELOSHIDROGELESPARAAPLICACIONESBIOMDICAS
Loshidrogelessepuedenclasificardediferentesformasdependiendodelcriterio
aplicado.Enfuncindelorigendelgelificantequeformalaredtridimensional,se
identifican como naturales, sintticos o hidrogeles hbridos (compuestos por
mezclasdemolculasdeorigennaturalysinttico).Siseconsideralanaturaleza
qumicadelentrecruzamientodelared,sepuedehablardehidrogelesqumicos,
reticulados a travs de enlaces covalentes e hidrogeles fsicos, formados por
interaccionesdetipofsico.27
25
Ravichandran, R.; Sundarrajan, S.; Venugopal, J. R.; Mukherjee, S.; Ramakrishna, S.,
MacromolecularBioscience2012,12(3),286311.
26
(a) Ramos, J.; Imaz, A.; CallejasFernandez, J.; BarbosaBarros, L.; Estelrich, J.;
QuesadaPerez,M.;Forcada,J.,SoftMatter2011,7(11),50675082;(b)Kabanov,A.V.;
Vinogradov, S. V., Angewandte ChemieInternational Edition 2009, 48 (30), 54185429;
(c)Hamidi,M.;Azadi,A.;Rafiei,P.,AdvancedDrugDeliveryReviews2008,60(15),1638
1649.
27
Yu,L.;Ding,J.D.,ChemicalSocietyReviews2008,37(8),14731481.
8
Captulo1
Porotraparte,loshidrogelespuedenutilizarsecondimensionesmacroscpicas,
desde varias micras a varios centmetros, o en sistemas nanoestructurados, los
citadosnanogeles,quesondispersionesacuosasdenanopartculasdehidrogel.
Enelcasodelasaplicacionesbiomdicas,eldesarrolloylascaractersticasdelos
hidrogeleshanestadoclaramentemarcadosporeltipodeaplicacionesalquese
hadirigidoelmaterial.
1.2.1.Hidrogelesconreticulacinfsica
28
(a)Klouda,L.;Hacker,M.C.;Kretlow,J.D.;Mikos,A.G.,Biomaterials2009,30(27),
45584566; (b) Hacker, M. C.; Klouda, L.; Ma, B. B.; Kretlow, J. D.; Mikos, A. G., S.,
Biomacromolecules2008,9(6),15581570.
29
Wang,Q.;Mynar,J.L.; Yoshida,M.; Lee,E.;Lee, M.;Okuro,K.;Kinbara,K.;Aida,T.,
Nature2010,463(7279),339343.
9
Captulo1Capitulok
Dentrodeloshidrogelesfsicostienengranimportanciaenbiomedicinaaquellos
que, en agua, sufren una transicin de fase reversible debido a un estmulo
externo como por ejemplo un cambio de temperatura, pH, campo elctrico,
concentracininica,etc.
Hidrogelestermosensiblespositivos,queporencimadeunatemperatura
seencuentranenelestadosolysugelificacinseproduceenelproceso
de enfriamiento, cuando se alcanza la denominada UCST (Upper Critical
SolutionTemperarure).
Hidrogelestermosensiblesnegativos,quepordebajodeunatemperatura
seencuentranenelestadosolysugelificacinseproduceenelproceso
decalentamiento,cuandosealcanzaladenominadaLCST(LowerCritical
Solution Temperature). Este fenmeno tambin se conoce como
GelificacinTrmicaInversa(RTG,ReverseThermalGelation).
Durante las ltimas dcadas han adquirido especial importancia los hidrogeles
inyectables,quepermitenlaformacindelhidrogelinsitu.32b, 33Lainyeccines
una tcnica mnimamente invasiva que resulta favorable por su fcil
administracin y la mnima incomodidad que causa en el paciente. Por otra
parte, la inyeccin del hidrogel en el lugar de implantacin permite una mejor
30
Liu,C.B.;Gong,C.Y.;Pan,Y.F.;Zhang,Y.D.;Wang,J.W.;Huang,M.J.;Wang,Y.S.;
Wang, K.; Gou, M. L.; Tu, M. J.; Wei, Y. Q.; Qian, Z. Y., Colloids and Surfaces a
PhysicochemicalandEngineeringAspects2007,302(13),430438.
31
Pal,A.;Basit,H.;Sen,S.;Aswal,V.K.;Bhattacharya,S.,JournalofMaterialsChemistry
2009,19(25),43254334.
32
(a)Klouda,L.;Mikos,A.G.,EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics
2008,68(1),3445;(b)Jeong,B.;Kim,S.W.;Bae,Y.H.,AdvancedDrugDeliveryReviews
2002,54(1),3751.
33
(a) RuelGaripy, E.; Leroux, J.C., European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics2004,58(2),409426
10
Captulo1
Figura1.4.Procesodegelificacininducidoporelaumentodetemperaturaenun
hidrogeltermosensibledetiponegativo(conLCST).34a
Para que un hidrogel sufra una transicin solgel por efecto del aumento de
temperatura, el gelificante constituyente del hidrogel debe poseer naturaleza
anffila, con un delicado balance hidrfobo e hidrfilo en su estructura que
permita cambios de organizacin supramolecular en funcin de la
temperatura.35 La estructura qumica de algunos gelificantes, en concreto
polmeros,semuestranenlaFigura1.5.
34
(a)Moon,H.J.;Ko,D.Y.;Park,M.H.;Joo,M.K.;Jeong,B.,ChemicalSocietyReviews
2012,41(14),48604883;(b)Sosnik,A.,ArsPharm2007,48(1),83102.
35
Jeong,B.;Bae,Y.H.;Lee,D.S.;Kim,S.W.,Nature1997,388(6645),860862.
11
Captulo1Capitulok
a)
b)
c)
Figura1.5.Estructuraqumicadealgunospolmeroscapacesdegelificarendisolucin
porefectodelatemperatura,mediantetransicinsolgel:a)CopolmerobloquedePEG
PPGPEG(PluronicoPoloxamer);b)CopolmerobloquedePEGPLGAPEG;c)poliN
isopropilacrilamida.
36
Alexandridis, P.; Hatton, T. A., Colloids and Surfaces aPhysicochemical and
EngineeringAspects1995,96(12),146.
37
Bae, S. J.; Joo, M. K.; Jeong, Y.; Kim, S. W.; Lee, W.K.; Sohn, Y. S.; Jeong, B.,
Macromolecules2006,39(14),48734879.
38
Jeong,B.;Lee,K.M.;Gutowska,A.;An,Y.H.,Biomacromolecules2002,3(4),865868.
39
Duarte,A.R.C.;Mano,J.F.;Reis,R.L.,ActaBiomaterialia2011,7(2),526529.
12
Captulo1
1.2.2.Hidrogelesconreticulacinqumica
Lasestrategiasutilizadasparaproducirlareticulacinqumicadehidrogeleshan
sido variadas, usando en muchos casos reacciones de polimerizacin clsicas,
talescomoreaccionesentremonmeroscongruposreactivoscomplementarios
(p.e.laadicindeMichael,reaccionesdecicloadicin1,3dipolarcatalizadaspor
Cu(I),formacindebasesdeSchiff,etc.) 40oreaccionesradicalarias,utilizando
un iniciador trmico (polimerizacin trmica) o mediante un fotoiniciador
(fotopolimerizacin).41Enelcasodehidrogelesdiseadosparaaplicacionesque
implican la polimerizacin en condiciones fisiolgicas, hay que tener en cuenta
que el entrecruzado qumico de estos materiales se debe producir sin causar
daosalasclulasomolculasqueseencuentrancombinadasconelhidrogel.
Lafotopolimerizacinprecisageneralmentedelapresenciadeunfotoiniciador,
que posee una alta absorcin lumnica a una longitud de onda especfica (luz
visible o ultravioleta), generando los radicales libres iniciadores del proceso.
40
Ko,D.Y.;Shinde,U.P.;Yeon,B.;Jeong,B.,ProgressinPolymerScience2013,38(34),
672701.
41
Nguyen,K.T.;West,J.L.,Biomaterials2002,23(22),43074314.
42
Maffezzoli,A.;DellaPietra,A.,Biomaterials1994,15(15),12211228.
43
Dumanian, G. A.; Dascombe, W.; Hong, C.; Labadie, K.; Garret, K.; Sawhney, A. S.;
Pathak,C.P.;Hubbel,J.A.;Johnson,P.C.,Plast.ReconstrSurg1995,95,901907.
13
Captulo1Capitulok
Aunquesehanutilizadofotoiniciadoresbiocompatiblesactivosenelrangodela
luz visible, como Eosin Y,45 el fotoiniciador ms utilizado para la
fotopolimerizacindehidrogelesenaplicacionesbiomdicasesunfotoiniciador
activobajoluzultravioleta,Irgacure2959(I2959),productocomercial,solubleen
agua, cuya estructura qumica y proceso de generacin de radicales libres se
muestra en la Figura 1.6.46 Se ha demostrado que la tolerancia de este
fotoiniciador a diferentes concentraciones y para un gran nmero de lneas
celulares, por ejemplo clulas mesenquimales (MSC), condrocitos (clulas que
forman parte del cartlago natural) y osteoblastos (clulas de hueso), es
elevada.44
Figura1.6.EstructuraqumicadelfotoiniciadorIrgacure2959yformacinderadicales
libresporefectodelaluz.
44
Williams,C.G.;Malik,A.N.;Kim,T.J.;Manson,P.N.;Elisseeff,J.,Biomaterials2005,
26(11),12111218.
45
Bahney,C.S.;Lujan,T.J.;Hsu,C.W.;Bottlang,M.;West,J.L.;Johnstone,B.,European
Cells&Materials2011,22,4355.
46
(a) You, Z.; Wang, Y., Advanced Functional Materials 2012, 22 (13), 28122820; (b)
Coutinho, D. F.; Sant, S. V.; Shin, H.; Oliveira, J. T.; Gomes, M. E.; Neves, N. M.;
Khademhosseini,A.;Reis,R.L.,Biomaterials2010,31(29),74947502;(c)Vermonden,
T.; Fedorovich, N. E.; van Geemen, D.; Alblas, J.; Van Nostrum, C. F.; Dhert, W. J. A.;
Hennink,W.E.,Biomacromolecules2008,9(3),919926.
14
Captulo1
Denuevo,unadelasestructurasqumicasutilizadaseneldiseodegelificantes
sintticos con ms xito en aplicaciones biomdicas, y especial inters en el
campodelaIT52ydelaencapsulacinyLCF,53eselPolietilenglicol(PEG),debido
a su naturaleza hidrfila y biocompatibilidad. Los sistemas fotopolimerizables
basados en PEG se componen principalmente de diacrilatos de PEG (PEGDA,
Figura1.7).
Figura1.7.EstructuraqumicadediacrilatosdePEG(PEGDA).
47
Li, Q.; Williams, C. G.; Sun, D. D. N.; Wang, J.; Leong, K.; Elisseeff, J., Journal of
BiomedicalMaterialsResearchPartA2004,68,2833.
48
Nettles, D. L.; Vail, T. P.; Morgan, M. T.; Grinstaff, M. W.; Setton, L. A., Annals of
BiomedicalEngineering2004,32,391397.
49
Amsden, B. G.; Sukarto, A.; Knight, D. K.; Shapka, S. N., Biomacromolecules 2007, 8,
37583766.
50
Seto,S.P.;Casas,M.E.;Temenoff,J.S.,CellandTissueResearch2012,347,589601.
51
Jeon, O.; Bouhadir, K. H.; Mansour, J. M.; Alsberg, E., Biomaterials 2009, 30, 2724
2734.
52
Peppas,N.A.;Hilt,J.Z.;Khademhosseini,A.;Langer,R.,Adv.Mater.2006,18,1345
1360.
53
Sawhney,A.S.;Pathak,C.P.;Hubbell,J.A.,Macromolecules1993,26,581587.
15
Captulo1Capitulok
Sinembargo,conclulasadherentes(MSC,osteoblastos,fibroblastos,etc.)seha
trabajado con molculas de PEGDA funcionalizadas con la secuencia peptdica
RGD (R: arginina, G: glicina, D: cido asprtico). El RGD no solo promueve la
adhesin celular sino que tambin puede ser utilizado para conseguir la
respuestaselectivadedeterminadotipodeclulas.56As,unhidrogeltipoRGD
PEGDA se ha utilizado para la encapsulacin de MSC, consiguiendo su
diferenciacinaosteoblastos,conproduccindeECMcompuestaporprotenas
presentesenelhuesocomolafosfatasaalcalina.57
54
Lee,J.H.;Lee,H.B.;Andrade,J.D.,ProgPolymSci1995,20,10431079.
55
(a) Elisseeff, J.; McIntosh, W.; Anseth, K.; Riley, S.; Ragan, P.; Langer, R., Journal of
Biomedical Materials Research 2000, 51 (2), 164171; (b) Elisseeff, J.; Anseth, K.; Sims,
D.; McIntosh, W.; Randolph, M. A.; Yaremchuk, M.; Langer, M., Plast. Reconstr. Surg.
1999,104(4),10141022.
56
Hersel,U.;Dahmen,C.;Kessler,H.,Biomaterials2003,24(24),43854415.
57
Yang,F.;Williams,C.G.;Wang,D.a.;Lee,H.;Manson,P.N.;Elisseeff,J.,Biomaterials
2005,26(30),59915998.
58
Ouasti,S.;Donno,R.;Cellesi,F.;Sherratt,M.J.;Terenghi,G.;Tirelli,N.,Biomaterials
2011,32(27),64566470.
16
Captulo1
11b
Figura1.8.AdhesivobasadoensulfatodecondroitinayPEGNH2.
17
Captulo1Capitulok
fotopolimerizables.59Loshbridosdendrticolinealessonestructuraspolimricas
ms complejas que combinan en su estructura cadenas lineales de polmero y
segmentosdendrticos.60
NCLEO Dendrn
G1
G2
G3
G4
Figura1.9.Estructurageneraldelosdendrmerosydendrones.61
59
(a)Grinstaff,M.W.,JournalofPolymerSciencePartA:PolymerChemistry2008,46(2),
383400;(b)Degoricija,L.;Bansal,P.N.;Sontjens,S.H.M.;Joshi,N.S.;Takahashi,M.;
Snyder,B.;Grinstaff,M.W.,Biomacromolecules2008,9(10),28632872;(c)Sontjens,S.
H.M.;Nettles,D.L.;Carnahan,M.A.;Setton,L.A.;Grinstaff,M.W.,Biomacromolecules
2006,7(1),310316;(d)Carnahan,M.A.;Grinstaff,M.W.,JACS2001,123,29052906.
60
Gitsov, I., Journal of Polymer Science Part aPolymer Chemistry 2008, 46 (16), 5295
5314.
61
Movellan,J.,Dendriticderivativesasbuildingblocksforbiomedicalapplications.Tesis
doctoral,2013.
18
Captulo1
ygruposfuncionalesenlaperiferia,cuyonmerodependedelageneracin.La
denominacin utilizada para el nmero de generacin as como los mtodos
utilizados para su sntesis son idnticos tanto para dendrmeros como para
dendrones.
El diseo molecular propuesto por Grinstaff et al., con una estructura de tipo
ABA (Figura 1.10) dendrticolinealdendrtico basada en PEG, permite la
combinacindelaspropiedadesdelPEG,ylascaracteristicasdelosdendrones,
derivadosde metabolitosnaturales,comocidosuccnico(SA),glicerol(GL)y
alanina(BA).Porotraparte,lafuncionalizacindelosextremosdendrticoscon
grupos terminales tipo metacrilato han permitido obtener polmeros
fotopolimerizables.
62
Ihre, H.; Padilla De Jess, O. L.; Frchet, J. M. J., Journal of the American Chemical
Society2001,123(25),59085917.
63
Ihre,H.;Hult,A.;Frchet,J.M.J.;Gitsov,I.,Macromolecules1998,31(13),40614068.
19
Captulo1Capitulok
a)PGLSAPEG
b)PGLBAPEG
Figura1.10.CopolmerosbloquedendrticolinealdendrticoreactivosbasadasenPEGy
dendronesde:a)glicerolycidosuccnico;b)glicerolyalanina.59
LoshidrogelesdePGLSAPEGhansidotambinensayadosparalaregeneracin
de cartlago.59c As, hidrogeles al 7.5 % y al 15 % (w/v) de PGLSAPEG se han
aplicado en la encapsulacin de condrocitos in vitro. Con el hidrogel de menor
concentracin se logr generar una gran cantidad de ECM compuesta por
proteoglicanos y colgeno secretados por los condrocitos. Sin embargo, este
hidrogelsedegradrpidamente,loquelimitasuaplicabilidadinvivo.
64
Grinstaff,M.W.,Biomaterials2007,28(35),52055214.
20
Captulo1
Conelfindemejorarlaspropiedadesdedegradacinsehanutilizadohidrogeles
dePGLBAPEGquecombinanlapresenciadeenlacestiposterytipocarbamato
(Figura 1.10 (b)).59b Estos hidrogeles presentan propiedades mecnicas que
varan con la concentracin de hidrogel, proporcionando en algunos casos
valoresdedurezayviscoelasticidadprximosalosdelcartlago.Ensayosinvivo
en conejos con hidrogeles al 10% (w/v), inyectados y fotopolimerizados en el
defecto, mostraron una alta tolerancia, estabilidad estructural y produccin de
ECMporlasclulas,tras24semanas.
65
Oberg,K.;Hed,Y.;JoelssonRahmn,I.;Kelly,J.;Lowenhielm,P.;Malkoch,M.,Chemical
Communications2013,49(62),69386940.
66
Hoyle, C. E.; Bowman, C. N., Angewandte Chemie International Edition 2010, 49 (9),
15401573.
21
Captulo1Capitulok
a)
b)
Figura1.11.ComponentesdelhidrogeldescritoporMalkochetal,65a)derivadodePEG
congrupostiolterminales,b)Cadenadepolietilenglicolconunidadesdendrticasde
glicerol,yenposicionesterminalescondoblesenlacesymolculasbioactivas(encolor
rosa).
1.2.3.Hidrogelesnanoestructurados
67
Saunders,B.R.;Vincent,B.,Adv.ColloidInterfaceSci.1999,80(1),125.
22
Captulo1
tamaonanomtricoautoensambladasesunaformamuyverstildeproduccin
denanogelesmedianteelbloqueodelasestructuraspreformadas.68
68
(a) Chacko, R. T.; Ventura, J.; Zhuang, S.; Thayumanavan, S., Adv. Drug Delivery Rev.
2012, 64 (9), 836851; (b) Gonalves, C.; Pereira, P.; Gama, M., Materials 2010, 3 (2),
14201460.
69
Peng,H.S.;Stolwijk,J.A.;Sun,L.N.;Wegener,J.;Wolfbeis,O.S.,AngewandteChemie
InternationalEdition2010,49(25),42464249.
70
Oishi,M.;Sumitani,S.;Nagasaki,Y.,BioconjugateChemistry2007,18(5),13791382.
71
(a) Roux, R.; Ladavire, C.; Montembault, A.; Delair, T., Materials Science and
EngineeringC2013,33(3),9971007;(b)Hayashi,C.;Hasegawa,U.;Saita,Y.;Hemmi,H.;
Hayata,T.;Nakashima,K.;Ezura,Y.;Amagasa,T.;Akiyoshi,K.;Noda,M.,J.Cell.Physiol.
2009,220(1),17.
72
Chandna,P.;Saad,M.;Wang,Y.;Ber,E.;Khandare,J.;Vetcher,A.A.;A.,S.V.;Minko,
T.,Mol.Pharm2007,4(5),668678.
23
Captulo1Capitulok
73
Fleige,E.;Quadir,M.A.;Haag,R.,AdvancedDrugDeliveryReviews2012,64(9),866
884.
74
Pelton,R.,Adv.ColloidInterfaceSci.2000,85(1),133.
75
Cuggino, J. C.; Alvarez I, C. I.; Strumia, M. C.; Welker, P.; Licha, K.; Steinhilber, D.;
Mutihac,R.C.;Calderon,M.,SoftMatter2011,7(23),1125911266.
76
(a)Li,N.;Wang,J.;Yang,X.;Li,L.,ColloidsandSurfacesb:Biointerfaces2011,83(2),
237244;(b)Kim,J.Y.;Choi,W.I.;Kim,Y.H.;Tae,G.;Lee,S.Y.;Kim,K.;Kwon,I.C.,2010,
147(1),109117;(c)Huang,S.J.;Sun,S.L.;Feng,T.H.;Sung,K.H.;Lui,W.L.;Wang,L.
F., European Journal of Pharmaceutical Sciences 2009, 38 (1), 6473; (d) Missirlis, D.;
Kawamura, R.; Tirelli, N.; Hubbell, J. A., European Journal of Pharmaceutical Sciences
2006,29(2),120129;(e)Choi,S.H.;Lee,J.H.;Choi,S.M.;Park,T.G.,Langmuir2006,
22(4),17581762;(f)Missirlis,D.;Tirelli,N.;Hubbell,J.A.,Langmuir2005,21(6),2605
2613.
77
Yang, L.; Guo, C.; Jia, L.; Liang, X.; Liu, C.; Liu, H., Journal of Colloid and Interface
Science2010,350(1),2229.
24
Captulo1
Entradaysalidademolculas Molculasencapsuladas
enelinteriordelnanogel
EstadohinchadoT<LCST
EstadocolapsadoT>LCST
Figura1.12.Esquemarepresentativodelprocesodeentradaysalidadefrmacosenun
nanogelproducidaporefectodelatemperatura.
1.3.PLURONICYSUSAPLICACIONESBIOMEDICAS
78
Pluronic and Tetronic Surfactants, Technical Brochure,. BASF Corp., Parsippany, NJ.
1989.
25
Captulo1Capitulok
Figura1.13.VariedadesynomenclaturadeloscopolmerosbloquedePluronic.36
26
Captulo1
UnadelasvariedadesdePluroniceselPluronicF127(Figura1.14).Elnmero
12 hace referencia a que se trata de un copolmero bloque con un peso
molecular del bloque de PPG de 4000 g/mol, mientras que el nmero 7 hace
referenciaalapresenciadeun70%dePEGenlamolcula.
Figura1.14.EstructuraqumicadePluronicF127.
C>CMC
Figura1.15.EsquemadelaestructuramicelardelPluronicenagua,a
concentracionesporencimadesuConcentracinMicelarCrtica(CMC).
EncolorazulserepresentaelncleohidrfobodePPGyencolorverdela
coronahidrfiladePEG.
27
Captulo1Capitulok
LasdisolucionesacuosasabajasconcentracionesdePluronic,debidoa
sucapacidaddeautoorganizacinenformademicelasporencimadela
CMCydebidoalapresenciadesuncleohidrfoboysucoronahidrfila,
se han utilizado como sistemas de encapsulacin de frmacos tanto
hidrfobos, para mejorar su solubilidad en medio acuoso, como
hidrfilos, para mejorar el tiempo de residencia en el torrente
sanguneo.79
ElmecanismodelagelificacindePluronicsiguesiendountemaquedespierta
mucha controversia. Se han propuesto distintos mecanismos que tratan de
explicar la transicin solgel de este copolmero bloque, que se comentan a
continuacin.
79
(a)Li,Y.Y.;Li,L.;Dong,H.Q.;Cai,X.J.;Ren,T.B.,Materialsscience&engineering.C,
2013,33(5),2698707;(b)Yoncheva,K.;Calleja,P.;Ageros,M.;Petrov,P.;Miladinova,
I.; Tsvetanov, C.; Irache, J. M., International Journal of Pharmaceutics 2012, 436 (12),
258264.
80
Lixin, F.; Degen, M.; Grupido, N.; Bendle, S.; Pennartz, P., Materials Science and
Engineering:A2010,528(1),127136.
81
Rassing,D.;Attwood,D.,UltrasoundInt.J.Pharm.1983,13,4755.
28
Captulo1
Vadnereetal.82atribuyeronlatransicinsolgelauncambiodeentropadebido
a la presencia de molculas de agua ordenadas prximas a las cadenas
hidrfobasdePPG.Lapresenciademolculasdeaguaordenadasalrededorde
las cadenas hidrfobas minimiza el contacto aguacadena hidrfoba. Para
polmeros que presentan LCST, el aumento de temperatura permite la
deshidratacindelascadenashidrfobas,provocandounaumentodeldesorden
enlasmolculasdeaguayportantounaumentodelaentropa(S),loquehace
que sea un proceso favorable (Energa de Gibbs, G<0). En esta situacin, las
interaccionesaguapolmerosehacendesfavorablesmientrasquesefavorecen
lasinteraccionesaguaaguaypolmeropolmero.Estefenmeno,queseconoce
como efecto hidrofbico,83 es probablemente el mecanismo ms aceptado
paralaexplicacindelagelificacindedisolucionesdePluronic.32a,84
Sibienalprocesodegelificacinselehaprestadoatencin,latransicingelsol
en un calentamiento posterior ha sido poco estudiada. No obstante, se ha
propuestoquelatransicingelsolpuedeestarrelacionadaconelhinchamiento
queexperimentanlascadenasdePEGenlasmicelas,alaumentarlasolubilidad
conelincrementodetemperatura.32b
82
Vadnere,M.;Amidon,G.;Lindenbaum,S.;Haslam,J.L,IntJPharm1984,22,207218.
83
Southall,N.T.;Dill,A.D.;Haymet,D.J.,J.Phys.Chem.B,2002,106(3),521533.
84
Alexandridis, P.; Holzwarth, J. F.; Hatton, T. A., Macromolecules 1994, 27 (9), 2414
2425.
85
Wanka,G.;Hoffman,H.;Ulbricht,W.,JColloidInterfaceSci1990,268(2),101117.
86
Wanka,G.;Hoffman,H.;Ulbricht,W.,Macromolecules1994,27(15),41454159.
29
Captulo1Capitulok
87
Park,Y.J.;Yong,C.S.;Kim,H.M.; Rhee,J.D.;Oh,Y.K.;Kim,C.K.;Choi,H.G.,Int J
Pharm2003,263(12),105111.
88
(a) Basak, R.; Bandyopadhyay, R., Langmuir 2013, 29 (13), 43504356; (b) Lee, J. H.;
Kim,J.H.;Oh,S.H.;Kim,S.J.;Hah,Y.S.;Park,B.W.;Kim,D.R.;Rho,G.J.;Maeng,G.H.;
Jeon,R.H.;Lee,H.C.;Kim,J.R.;Kim,G.C.;Kim,U.K.;Byun,J.H.,Biomaterials2011,32
(22), 50335045; (c) Han, D. K.; Ahn, K. D.; Cha, S. H, 2007, Patent number WO
2007/064152A1;(d)Kumar,M.;Kumar,N.;Domb,A.;Arora,M.,AdvancesinPolymer
Science, 2002, 160, 45117 (e) Kavanov, a. V.; Alakhov, V. Y., Critical reviews in
therapeuticDrugCarrierSystems2002,19(1),173.
89
Park,K.M.;Lee,S.Y.;Joung,Y.K.;Na,J.S.;Lee,M.C.;Park,K.D.,ActaBiomaterialia
2009,5(6),19561965.
90
(a)Park,k.M.P.K.D.,MacromolecularResearch2008,16(6),517523;(b)Huang,K.;
Lee,B.P.;Ingram,D.R.;Messersmith,P.B.,Biomacromolecules2002,3(2),397406.
30
Captulo1
Porejemplo,Fangetal.91describieronunderivadodePluronicF127modificado
qumicamente en sus extremos mediante la unin a un polisacrido natural
comoelalginato(Figura1.16).
Figura1.16.EstructuraqumicadelderivadoPluronicF127AlginatodescritoporFanget
al.91
EstederivadoretienelaspropiedadesdegelificacindePluronicF127ymejora
la biocompatibilidad debido a la presencia del alginato. Hidrogeles de Pluronic
F127alginato se han utilizado como soporte para la administracin de forma
tpica y liberacin controlada de seleginina, frmaco indicado para el
tratamiento de desordenes depresivos. As mismo, se han utilizado en la
dispensacin, mediante inyeccin, de cisplatino en el tratamiento del cncer.
Estoshidrogelesmostraronunaliberacincontroladadecisplatinoascomoun
aumentodeladeposicindesteenzonastumorales.92
Rotondaetal.93combinaronPluronicF127conotropolisacridonatural,cido
hialurnico.Lapresenciadeestecidoprovocaladisminucindelatemperatura
degelificacinymejoralaspropiedadesdeadhesincelularenelhidrogel.Por
otra parte, la incorporacin covalente adicional de una protena bioactiva
implicada en los procesos de proliferacin celular y en procesos de
91
Chen,C.C.;Fang,C.L.;AlSuwayeh,S.A.;Leu,Y.L.;Fang,J.Y.,InternationalJournalof
Pharmaceutics2011,415(12),119128.
92
Fang,J.Y.;Hsu,S.H.;Leu,Y.L.;Hu,J.W.,J.Biomater.Sci.Polym.Ed.2009,20,1031
1047.
93
Mayol, L.; Quaglia, F.; Borzacchiello, A.; Ambrosio, L.; Rotonda, M. I. L., European
JournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics2008,70(1),199206.
31
Captulo1Capitulok
ConelfindemejorarlaestabilidadmecnicadehidrogelesbasadosenPluronic
sehanpropuestodiferenteshidrogelesquecombinansutermosensibilidadcon
lapresenciaenloscomponentesdegruposfuncionalesreactivosquepermitanla
formacindeotraredtridimensional,entrecruzadaqumicamente.Conestefin,
las reacciones ms utilizadas en la preparacin de hidrogeles derivados de
Pluronic mixtos (reticulacin fsica + reticulacin qumica), ha sido la
fotopolimerizacindegruposacrilatosometacrilatosolaadicindegrupostiol
(SH) a dobles enlaces (C=C) deficientes en electrones (reaccin tioleno),
mediante un mecanismo inico (adicin de Michael) o por un mecanismo
radicalariofotoiniciado.41,95
Laaproximacinsintticamssencillaseguidaparalaobtencindeestetipode
derivados de Pluronic ha sido la funcionalizacin de los dos grupos hidroxilo
terminales de la molcula de Pluronic con grupos acrilato o metacrilato, y su
entrecruzamiento por fotopolimerizacin consigo mismo96 o con otros grupos
reactivosdepolmerosbiodegradables,naturales97osintticos.98
94
Jung,H.H.;Park,K.;Han,D.K.,JournalofControlledRelease2010,147(1),8491.
95
Tasdelen, M. A.; Yagci, Y., Angewandte Chemie International Edition 2013, 52 (23),
59305938.
96
Lee,S.Y.;Tae,G.,JournalofControlledRelease2007,119(3),313319.
97
Chun,K.W.;Lee,J.B.;Kim,S.H.;Park,T.G.,Biomaterials2005,26,33193326.
98
(a)Park,J.H.;Moon,J.R.;Hong,K.H.;Kim,J.H.,JournalofPolymerResearch2011,18
(2),273278;(b)Pang,X.;Chu,C.C.,Polymer2010,51(18),42004210.
32
Captulo1
PEA
DiacrilatodePluronic
Figura1.17.Representacinesquemticadelhidrogelfotopolimerizadobasadoen
Poliesteramidas(PEA)ydiacrilatodePluronicF68,descritoporChuetal.98b
99
(a)Han,D.K.;Park,K.;Kim,J.J.,2010,PatentnumberWO2007/064152A1;(b)Cha,
M.H.;Choi,J.;Choi,B.G.;Park,K.;Kim,I.H.;Jeong,B.;Han,D.K.,JournalofColloidand
InterfaceScience2011,360(1),7885.
33
Captulo1Capitulok
Figura1.18.RutasintticadeloscopolmerosreactivosdePluronicF68descritospor
Hanetal.99a
Comounaalternativaalafotopolimerizacindeacrilatosometacrilatos,varios
autores han utilizado la reaccin de tiolenos para la reticulacin qumica de
hidrogeles derivados de Pluronic. Con este fin se han utilizado un significativo
nmero de molculas funcionalizadas con grupos tiol, para su interaccin
covalente con diacrilato de Pluronic, desde molculas de origen natural, como
por ejemplo dextrano tiolado,100 hasta el propio Pluronic con grupos tiol
terminales.101
100
(a)Lin,C.;Zhao,P.;Li,F.;Guo,F.;Li,Z.;Wen,X.,MaterialsScienceandEngineering:C
2010,30(8),12361244;(b)Niu,G.;Zhang,H.;Song,L.;Cui,X.;Cao,H.;Zheng,Y.;Zhu,
S.;Yang,Z.;Yang,H.,Biomacromolecules2008,9(10),26212628.
101
(a)Cellesi,F.;Tirelli,N.,JournalofMaterialsScience:MaterialsinMedicine2005,16
(6), 559565; (b) Cellesi, F.; Tirelli, N.; Hubbell, J. A., Biomaterials 2004, 25 (21), 5115
5124; (c) Cellesi, F.; Tirelli, N.; Hubbell, J. A., Macromolecular Chemistry and Physics
2002,203(1011),14661472.
34
Captulo1
Si bien muchos ejemplos del uso del Pluronic en hidrogeles han estado
destinados a sus aplicaciones en IT, en la bibliografa se encuentran tambin
ejemplos de nanogeles termosensibles, en concreto derivados de diacrilato de
Pluronic, la mayora de ellos obtenidos por fotopolimerizacin, algunos de los
cualessecomentanacontinuacin.75bf
102
Choi, W. I.; Tae, G.; Kim, Y. H., Journal of Materials Chemistry 2008, 18 (24), 2769
2774.
35
Captulo1Capitulok
Liberacingradual
Figura1.19.Liberacingraduala37Cdeunaprotenafluorescentecargadaen
nanogelesdediacrilatodePluronicF127,descritaporTaeetal.102
Asmismo,sehandescritonanogelespreparadosapartirdelacopolimerizacin
de diacrilato de Pluronic con distintos polisacridos naturales funcionalizados
congruposfotopolimerizables.76b,c,e
Porejemplo,Taeetal.76b copolimerizarondiacrilatodePluronic(F127yF68)con
el polisacrido quitosano, modificado qumicamente con grupos metacrilato
(Figura 1.20). Los nanogeles obtenidos mostraron baja citotoxicidad tras 24
horas,ascomointernalizacinenclulastumorales.
103
Choi , W. I.; Hyun Lee , J.; Kim , J. Y.; Kim , J.C.; Kim , Y. H.; Tae , G., Journal of
ControlledRelease2012,157,272278.
36
Captulo1
Figura1.20.Esquemadesntesisdelosnanogelesderivadosdequitosanocongrupos
metacrilato(GMAchitosan)ydediacrilatodePluronic(DAPluronic).76b
Siguiendounprocedimientosimilar,Wangetal.76ccopolimerizarondiacrilatode
Pluronic con sulfato de condroitina con grupos metacrilato, con resultados
anlogos a lo publicado por Tae et al.76b en cuanto a citotoxicidad e
internalizacinenclulastumorales.Ademsestosnanogelesseutilizaronpara
encapsular y liberar de forma controlada Doxorubicina, un frmaco
anticancergenohidrfobo,conungrannmerodeefectossecundarioscuando
seadministradeformalibre.
37
CAPTULO2
OBJETIVOSYPLANTEAMIENTODETRABAJO
Captulo2
2.1.OBJETIVOS
Elobjetivoprincipaldeestatesisdoctoralhasidoeldiseo,sntesis,preparacin
y caracterizacin de hidrogeles termosensibles y fotopolimerizables, para
aplicacin en Ingeniera de Tejidos y sistemas de encapsulacin y Liberacin
controladadefrmacos.
Dendrn
Copolmerobloque
Gruposfuncionalesterminales
Figura2.1.Diseoestructuraldemacromolculasdendrticolinealdendrticoobjetode
estudio.
41
Captulo2Capitulok
polmerotribloqueABA(colorverdeyazulenlaFigura2.1),dosestructurasde
tipo dendrtico en las posiciones terminales (color morado) y distintos grupos
fotopolimerizables terminales que difieren en naturaleza qumica y en nmero
(colorrojo).
Laestructuraqumicapropuestadeestosbloquesrespondeadistintosaspectos.
Conelobjetivodeconseguircompuestosconpropiedadesdeautoensamblajey
termosensibilidad, se ha elegido un copolmero bloque de tipo Pluronic como
bloquelinealcentral,enconcretolavariedadPluronicF127,79a,88a,104unodelos
ms utilizados para aplicaciones biomdicas y aprobado por la FDA (Food and
DrugAdministration)endiferentesaplicacionesenelcampofarmacuticopara
su uso in vivo en humanos:105 disolucin oftlmica,106 administracin oral 107 o
usotpico(Figura2.2).
104
(c)Manaspon,C.;ViravaidyaPasuwat,K.;Pimpha,N.,JournalofNanomaterials2012;
(d)Abdi,S.I.H.;Choi,J.Y.;Lee,J.S.;Lim,H.J.;Lee,C.;Kim,J.;Chung,H.Y.;Lim,J.O.,
Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2012, 9 (1), 19; (e) Antunes, F. E.;
Gentile, L.; Oliviero Rossi, C.; Tavano, L.; Ranieri, G. A., Colloids and Surfaces b:
Biointerfaces 2011, 87 (1), 4248; (f) Shachaf, Y.; GonenWadmany, M.; Seliktar, D.,
Biomaterials2010,31(10),283647.
105
Approved drug products. Poloxamer 407 o Pluronic F127. USFDA, 2003,
www.accesdata.fda.gov/scripts/cder/igg/.
106
Li,H.;Sung,K.C.,JournalofControlledRelease2000,69(3),379388.
107
Padilla,M.;Clark,G.T.;Merril,R.L.,J.Am.Dent.Assoc.2000,131(2),184195.
42
Captulo2
Figura2.2.ConcentracionesmximaspermitidasdePluronicF127(Poloxamer407)
paradistintasaplicaciones,aprobadasporlaFDA.
Figura2.3.EstructuraqumicadePluronicF127.
43
Captulo2Capitulok
Figura2.4.Estructuraqumicadecido2,2bis(hidroximetil)propinico(bisMPA).
ApesardelcrecientenmerodeaplicacionestantodelPluronic 104ab,111como
de los polisteres dendrticos110 de forma individual, hasta la fecha no se han
descritohbridosdendrticolinealdendrticoqueloscombinen.
108
Feliu, N.; Walter, M. V.; Montaez, M. I.; Kunzmann, A.; Hult, A.; Nystrm, A.;
Malkoch,M.;Fadeel,B.,Biomaterials2012,33(7),19701981.
109
Zhang,H.;Patel,A.;Gaharwar,A.K.;Mihaila,S.M.;Iviglia,G.;Mukundan,S.;Bae,H.;
Yang,H.;Khademhosseini,A.,Biomacromolecules2013,14(5),12991310.
110
Carlmark, A.; Malmstrom, E.; Malkoch, M., Chemical Society Reviews 2013, 42 (13),
58585879.
111
Wu, C.J.; Gaharwar, A. K.; Chan, B. K.; Schmidt, G., Macromolecules 2011, 44 (20),
82158224.
44
Captulo2
2.2.PLANTEAMIENTODELTRABAJO
Paralaconsecucindelobjetivoprincipaldeestetrabajodeinvestigacinseha
planteado la preparacin de dos series diferentes de compuestos dendrtico
linealdendrticoquerespondenalaestructuraantescomentada:
1.CopolmerosbloquedendrticolinealdendrticoderivadosdePluronic
F127 y de dendrones de bisMPA, y su anlogo lineal, con grupos acrilato
terminales (Serie A, Figura 2.5), que permitan la preparacin de hidrogeles
basadosenpoliacrilatosmediantepolimerizacinfotoinducida.
2.CopolmerosbloquedendrticolinealdendrticoderivadosdePluronic
F127ydedendronesdebisMPA,ysuanlogolineal,congrupostiolterminales
(SerieB,Figura2.6),quepermitanlapreparacindehidrogelesbasadosentiol
enos,mediantereaccinfotoinducida.Paralaincorporacindelosgrupostiolse
han seleccionado restos de tipo cisteamina unidos a los grupos hidroxilo
terminalesmedianteenlacescarbamato.
45
Captulo2Capitulok
Figura2.5.EstructuraqumicaynomenclaturaparalasmolculasdelaSerieAcon
gruposacrilatoterminales.
46
Captulo2
O
H
N O O SH
HS O O N
99 67 99 H
O
F127SH2
O
H
N O O SH
HS O N
O O H
O O O O
H
N O 99 67 99 SH
HS O O N
F127SH4 H
O
O O
HS SH
NHO O O O NH
O
O O
HS SH
NH O O O O NH
O O O NH
NH O O O O SH
HS O
O O 99 67 99 O
O O
NH O F127SH8 O O NH
HS SH
O O
Figura2.6.EstructuraqumicaynomenclaturaparalasmolculasdelaSerieBcon
grupostiolterminales.
Elplandetrabajodesarrolladohaimplicadolossiguientesapartados:
47
Captulo2Capitulok
ConelfindedesarrollarMaterialesparaaplicacionesenIngenieradeTejidos,
eltrabajodesarrolladosehaconcretadoen:
Preparacindehidrogelesmacroscpicosporaccindelatemperaturay
porfotopolimerizacin.
CaracterizacindesumorfologainternaporSEM.
Anlisisdesusprocesosdedegradacin.
Estudiosdeviabilidadcelular.
Evaluacindesuspropiedadesmecnicas.
48
CAPTULO3
HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:
POLIACRILATOS
Captulo3
EnestetercercaptulodelaMemoriaseexponeeltrabajodesarrolladorelativo
alapreparacinycaracterizacindelosdiferentesderivadosdePluronicF127
tiposterenlauninentreelpolmeroylasestructurasdendrticasydegrupos
acrilatocomounidadesreactivasterminales.
siguientesapartados:
Sntesisycaracterizacinestructuraldelosproductos
Determinacindelaspropiedadessolgeldelosproductos
Preparacindeloshidrogelesfotopolimerizados
CaracterizacinmorfolgicadelaestructurainternaporSEM
Estudiodeladegradacindeloshidrogelesfotopolimerizados
Ensayosdeviabilidadcelular
Caracterizacinmecnicadeloshidrogelesfotopolimerizados
51
Captulo3
3.1.SNTESISYCARACTERIZACIN
3.1.1Derivadolineal:F127Ac2
Esquema3.1.RutasintticaparalaobtencindeF127Ac2.
Condicionesdereaccin:i)Clorurodeacriloilo,TEA,diclorometano.
AnteladificultadquepresentaelseguimientodelafuncionalizacindePluronic
F127porlosmtodoscromatogrficoshabitualesenqumicaorgnica,seopt
por utilizar 1HRMN como tcnica de deteccin de las seales del nuevo grupo
funcionalintroducido,ascomoporlaFTIRparalaobservacindelasbandasde
vibracin de los enlaces caractersticos de cada compuesto. A continuacin se
comentan de forma detallada los espectros de 1HRMN as como los de FTIR,
quesecomplementanconotrastcnicasadicionalesenelcasodesernecesario.
53
Captulo3Captulokk
observlaaparicindedossealescaractersticas.Estassealescorrespondena
los grupos acrilato unidos al polmero, que aparecen como 3 dobletes de
dobletesentre5.7y6.5ppm(protonesI,JyJ)ylasealcorrespondientealos
protonesdelosgruposCH2delacadenadePEGdirectamenteunidosalenlace
sterformado(protonesG),tripletequeaparecea4.31ppm.
A
D,E
H2O
C
CDCl3
B
JIJ G F
7.4 7.0 6.6 6.2 5.8 5.4 5.0 4.6 4.2 3.8 3.4 3.0 2.6 2.2 1.8 1.4 1.0
f1 (ppm)
Figura3.1.Espectrosde1HRMNdePluronicF127comercial(partesuperior)yde
F127Ac2(parteinferior)enCDCl3,500MHz.
54
Captulo3
Transmitancia(u.a.)
Vibracinde
tensinC=O
a1724cm1
PluronicF127 F127Ac2
3.1.2.Derivadosdendrticos:F127Ac4yF127Ac8
a)Crecimientodelageneracin.
b)Desproteccindelosgruposhidroxiloporhidrogenolisis.
c)Introduccindegruposacrilato.
d)CaracterizacinporGPCyMALDIMS.
a)Crecimientodelageneracin
55
Captulo3Captulokk
Esquema3.2.Rutasintticaparalaobtencindedendronesdeprimera[2]ysegunda
generacin[5].Condicionesdereaccin:i)2,2dimetoxipropano,TsOH,acetona,ii)
bromurodebencilo,KOH,dimetilformamida,iii)DCC,DPTS,diclorometano,iv)Pd/C,
acetatodeetilo.
112
(a) Blasco, E.; Barrio, J. d.; SanchezSomolinos, C.; Pinol, M.; Oriol, L., Polymer
Chemistry2013,4(7),22462254;(b)Blasco,E.;Barrio,J.d.;Piol,M.;Oriol,L.;Berges,
C.;Snchez,C.;Alcal,R.,Polymer2012,53(21),46044613;(c)delBarrio,J.s.;Oriol,L.;
Alcal,R.;Snchez,C.,Macromolecules2009,42(15),57525760.
56
Captulo3
Elacoplamientodelosdendronesdeprimera[2]ysegundageneracin[5]con
Pluronic F127 se realiz por reaccin de esterificacin de Steglich entre los
gruposcidodelosdendronesylosgruposhidroxilodePluronicF127(Esquema
3.3).Sinembargo,estareaccinnoproporcionlafuncionalizacincompletadel
copolmerobloque,siendoimposiblelaseparacindelpolmerosinfuncionalizar
oparcialmentefuncionalizado,delcompletamentefuncionalizado,comosepudo
comprobar por la incorrecta correlacin del valor de las integrales
correspondientes a Pluronic F127 y las de los fragmentos dendrticos, en sus
correspondientesespectrosde1HRMN.
Esquema3.3.Rutasintticaconvergenteparalaobtencindelosderivadosdendrticos
deprimeraysegundageneracin,conlosgruposhidroxiloperifricosprotegidosen
formadeacetal.Condicionesdereaccin:i)[2],DCC,DPTS,diclorometano.ii)[5],DCC,
DPTS,diclorometano.
Estosresultadosllevaronaplanteardeformaalternativaelempleodelmtodo
de sntesis divergente utilizado por Frchet62 para la obtencin de copolmeros
bloquedendrticolinealdendrticoderivadosdebisMPAyPEG.Enestecaso,el
crecimiento de generacin se realiza directamente sobre el ncleo de PEG,
alternando etapas de crecimiento de generacin y desproteccin. Para el
crecimiento de generacin se utiliza un anhdrido derivado de bisMPA [7]
57
Captulo3Captulokk
(Esquema3.4),conelcualseconsiguenfuncionalizacionescompletas,elevados
rendimientosypurificacionessencillas.
Esquema3.4.RutasintticaparalaobtencindelanhdridoderivadodebisMPA[7].
Condicionesdereaccin:i)TsOH,acetonaii)DCC,diclorometano.
Finalmente,lasntesisdeloscompuestossedesarrollconformealarutaquese
muestra en el Esquema 3.5. La reaccin del anhdrido [7] con la molcula de
Pluronic F127 proporcion el derivado dendrticolinealdendrtico de primera
generacin protegido, F127Bn2 [8], con rendimientos superiores al 95%. Otra
ventaja de esta reaccin es la facilidad de purificacin, que consiste en un
pretratamiento del crudo de reaccin con metanol para la destruccin del
anhdrido[7]enexceso,queseconvierteenelcorrespondientecidobenciliden
2,2bis(oximetil)propinico[6]yqueadiferenciadelanhdrido[7]essolubleen
dietil ter, lo que permite la posterior precipitacin de F127Bn2 [8] en dietil
58
Captulo3
terfro.Deestaformaseobtieneelproductobuscadotrasfiltracinylavado
condietilterfro.
Esquema3.5.Rutasintticadivergenteparalaobtencindelosderivadosdendrticosde
primeraysegundageneracin,ensusformasprotegidascongruposbenciloyformas
desprotegidascongruposhidroxiloterminales.
Condicionesdereaccin:i)[7],DMAP,diclorometano,ii)Pd/C,acetatodeetilo.
59
Captulo3Captulokk
LacompletafuncionalizacindePluronicF127paradarF127Bn2 [8]sesigui
por1HRMNyporFTIR.
A
CDCl3
D,E,I
C
B
J
N,PyQ L I G F
1
Figura3.3.Espectrode HRMNdeF127Bn2enCDCl3,400MHz.
Analizandoelespectrodemayoramenordesplazamientoqumico,a7.427.32
ppmaparecenlassealescorrespondientesalosprotonesaromticos(N,PyQ),
a 5.44 ppm aparece el protn benclico (L), a 4.66 ppm se observa un doblete
que corresponde a uno de los protones diastereotpicos del bisMPA (I),
apareciendoelotrodoblete(I)enmascaradoporlassealesdelcopolmeroque
estn entre3.373.82 ppm. Estos protones diastereotpicos se describen como
un sistema AX considerando la relacin II/JII > 4 [II (diferencia de
frecuencias entre las seales) y JII (constante de acoplamiento entre los
ncleos)].A4.36ppmsepuedeverlaaparicindeuntripletecaractersticoque
integrapor4protonesyquecorrespondealosprotonesGdelbloquedePEGdel
60
Captulo3
PluronicF127adyacentesalnuevoenlacesterformadoentreelpolmeroyla
parte dendrtica. Por ltimo, a 1.05 ppm aparece un singlete que integra por 6
protonescorrespondientesalosgruposmetilodelaestructuradebisMPA(J).
Losvaloresdelasintegralesdelosnuevosgruposintroducidosenlamolculade
Pluronic F127 concuerdan con lo esperado considerando los valores de las
integralesdelosprotonestipoAytipoBdeestamolcula.
80
70
60
Transmitancia%
50
Vibracinde
40
tensindel
enlaceC=O 30
a1737 cm1 20
10
0
3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.4.EspectroFTIRdeF127Bn2,muestrapreparadaapartirdelcompuestoneto
fundidosobrepastilladeNaCl.
61
Captulo3Captulokk
62
Captulo3
A
D,E,L
CDCl3 C
N
B
I H2O J
R,S,T P
L G F
183.0
13.0
66.9
12.0
8.2
4.0
8.7
7.8
4.3
5.0
6.4
1
Figura3.5.Espectrode HRMNdeF127Bn4enCDCl3,300MHz.
Transmitancia(u.a.)
Desaparicin
vibracinOH
a3482cm1
F127OH4 F127Bn4
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.6.EspectrosFTIRdeF127OH4yF127Bn4,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.
63
Captulo3Captulokk
b)Desproteccindelosgruposhidroxiloporhidrogenolisis.
Aunquelasdesproteccionestuvieronlugardeformacompleta,comoseobserv
por 1HRMNprincipalmenteporladesaparicindelassealescorrespondientes
alosgruposaromticos,secomprobunamalaconcordanciaentrelosvalores
de las integrales correspondientes a los protones tipo G, adyacentes al enlace
sterentrelapartedendrticayelpolmero,ylosprotonestipoAyBdelncleo
polimrico,loqueseatribuyaunaroturaparcialdelsistemadendrtico.Ante
estosresultadossedescartelusodelamezcladiclorometano/metanolparala
realizacindelasdesprotecciones.
EnladesproteccindeF127Bn2[8]paraobtenerF127OH4[9](Figura3.7),se
confirmladesaparicindelassealesdelosprotonesbenclicosyaromticos
mediante 1HRMN, as como el desplazamiento a campos mayores de los
protonestipoIeIcorrespondientesalosgruposCH2delsistemadebisMPA,
que en este caso aparecen enmascarados junto a los protones del polmero,
entre 3.37 y 3.82 ppm. La seal de los protones G, prximos al enlace ster
aparecea4.34ppmylosmetilosdelsistemadebisMPA(J)a1.11ppm.
64
Captulo3
A
C J
B
D,E
CDCl3
1
Figura3.7.Espectrode HRMNdeF127OH4enCDCl3,300MHz.
Transmitancia(u.a.)
Aparicin VibracinC=O
vibracinOHa
3482cm1 F127Bn2 F127OH4
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.8.EspectrosFTIRdeF127Bn2yF127OH4,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.
65
Captulo3Captulokk
LadesproteccindeF127Bn4[10]queproporcionF127OH8[11]seconfirm
por la desaparicin de los protones del sistema benclico en el espectro de 1H
RMN (Figura 3.9). Adems los protones tipo I que en el precursor protegido
aparecan como un singlete, aparecen como un cuadruplete correspondiente a
un sistema AB a 4.32 ppm (IIq, 8H, II=35 Hz, JII= 11.2 Hz), considerando la
relacin II/JII < 4 [II (diferencia de frecuencias entre las seales) y JII
(constante de acoplamiento entre los ncleos)]. Parte de este cuadruplete
aparece solapado junto con el triplete a 4.26 ppm de los protones G del
polmero, adyacentes al enlace ster, siendo el valor total de la integral de 12
protones,8 correspondientesalosprotonesIeIyotros4correspondientesa
los protones G. Los protones L correspondientes a los grupos CH2 de las
estructuras de bisMPA externas, aparecen junto con las seales del polmero
entre3.37y3.82ppm.
Ademsseobservalaaparicindeunsingletedebidoalosgruposmetilodela
estructura de bisMPA interno (J) y otro singlete de los grupos metilo de las
estructuras de bisMPA externas (N). Los valores de las integraciones de los
extremosdendrticossoncoherentesconlasintegracionesdelosprotonesAyB
dePluronicF127.
66
Captulo3
L,D,E C
N
B
CDCl3
J
IG,I
207.4
67.0
12.3
4.6
8.7
6.4
1
Figura3.9.Espectrode HRMNdeF127OH8enCDCl3,400MHz.
EstudiosadicionalesdeHSQC,quemuestranlacorrelacinprotncarbonoaun
enlace,permitieronlacorrectaasignacindelassealesdecarbonoascomola
observacindelosprotonesdiastereotpicostipoIeIdescritosanteriormente
(Figura3.10).
II,G
Figura3.10.EspectrodeHSQCdeF127OH8enCDCl3,500MHz.
67
Captulo3Captulokk
EnelespectroFTIR(Figura3.11)seobservlaaparicindelabandaa3457cm1
correspondientesalavibracindelosgruposhidroxilosdelcompuestoF127OH
8, as como la presencia de la banda correspondiente a la vibracin de tensin
delenlacecarbonilodelgrupostera1733cm1.
Transmitanciau.a.
VibracinOH VibracinC=O
3457cm1 1733 cm1
F127Bn4 F127OH8
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.11.EspectroFTIRdeF127Bn4yF127OH8,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.
c)Introduccindegruposacrilato
UnavezincorporadoslosdendronesderivadosdebisMPAdeprimeraysegunda
generacin al ncleo de Pluronic F127, los grupos hidroxilo terminales de los
compuestos F127OH4 [9] y F127OH8 [11] se funcionalizaron mediante
esterificacin con cloruro de acriloilo en presencia de TEA (Esquema 3.6), de
forma similar a la descrita en el apartado 3.1.1. para la obtencin del derivado
acriladolineal.Debidoalaelevadadensidaddegruposacrilatopormolcula,se
aadi a la mezcla de reaccin una pequea cantidad de 4metoxifenol como
inhibidor de radicales, para evitar la polimerizacin. La esterificacin de los
gruposhidroxiloperifricostranscurrideformacompleta,yelaislamientodel
compuesto acrilado implic procesos de purificacin sencillos y rendimientos
satisfactorios.
68
Captulo3
HO O
O OH
O
HO O O
HO O O OH
O O OH
O O
99 67 99 O
HO O
[11] F127OH8 O OH
O
i) 4782% O
O O
O O
O
O O
O O
O
O O O O
O O O
O O O 99 67 99
O
O
O O O O
[13] F127Ac8
O O
Esquema3.6.Sntesisdeloscompuestosacriladosdeprimeraysegundageneracin
F127Ac4[12]yF127Ac8[13].Condicionesdereaccin:i)clorurodeacriloilo,TEA,4
metoxifenol(inhibidor),diclorometano.
Lacompletatransformacindelosgruposterminaleshidroxiloengruposacrilato
seconfirmpor1HRMNyporFTIR.
69
Captulo3Captulokk
D,E B H2O A
CDCl3
J
I,I
I
NMN
G F
211.8
12.4
75.8
3.8
3.6
4.0
6.1
1
Figura3.12.Espectrode HRMNdeF127Ac4enCDCl3,300MHz.
70
Captulo3
elgrupocarbonilodelenlacestermsprximoalncleopolimrico(H)a172.5
ppmyelcarbonilodelgrupoacrilato(L)a165.4ppm.
Figura3.13.Espectrode13CRMNdeF127Ac4enCDCl3,300MHz.
A
D,E
CDCl3
C
N,NM GI K J
H L
EnelespectroFTIRdeF127Ac4(Figura3.14)secompruebasufuncionalizacin
porlacompletadesaparicindelavibracindelgrupohidroxiloa3482cm1del
precursorF127OH4.
Transmitancia(u.a.)
F127OH4 F127Ac4
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.14.EspectrosFTIRdeF127OH4yF127Ac4,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.
71
Captulo3Captulokk
CDCl3
D,E
C
L,I,G
B N,J
H2O
QPQ F
201.0
30.6
68.0
12.7
8.3
8.8
8.4
5.9
6.3
1
Figura3.15.Espectrode HRMNdeF127Ac8enCDCl3,300MHz.
Los espectros HSQC y HMBC (Figura I.1 y I.2 del Anexo I) muestran las
correlaciones protncarbono a uno y dos tres enlaces respectivamente, que
estndeacuerdoconlaestructuradelamolculaestudiada.
72
Captulo3
Transmitancia(u.a.)
F127OH8 F127Ac8
Comonormageneral,losproductoscongruposacrilatoensuestructuraqumica
fueronalmacenadosa4C,avacoyenoscuridadparaevitarsupolimerizacin.
73
Captulo3Captulokk
EnlaFigura3.17,amododeejemplo,semuestraelcromatogramadePluronic
F127comercialutilizado,quepresentadosdistribucionesdepesosmoleculares
conlacolumnaStyrageHR1THFWaters.
1500
1000
LSU
500
0
10 12 14 16 18 20
Tiempo(minutos)
Figura3.17.CromatogramadeGPCdePluronicF127utilizandocolumnasStyrageHR1
THFWaters.
Sinembargo,elusodecolumnasPLgel5mMIXEDCdeAgilentTechnologiesno
permite una separacin adecuada de las dos distribuciones de pesos
moleculares,aunquesmuestralapresenciadediferentespesosmoleculares,tal
ycomoseobservaenlaFigura3.18paraelderivadoF127Ac8.
25
20
15
10
LSU
5
0
10 12 14 16 18 20
Tiempo(minutos)
Figura3.18.CromatogramadeGPCdeF127Ac8utilizandocolumnasPLgel5mMIXED
CdeAgilentTechnologies.
74
Captulo3
Tabla3.1.Pesomolecularpromedioennmero,ndicedepolidispersidadypeso
molecularcalculadoparalosderivadosdePluronicF127.
a
Mn:Pesomolecularpromedioennmeroeng/molobtenidoporGPC
b
PDI:ndicedepolidispersidad(Mw/Mn)obtenidoporGPC
c
Pmcalculado:Pesomolecularcalculadoeng/molcomolasumadelos
pesosmolecularesdelosbloquesindividuales
d
ColumnaStyrageHR1THFWaters
e
ColumnaPLgel5mMIXEDCdeAgilentTechnologies
SicomparamoslosvaloresdeMnobtenidosporGPC,independientementedela
columna utilizada, con el Pm calculado, se obtiene una clara desviacin entre
ellos,tantoparaPluronicF127comoparatodossusderivados,talycomoseha
observado para otros copolmeros bloque dendrticolineales descritos en la
75
Captulo3Captulokk
bibliografa.112c,113ElpesomoleculardeterminadoporGPCesunpesomolecular
aparente, debido a las diferencias de volumen hidrodinmico existentes entre
Pluronic F127 y sus derivados, y los de estndares de poliestireno utilizados
paralacalibracin.
113
MartnRapn,R.;Marcos,M.;Omenat,A.;Serrano,J.L.;Luckhurst,G.R.;Mainal,A.,
ChemistryofMaterials2004,16(24),49694979.
76
Captulo3
Intensidad(%)
50 13041
0
2000 7000 12000 17000
m/z
100 5050.2 F127Bn2
Intensidad(%)
13297.2
50
0
2000 7000 12000 17000
m/z
100
Intensidad(%)
5213.9 F127OH4
50 13708.1
0
2000 7000 12000 17000
m/z
100 F127Bn4
Intensidad(%)
5615.9
13844.4
50
0
2000 7000 12000 17000
m/z
100
Intensidad(%)
5286.1 F127OH8
50 13693.8
0
2000 7000 12000 17000
m/z
Figura3.19.MALDIMSdelPluronicF127utilizadoysusderivadosdendrticos.
EnlaFigura3.20sepuedeobservareldesplazamientodeladistribucindepesos
amayoresrelacionesmasa/cargatraslafuncionalizacindePluronicF127(en
rojo) con dendrones derivados de bisMPA de segunda generacin terminados
en grupos acrilato, compuesto F127Ac8 (en morado). La introduccin de los
extremos dendrticos supone un aumento de peso molecular con respecto a
77
Captulo3Captulokk
100
PluronicF127
90
80 F127Ac8
70
Intensidad(%)
60
50
40
30
20
10
0
2000 7000 12000 17000
m/z
Figura3.20.ComparacindelosespectrosdeMALDIMSdePluronicF127yF127Ac8.
3.2.DETERMINACINDELASPROPIEDADESSOLGEL
78
Captulo3
3.2.1.Estudiodegelificacinmedianteelmtododeinversindelvial
SOL T GEL
Figura3.21.Procesoreversibledegelificacinobservadoporelmtododeinversindel
vialyproducidoporelaumentodelatemperatura.
EnlaTabla3.2semuestranlastemperaturasdetransicindefasesolgelygel
sol obtenidas para los materiales estudiados. Con la determinacin de las dos
temperaturas queda reflejado el intervalo de existencia del estado gel.
Experimentalmente, ambas temperaturas se establecieron siguiendo el
protocolodescritoenelapartado6.2.a,delaParteExperimental.
79
Captulo3Captulokk
Tabla3.2.Temperaturasdetransicindefasesdelosdiferenteshidrogelesobtenidas
porelmtododeinversindelvial.
80
Captulo3
95
85
PluronicF127
75 F127Ac2
Temperatura(C)
F127Bn2
65
F127OH4
55 F127Ac4
45 F127OH8
F127Ac8
35
25
15
15 17 19 21 23 25 27
Concentracion(%w/v)
Figura3.22.Diagramadefasesdeloshidrogeles,preparadosenPBS10mMpH7.4,con
PluronicF127yconsusdiferentesderivados,aconcentracionesdel16.5%,18%,20%,
23%y25%(w/v).
ParaelestudioporDSCseaplicelprocedimientoexplicadoenelAnexoII,que
proporcionatermogramasconlaprimeraderivadadelflujodecalorconrespecto
altiempofrentealatemperatura.Elprimerpicoendotrmicoobservadoeneste
tipo de termogramas, identifica la CMT, que es la temperatura a la cual se
produce la micelizacin para una disolucin de polmero de una determinada
concentracin,mientrasqueelsegundopicocorrespondealaLCST.
81
Captulo3Captulokk
Amododeejemplo,enlaFigura3.23,semuestranlostermogramasdeDSCpara
F127Ac4 para tres de las concentraciones estudiadas. En cada uno de los
termogramassehamarcadolatemperaturademicelizacin(enmorado),laLCST
(enazul)ylaLCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial(enverde).
ParaelderivadoF127Ac4al16.5%(Figura3.23(a))noseobservaelpicodela
gelificacinyaqueelpolmeronoescapazdeformarhidrogelestermosensibles,
loqueescoherenteconloobtenidoconelmtododeinversindelvial.
Paralasconcentracionesintermedias,18%y20%(Figura3.23(b)),lospicosde
gelificacinseobservancomounpicodebajaintensidad.
Estavariacindeintensidaddelospicosdebidosalagelificacinenfuncindela
concentracin es extensible al resto de copolmeros bloque lineal y dendrtico
linealdendrtico.
82
Captulo3
a) 4 14.5C 16.5%
3
Deriv.Flujocalor
(mW/min)
2
1
0
1
2
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
b) 4 20%
3 10.6C
Deriv.Flujocalor
2
(mW/min)
1
19.7C 34.0C
0
1
2
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
4 9.4C 25%
c)
3
Deriv.Flujocalor
2
(mW/min)
1
28C
0 18.0C
1
2
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
Figura3.23.TermogramasdeDSCdeF127Ac4:a)al16.5%(w/v),b)al20%(w/v)yc)
25%(w/v)enPBS10mMpH7.4,correspondientesalarepresentacindeladerivada
delflujodecalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclode
calentamiento;enmorado,Tdemicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCST
porDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial.
83
Captulo3Captulokk
3.2.3.Discusindelosresultados
Comosepuedecomprobar,losresultadosdeLCSTobtenidosporelmtodode
inversin del vial y los determinados por DSC, no coinciden. Por DSC las
temperaturasobtenidassonmenoresqueporelmtododeinversindelvial.Sin
embargo,latemperaturaobservadaporelmtododeinversindelvialpresenta
concordancia con la temperatura a la que se estabiliza la lnea base del
termograma,talycomosepuedeobservarenlaFigura3.23(b)y(c).
Lasignificativadiferenciadetemperaturasobservadaenfuncindelastcnicas
utilizadas podra deberse a la lenta velocidad de gelificacin observada
experimentalmenteenestosmateriales,encomparacinconelcomportamiento
que presentan los materiales del Captulo 4 de esta Memoria, para los que se
observmayorvelocidaddegelificacinymejorconcordanciadeestosdatos.
84
Captulo3
Tabla3.3.LCSTytemperaturademicelizacindediferentesmaterialesobtenidascon
diferentesmetodologas.
LCST
Concentracin LCSTpor Micelizacin
inversin
%(w/v) DSC(C) (C)
vial(C)
16.5% 40 23 13.8
18% 34 21 13.2
F127Ac2 20% 28 20 10.8
23% 25 19 10.5
25% 24 21 12.8
16.5% NOGEL NOGEL 14.2
18% NOGEL NOGEL 13.9
F127Bn2 20% NOGEL NOGEL 12.8
23% 38 20 11.4
25% 30 20 10.3
16.5% NOGEL NOGEL 11.7
18% NOGEL NOGEL 15
F127OH4 20% 31 20 11.5
23% 25 18 8.2
25% 22 19 9.1
16.5% NOGEL NOGEL 14.5
18% 37 24 13.6
F127Ac4 20% 34 20 10.8
23% 31 20 10.6
25% 28 18 9.4
16.5% NOGEL NOGEL 12.8
18% NOGEL NOGEL 12.4
F127Bn4 20% NOGEL NOGEL 10.7
23% NOGEL NOGEL 8.5
25% NOGEL NOGEL 6.3
16.5% NOGEL NOGEL 13.3
18% NOGEL NOGEL 9
F127OH8 20% NOGEL NOGEL 14.1
23% 31 19 10.3
25% 25 18 8.8
16.5% NOGEL NOGEL 13.1
18% NOGEL NOGEL 13.4
F127Ac8 20% NOGEL NOGEL 13.2
23% 37 25 15.9
25% 35 19 8.7
85
Captulo3Captulokk
114
Joo,M.K.;Park,M.H.;Choi,B.G.;Jeong,B.,JournalofMaterialsChemistry2009,19
(33),58915905.
86
Captulo3
3.3.PREPARACINDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS
Figura3.24.Procesodeformacindeloshidrogelesfotopolimerizadosa37C.a)estado
sola4C,b)estadogela37C,c)hidrogeldesmoldadotrasfotopolimerizacin.
87
Captulo3Captulokk
solubilidadenaguaybiocompatibilidadcomosehadescritoenelCaptulo1de
laMemoria.
88
Captulo3
3.4.CARACTERIZACINDELAMORFOLOGIAINTERNAPORSEM
Para llevar a cabo el estudio por SEM de los hidrogeles fotopolimerizados, las
muestrassefracturarontalycomosedescribeenelapartado6.2.d.,delaParte
Experimental.
EnlasFiguras3.25,3.26y3.27serecogenlasimgenesdeSEMdelosdiferentes
materiales en las que se pueden ver las estructuras internas porosas de los
hidrogeles fotopolimerizados derivados de F127Ac2, F127Ac4 y F127Ac8,
respectivamente.
50m 50m
a)P/H18F127Ac2 b)P/H18F127Ac2
50m 30m
c)P/H23F127Ac2 d)P/H23F127Ac2
Figura3.25.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127Ac2a
concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd).
89
Captulo3Captulokk
50m 5m
a)P/H18F127Ac4 b)P/H18F127Ac4
100m 30m
c)P/H23F127Ac4 d)P/H23F127Ac4
Figura3.26.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127Ac4a
concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd).
50m 5m
a)P/H18F127Ac8 b)P/H18F127Ac8
50m 5m
c)P/H23F127Ac8 d)P/H23F127Ac8
Figura3.27.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127Ac8a
concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd).
90
Captulo3
Todosloshidrogelesestudiadospresentanunamorfologaporosairregular.Con
elfinderealizarelestudiocomparativo,enlaTabla3.4,serecogenlosintervalos
correspondientesalosvaloresmnimoymximodetamaodeporoobservados
porSEM(estudionoestadstico).
Tabla3.4.TamaodeporodeloshidrogelesdederivadosacriladosdePluronic
observadosporSEM.
HIDROGEL Tamaosdeporoa(m)
P/H18F127Ac2 225
P/H23F127Ac2 215
P/H18F127Ac4 225
P/H23F127Ac4 240
P/H18F127Ac8 16
P/H23F127Ac8 14
a
Intervaloscorrespondientesalosvaloresmnimoymximodetamao
deporoobservadosporSEM(estudionoestadstico).
LoshidrogelesP/H18F127Ac4(Figura3.26,imgenesayb)yP/H23F127Ac4
(Figura3.26,imgenescyd)poseentambinunaestructurainternaporosa,de
tamaos de poro de 225 m y de 240 m, respectivamente. En este caso el
aumento de concentracin no supone una reduccin del tamao de poro e
inclusoP/H23F127Ac4parecetenerunamayorpredominiodeporosdemayor
tamao (Comparacin de imgenes a y c en la Figura 3.26; se debe tener en
91
Captulo3Captulokk
Elaumentodegruposacrilatoporcopolmerobloquereactivo,2paraF127Ac2
y4paraF127Ac4,nosuponeunadisminucindeltamaodeporoniportanto
la formacin de una estructura interna ms compacta en los hidrogeles
fotopolimerizados.SinembargolaestructuradeP/H18F127Ac8yP/H23F127
Ac8 es mucho ms compacta, menos porosa y con un mayor predominio de
porosdepequeotamao.Estascaractersticassepuedenobservarclaramente
sicomparamoslasimgenesaycdelasFiguras3.25y3.26conlasimgenesay
cdelaFigura3.27.EnlasimgenesbyddelaFigura3.27seobservaendetalle
la estructura de poros compactos donde no se aprecia claramente conexin
entre los poros. El mayor nmero de grupos acrilato por molcula proporciona
unamayorcapacidaddeentrecruzamientoenlareaccindefotopolimerizacin,
lo que se traduce en una significativa reduccin del tamao de poro en una
estructuramuchomscompactaquelaobtenidaparaP/H18F127Ac2,P/H23
F127Ac2,P/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4.
3.5.ESTUDIODEDEGRADACINDELOSHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS
Anteunaposibleaplicacindelos hidrogelesfotopolimerizadoscomoscaffolds
para IT es importante conocer el proceso de degradacin de stos, ya que es
necesariaunadegradacinprogresivadelmaterialenuntiemposuficienteque
permitaladiferenciacincelularascomolaproduccindeECMporpartedelas
clulas.
92
Captulo3
W
Gradodehinchamiento
W
Alcabode49daslaformasehaperdidocompletamente(Figura3.28(b)para
P/H18F127Ac2, (d) para P/H23F127Ac2) y tras 57 das de ensayo ambos
hidrogelessehandegradadocompletamente.
EnlaFigura3.29semuestranlosperfilesdedegradacinparaP/H18F127Ac4y
P/H23F127Ac4. Como en los anteriores materiales, inicialmente el
93
Captulo3Captulokk
hinchamientoesmuybajoparaambasconcentraciones.Apartirdelos57 das
deensayoloshidrogelescomienzanahincharsehastaalcanzarsupesomximoa
los77dasparaP/H18F127Ac4yalos84dasparaP/H23F127Ac4.Elmayor
grado de hinchamiento se alcanza antes para los hidrogeles de menor
concentracin,loquepuededeberseaunadegradacindelosenlacessterde
lasunidadesdendrticas108ligeramentemsrpida,debidoalamenordensidad
delaredentrecruzada.Apartirdeahloshidrogelescomienzanaperdermasa
hasta su completa degradacin, a los 93 das para P/H18F127Ac4 y 98 das
paraP/H23F127Ac4.
ElmayortiempodeestabilidaddeloshidrogelesP/H18F127Ac4yP/H23F127
Ac4frentealoshidrogelesP/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2estdeacuerdo
conunmayorentrecruzamientodelaredpolimrica,posibleporelaumentode
gruposacrilatoenelderivadotetracriladofrentealdiacrilado.
P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2 42das49das
3,5
3 P/H18F127Ac2
2,5 P/H23F127Ac2
Hinchamiento
a b
C D
2
1,5
1
c d
0,5
A B
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo(das)
Figura3.28.HinchamientodeloshidrogelesP/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2en
funcindeltiempo.
94
Captulo3
P/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4 49das70das
3,5
3
P/H18F127Ac4
2,5
P/H23F127Ac4 a b
2
Hinchamiento
1,5
1
0,5 c d
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tiempo(das)
Figura3.29.HinchamientodeloshidrogelesP/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4en
funcindeltiempo.
P/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8 248das261das
3,5
3 P/H18F127Ac8
a b
Hinchamiento
2,5 P/H23F127Ac8
2
1,5
1
c d
0,5
0
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo(das)
Figura3.30.HinchamientodeloshidrogelesP/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8en
funcindeltiempo.
95
Captulo3Captulokk
Comoresumendeloobservado,laTabla3.5recogelostiemposdedegradacin
obtenidos para cada uno de los hidrogeles fotopolimerizados. El tiempo de
degradacinsepuedemodularconelnmerodegruposacrilatopresentesenel
copolmerobloquelinealodendrticolinealdendrticoyconlaconcentracin.
Tabla3.5.TiempodedegradacindehidrogelesfotopolimerizadosdeF127Ac2,F127
Ac4yF127Ac8.
HIDROGEL Tiempodedegradacin
(das)
P/H18F127Ac2 57
P/H23F127Ac2 57
P/H18F127Ac4 93
P/H23F127Ac4 98
P/H18F127Ac8 276
P/H23F127Ac8 286
3.6.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR
Losensayosdeviabilidadbiolgicahansidorealizadosconclulashumanas,en
untrabajodecolaboracinconlaDra.MaraJosMartnezLorenzodelBancode
Sangre y Tejidos de Aragn. Para la realizacin de estos ensayos se eligieron
clulasmesenquimaleshumanas(MSC)extradasdecartlago.
Las MSC fueron estudiadas por primera vez por Friedenstein en los aos 70.115
Dos de las principales caractersticas de estas clulas, como define la Sociedad
Internacional de Terapia Celular, son su capacidad de adhesin al plstico,
adquiriendounaformacaractersticaalargada,enformadeaguja,ysucapacidad
dediferenciacinadistintostiposdeclulasquedanlugaradistintasvariedades
115
FriedensteinAJ,G.J.,KulaginaNN,ExpHematol1976,4,267274.
96
Captulo3
Figura3.31.EsquemadelasdiferentesviasdediferenciacindelasMSCahueso,
cartlago,msculo,mdula,tendonesoligamentosytejidosconectivos.116
116
(a) Senseb, L.; Krampera, M.; Schrezenmeier, H.; Bourin, P.; Giordano, R., Vox
Sanguinis2010,98(2),93107;(b)Caplan,A.I.,TheJournalofPathology2009,217(2),
318324.
97
Captulo3Captulokk
presenciadelpolmeroPluronicF127,determinadadelamismaformaquepara
loscopolmerosbloquelinealodendrticolinealdendrtico.
Tabla3.6.Tablaresumendelosensayosdeviabilidadcelularrealizados.
a) b)
Figura3.32.Esquemailustrativode:a)experimentos2D,capadeclulascubiertasporel
hidrogel,yb)experimentos3D,clulasdistribuidasenunentornotridimensionalenel
interiordelhidrogel.
98
Captulo3
Los ensayos 2D consisten en cubrir una capa de clulas con el hidrogel (Figura
3.32(a)),mientrasquelos3Dconsistenenformarelhidrogelconlasclulasen
suinterior(Figura3.32(b)).
Losensayossehanrealizadosobrelospolmerosdisueltosenmediodecultivo
DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium) tanto en disolucin a
concentraciones a las cuales no se forma el hidrogel por efecto de la
temperatura, concentraciones del 5 y 10 % (w/v) (ensayos en 2D), y que se
pueden considerar ensayos con el monmero en disolucin; como con los
materiales en estado gel, a concentraciones del 18 y 23 % (w/v) (ensayos 2D y
3D). En estos casos se ha trabajado sobre hidrogeles sin fotopolimerizar y
fotopolimerizados. Las concentraciones para los ensayos en el estado gel se
eligieron teniendo en cuenta las concentraciones de gelificacin determinadas
paracadaunodeloscopolmerosbloquelinealesodendrticolinealdendrtico,
en el apartado 3.2 de este captulo. El protocolo de preparacin de las clulas,
preparacin de las disoluciones de polmero y preparacin de los ensayos de
viabilidad celular 2D y 3D, sobre hidrogeles sin fotopolimerizar y
fotopolimerizadossedescribenconmsdetalleenelapartado6.2.f.,delaParte
Experimental.
Delosmtodosdescritosenlaliteraturaparaevaluarlaviabilidadcelular,elms
adecuado para estos materiales result ser el mtodo live/dead (Invitrogen)
basado en las tinciones fluorescentes especificas de clulas vivas (verde) y
muertas(rojo).46b, 117OtrosmtodoscomoelMTT,118fuerondescartadosdebido
a dificultades experimentales. Los mtodos live/dead y MTT se describen con
detalleenelAnexoIII.
117
(a)Wu,J.;Wu,D.;Mutschler,M.A.;Chu,C.C.,AdvancedFunctionalMaterials2012,
22(18),38153823;(b)Howard,D.;Takae,S.;Wang,W.X.;Vermonden,T.;Hennink,W.
E.;Stayton,P.S.;Hoffman,A.S.;Endruweit,A.;Alexander,C.;Howdle,S.M.;Shakesheff,
K.M.,Biomacromolecules2009,10(10),28952903.
118
(a)Denizot,F.;Lang,R.,JournalofImmunologicalMethods1986,89(2),271277;(b)
Mosmann,T.,JournalofImmunologicalMethods1983,65(12),5563.
99
Captulo3Captulokk
Losresultadosdeviabilidadcelularsemuestranenlossiguientesapartados.En
primerlugarseincluyenlosresultadosobtenidosconensayosenentorno2Dy
3DparalosderivadosacriladosF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8,paraexponer
posteriormente los resultados correspondientes a F127Bn2, F127OH4, F127
Bn4yF127OH8.
3.6.1.ResultadosdeviabilidadcelulardederivadosacriladosF127Acn
(n=2,4,8):F127Ac2,F127Ac4yF127Ac8.
EnlasFiguras3.33y3.34serecogenlosresultadosdeviabilidadcelulardeestos
materialesenentornos2Dy3Drespectivamente.
Elanlisisdelosensayos2Dendisolucin(Figura3.33,ayb),2D/D5F127Acn
(n=2, 4, 8) y 2D/D10F127Acn (n=2, 4, 8), muestra una disminucin de la
viabilidadcelularalasconelaumentodeconcentracin,especialmentemarcada
conelaumentodegruposacrilatoreactivospormolcula.
100
Captulo3
a) 2D/D5F127Acn(n=2,4,8) b) 2D/D10F127Acn(n=2,4,8)
99.6
100.6 99.3 96.2 96.6
99.8 97.6 98.4 91.8 93.3 100
100 76.3
Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)
75.5 80 73.6
80 69.0
53.9 60
60
35.9
40 40
21.1 22.8
20 13.2 20
0 0 0 0 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
c) 2D/H18F127Acn(n=2,4,8) d) 2D/H23F127Acn(n=2,4,8)
94.5 94.2 91.6
100 88.2 100
77.6 79.5 78.5
Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)
80 80 72.1
59.6
53.9 56.3 56.0 52.9
60 60
40.8 39.9 39.9
36.7 30.0
40 40
20 9.0 20
0 0 0 0.5 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
e) 2D/P/H18F127Acn(n=2,4,8) f) 2D/P/H23F127Acn(n=2,4,8)
93.8
100 88.4 91.6 100 89.3 92.6
77.6 85.4 70.8 75.8
78.5
Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)
80 80 72.1 60.7
59.6 58.2
53.9 52.9
60 46.9 60
40.8
40 40
20 20
0 0 0 0 0 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
PluronicF127F127Ac2F127Ac4F127Ac8
Figura3.33.ViabilidadcelulardederivadosacriladosF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8
enentorno2D:a)al5%(w/v)endisolucin,b)al10%(w/v)endisolucin,c)al18%
(w/v)enestadogelsinfotopolimerizar,d)al23%(w/v)enestadogelsin
fotopolimerizar,e)al18%(w/v)enestadogelfotopolimerizadoyf)al23%(w/v)en
estadogelfotopolimerizado.
Cuandolosensayos2Dserealizaronenestadogel(Figura3.33,cyd),2D/H18
F127Acn (n=2, 4, 8) y 2D/H23F127Acn (n=2, 4, 8), que supone trabajar con
concentraciones mayores de reticulante, se comprueba que disminuye
ligeramente la toxicidad con respecto al monmero libre al 10 % (w/v). Esto
101
Captulo3Captulokk
puede explicarse porque en el estado gel los grupos acrilato presentan menor
movilidad que en disolucin ya que se encuentran fijados en la estructura del
hidrogelformadoporefectodelatemperatura.Ademsseobservaquecuanto
mayor es la densidad de grupos acrilato por molcula, menores son las
viabilidades.
Finalmente,enlosensayos2Denestadogelfotopolimerizado(Figura3.33,eyf),
conexcepcindelosmaterialesoctacrilados(hidrogelesdelderivadoF127Ac8),
los hidrogeles fotopolimerizados 2D/P/H18F127Ac2 y 2D/P/H23F127Ac2 y
losderivadosdeF127Ac4,permitenviabilidadessuperioresal50%presentando
una viabilidad celular similar e incluso superior a la de los anlogos sin
fotopolimerizar.Adems,cabedestacarqueenlosensayos2D/P/H18F127Ac2,
2D/P/H23F127Ac2,2D/P/H18F127Ac4y2D/P/H23F127Ac4seobtuvieron
viabilidadescelularesmejoradasconrespectoalpolmeroPluronicF127,siendo
loshidrogelesconmayorviabilidadcelularlosdelmaterialF127Ac4.
Analizandolosensayos 3Denestadogelsinpolimerizar(Figura3.34,ayb),se
puede observar que los hidrogeles 3D/H18F127Acn (n=2, 4) y 3D/H23F127
Acn (n=2, 4) permitieron viabilidades celulares en algunos casos superiores al
50%,siendodenuevoelmaterialmenosadecuadoF127Ac8.
102
Captulo3
a) 3D/H18F127Acn(n=2,4,8) b) 3D/H23F127Acn(n=2,4,8)
100 91.7 83.1 100
72.0 85.4 86.0
Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)
80 70.0 60.5 80
50.6 53.3
60 51.6 60 41.5
29.9 40.9
40 31.2 20.5 40 29.2
21.1
16 10.0
20 20
0 0 0 0.5 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
c) 3D/P/H18F127Acn(n=2,4,8) d) 3D/P/H23F127Acn(n=2,4,8)
100 100
Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)
80 72.0 80
60.5
43.4 51.6
60 60 41.5
31.0 29.2 40.9
40 30.5 40 28.7 26.7
22.9 19.2
16.7
20 20 5.7
4.4 3.2 2.3
0 0 0 0 0 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
PluronicF127F127Ac2F127Ac4F127Ac8
Figura3.34.ViabilidadcelulardederivadosacriladosF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8
enentorno3D:a)al18%(w/v)enestadogelsinfotopolimerizar,b)al23%(w/v)en
estadogelsinfotopolimerizar,c)al18%(w/v)enestadogelfotopolimerizadoyd)al23
%(w/v)enestadogelfotopolimerizado.
Deformageneral,sehanobservadomayoresvaloresdeviabilidadcelularenlos
ensayosdeloshidrogelesfotopolimerizadosenentorno2Dqueenlosensayos
3D. Las razones que pueden conducir a estos resultados son variadas y, en
particular,puededebersealamayorrestriccindeespacioymayorsuperficiede
contactodelasclulasconelhidrogelalproducirselafotopolimerizacinenun
entorno3D.
Por otra parte, como se ha indicado, los materiales que presentan una mejor
viabilidadcelularsonloshidrogelesdeF127Ac4tantoenentorno2Dcomoen
entorno 3D. Este hecho puede estar relacionado con la formacin de una
estructurainternacontamaosdeporoligeramentesuperiores,talycomoseha
observadoporSEM(Tabla3.4).
103
Captulo3Captulokk
Ademsdelosresultadosdeviabilidadcelularaqucomentados,sehaanalizado
mediantemicroscopiadefluorescencialamorfologacelularencadaunodelos
ensayosrealizados.Paratodosellossehaobservadounamorfologacelularque
escaractersticaenfuncindeltipodeensayo,2Do3D.
Entodoslosensayos2D,lasclulasseencuentranadheridasalfondodelpocillo
delaplacadecultivoypresentanlamorfologatpicaalargadadelasMSC(Figura
3.35,2D/P/F127Ac4).
Encambio,enlosensayos3D,lasclulaspresentanunamorfologaredondeada
lo que sugiere una baja adherencia al hidrogel (Figura 3.36, 3D/P/F127Ac4).
Estabajaadhesinalmaterialpuedesernegativaalahoradelasupervivencia
celular,perolamorfologaredondeadaqueadquierenalnoadherirsepuedeser
positivaparaladiferenciacindelasMSCacondrocitos,quesonclulasdetipo
noadherentequepresentandichamorfologa.
104
Captulo3
2D/P/H18F127Ac4 2D/P/H18F127Ac4
2D/P/H23F127Ac4 2D/P/H23F127Ac4
Figura3.35.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddehidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac4al18%y23%tras24horasdeensayo,alaizquierdaen
colorverdeseobservanlasclulasvivasyaladerechaencolorrojolasclulasmuertas.
3D/P/H18F127Ac4 3D/P/H18F127Ac4
3D/P/H23F127Ac4 3D/P/H23F127Ac4
Figura3.36.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac4al18%y23%tras24horasdeensayo,alaizquierdaen
colorverdeseobservanlasclulasvivasyaladerechaencolorrojolasclulasmuertas.
105
Captulo3Captulokk
queseunealassecuenciasdeADNenelncleo.Elmarcajedelasclulasenel
interiordeloshidrogelesserealizdelaformadescritaenelapartado6.2.f.,de
laParteExperimental.
EnlaFigura3.37(a)semuestraunaimagenen3Ddeunaclulaencapsuladaen
elinteriordelhidrogel.EnlaFigura3.37(b)y(c)semuestraunodelosplanosdel
hidrogel con clulas en su interior con marcaje de Calcein AM y DAPI
respectivamente. Adems, en la Figura 3.37 (d) se observa la superposicin de
losmarcajesfluorescentesconlasclulasobservadasencontrastedefases.
a)
b) c) d)
Figura3.37.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaconfocalparaensayos3Dde
hidrogelesfotopolimerizadosdeF127Ac4al23%tras24horasdeensayo,a)imagen
en3Ddeunaclulaencapsuladaenelinteriordelhidrogel,b)clulasvivasteidascon
CalceinAMencapsuladasenelhidrogelsituadasenunmismoplano,c)ncleoscelulares
declulasteidosconDAPIsituadasenunmismoplano,d)superposicindeimgenes
defluorescenciaenelverde,fluorescenciaenelazulsobreimagenencontrastede
fases.Laescalacorrespondea30m.
106
Captulo3
Conesteensayosehademostradoquelasclulasseencapsulanenelinteriorde
los hidrogeles tras la formacin de estos por efecto de la temperatura y la
posteriorfotopolimerizacin.
3.6.2.ResultadosdeviabilidadcelulardederivadosF127Bnn(n=2,4):F127
Bn2yF127Bn4yF127OHn(n=4,8):F127OH4yF127OH8.
107
Captulo3Captulokk
a) 2D/D5F127Bnn(n=2,4)
2D/D5F127OHn(n=4,8)
Viabilidadcelular(%)
99.8 100.2 99.3 98.4 95.3 93.0
96.7 99.4 90.5 97.9 93.3 93.4
100 83.3 86.4
80 65.2
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
b) 2D/D10F127Bnn(n=2,4)
2D/D10F127OHn(n=4,8)
Viabilidadcelular(%)
c) 2D/H23F127Bnn(n=2)
2D/H23F127OHn(n=4,8)
98.8
Viabilidadcelular(%)
PluronicF127F127Bn2F127OH4F127Bn4F127OH8
Figura3.38.ViabilidadcelulardederivadosF127Bn2,F127OH4,F127Bn4yF127
OH8,enentorno2D:a)al5%(w/v)endisolucin,b)al10%(w/v)endisolucinyc)al
23%(w/v)enestadogel.
108
Captulo3
3D/H23F127Bnn(n=2)
3D/H23F127OHn(n=4,8)
96.9 97.6 92.4 96.5
100 85.4
81.1
Viabilidacelular(%)
80 PluronicF127
60 41.5 40.9 F127Bn2
40 29.2 F127OH4
20 7.8 7.7 2.5 F127OH8
0
24horas 48horas 72horas
Figura3.39.ViabilidadcelulardederivadosF127Bn2,F127OH4,F127Bn4yF127
OH8,enentorno3Dal23%(w/v)enestadogel.
Delanlisisdelosresultadosobtenidosenensayoscelulares2Ddedisoluciones
al5%(w/v)(Figura3.38,(a)),2D/D5F127Bnn(n=2,4)y2D/D5F127OHn(n=4,
8),sededuceunaviabilidadcelulardeestoscompuestossimilaraPluronicF127
yprximasal90%tras72horasdeensayoenlamayoradeloscasos.
Alaumentarlaconcentracinal10%(w/v)(Figura3.38,(b)),con2D/D10F127
Bnn (n=2, 4) y 2D/D10F127OHn (n=4, 8) se observa una disminucin de la
viabilidad celular en todos los materiales. Sin embargo, esta disminucin es
incluso menos significativa que la observada para Pluronic F127,
mantenindoseenvaloressuperioresal65%tras72horasdeensayo.
Cuandolosensayosserealizanenentorno2Dconlosmaterialesal23%(w/v)en
estadogel(Figura3.38,(c)),2D/H23F127Bnn(n=2)y2D/H23F127OHn(n=4,
8),sibienseproduceunadisminucindelaviabilidadcelularparaF127Bn2con
respectoalosmaterialesendisolucin,loshidrogelesdelosderivadosF127OH
4yF127OH8presentanunaviabilidadcelularentornoal90%tras72horasde
ensayo.
109
Captulo3Captulokk
Figura3.40.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127Bn2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
Figura3.41.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127Bn2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
110
Captulo3
Figura3.42.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127OH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
111
Captulo3Captulokk
2D/D10F127OH8 2D/D10F127OH8 2D/D10F127OH8
2D/H23F127OH8 2D/H23F127OH8 2D/H23F127OH8
Figura3.43.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127OH8tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
24horas 72horas
3D/H23F127OH4 3D/H23F127OH4
Figura3.44.Imgenesdecontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesde
F127OH4tras24y72horasdeensayo.Enlaimagendelaizquierdasesealaconuna
flechaunaclulaconmorfologaredondeada.Enlaimagendeladerechasesealacon
unaflechaunaclulaconmorfologaalargada.
112
Captulo3
Figura3.45.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127OH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
113
Captulo3Captulokk
24horas 72horas
3D/H23F127OH8 3D/H23F127OH8
Figura3.46.Imgenesdecontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesde
F127OH8tras24y72horasdeensayo.
3.7.CARACTERIZACINMECNICADELOSHIDROGELES
Enlacaracterizacinmecnicadematerialesesposibleutilizardistintostiposde
ensayos,loscualessepuedenclasificarenfuncindemltiplesparmetros.Una
posibleclasificacinvienedeterminadaporlarealizacindelosensayosaaltao
bajavelocidaddeaplicacindelacarga,clasificndosecomoensayosdinmicos
oestticosrespectivamente.
Dentrodeestostiposdeensayoslosmsutilizadosenlacaracterizacindelas
propiedadesmecnicasdelcartlagoarticularsonensayosdetipoesttico,entre
los que se incluyen los mtodos de compresin uniaxial monotnica y los
mtodosdecompresinuniaxialdecargarelajacin.Ambosmtodossepueden
realizar en compresin no confinada (NC), compresin confinada (CC) o de
indentacin dependiendo del utillaje utilizado para la aplicacin de la carga
(Figura3.47)(verAnexoIV).
114
Captulo3
Carga
Carga
Carga
Todos los ensayos realizados en este trabajo son del tipo NC y CC y se han
realizado en colaboracin con el Dr. Ignacio Ochoa del grupo GEMM (Group of
StructuralMechanicsandMaterialsModeling)delI3A(InstitutodeInvestigacin
enIngenieradeAragn).
SehadeterminadoelMdulodeYoung(ES)delosgelesP/H18F127Acn(n=2,
4y8)aconcentracionesdel18%y23%(w/v)delreticulante,paraestablecer
comparaciones entre los hidrogeles con dos, cuatro u ocho grupos acrilato
terminales.
119
Allueva,A.,CaracterizacinmecnicadehidrogelesdePluronicparaaplicacionesen
ingenieriadetejidos.Proyectofindecarrera,2012.
115
Captulo3Captulokk
3.7.1.Ensayosdecompresinuniaxialmonotnica
Enestetipodeensayoslacargasevaaplicandodeformalinealyuniforme.Con
estos ensayos se obtiene el Mdulo de Rigidez (Emedido), que se denomina de
diferenteformaenfuncindeltipodeensayorealizadoencondicionesNCoCC:
MdulodeYoung(ES),enensayosNCyMduloAgregado(HA)enensayosCC.
Ambosparmetrosproporcionanunamedidadeladurezadelhidrogelbajolos
efectosdeunacarga.120Elclculodeambosparmetrosapartirdelascurvasde
tensindeformacinseexplicaenelAnexoIV.
CompresinNoConfinadaMdulodeYoung(ES)
EnelgrficodelaFigura3.49semuestranlosvaloresdeESobtenidosparalos
diferentes materiales estudiados: P/H18F127Ac2, P/H23F127Ac2, P/H18
F127Ac4,P/H23F127Ac4,P/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8.
120
Acosta,V.A.,IngenieriadeTejidosdelCartlagoArticular:Caracterizacinymodelado
delcomportamientomecnico.Tesisdoctoral2011.
116
Captulo3
a) b)
Zonalineal
Figura3.48.a)Curvatpicadetensin()vs.deformacin()obtenidaparaP/H23F127
Ac2enunensayodecompresinuniaxialmonotnicanoconfinada.Encolorrojo,la
seleccindelrangolineal.b)Seleccinyajustelinealpormnimoscuadradosparael
clculodelMdulodeYoung(ES).
P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
P/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4
P/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8
00000
MdulodeYoungEs(MPa)
00000
00000
18%
00000
23%
00000 0.111
00000 0.099
00000 0.048 0.039 0.0420.050
00000
F127Ac2 F127Ac4 F127Ac8
Figura3.49.ValoresmediosdeMdulodeYoung(ES)paraloshidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8.
Comosepuedeobservar,enloshidrogelesdeF127Ac2yF127Ac4seproduce
un aumento del Mdulo de Young con el aumento de concentracin de
copolmero gelificante en el hidrogel. Para P/H23F127Ac2 el aumento de
concentracindeun5%conrespectoaP/H18F127Ac2suponeunaumentodel
117
Captulo3Captulokk
ESdehastaeldoble.ParaP/H23F127Ac4elmismoaumentodeconcentracin
supone triplicar el valor de ES. Estos hechos estn de acuerdo con la mayor
rigidezesperableparalosmaterialesdemayorconcentracindereticulante.Sin
embargo, no ocurre lo mismo para los hidrogeles de F127Ac8 que mantienen
valoresparecidosaambasconcentraciones.
Porotraparte,elaumentodelnmerodegruposacrilatopormolculaalpasar
deF127Ac2aF127Ac4yaF127Ac8nosuponeunaumentosignificativoen
cuantoalvalordelES,obtenindosevaloresmuysimilaresentornoa0.04MPay
a 0.1 MPa entre los distintos hidrogeles, con excepcin de P/H23F127Ac8
antescomentadoquemantienesuEsentornoa0.045MPa.
CompresinconfinadaMduloagregado(HA)
118
Captulo3
a) b)
Zonalineal
Figura3.50.a)Curvatpicadetensin()vs.deformacin()obtenidaparaP/H23F127
Ac2enunensayodecompresinuniaxialmonotnicaconfinada.Encolorrojola
seleccindelrangolineal.b)Seleccinyajustelinealpormnimoscuadradosparael
clculodelMduloAgregado(HA).
P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
0,25
MduloAgregadoHA (MPa)
0,2
0,15 18%
0,1 23%
0.15
0,05 0.1
0
F127Ac2
Figura3.51.ValoresmediosdeMduloAgregado(HA)paraloshidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac2.
3.7.2.Ensayosdecompresinuniaxialdecargarelajacin
Elensayorealizadoconsisteenaplicarunarampadecargarelajacinrealizando
6cargasseparadasporunarelajacinde15minutosentreellas.
119
Captulo3Captulokk
CompresinconfinadaynoconfinadaCoeficientedePoisson()
P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
0,5
0,4
Coef.dePoisson
0,3
18%
0,2 0.42 23%
0.37
0,1
0,0
F127Ac2
Figura3.52.ValoresmediosdelCoeficientedePoisson()paraloshidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac2.
CompresinConfinadaPermeabilidad()
Lapermeabilidaddeunmaterialhacereferenciaalacapacidadquetienestede
permitir el paso del lquido a travs de l, sin alterar su estructura interna. De
estemodoseconsideraqueunmaterialespermeablesidejapasarunacantidad
apreciabledefluidoenuntiempodado,eimpermeablesilacantidaddefluido
esdespreciable.121Enelcasodequeelmaterialseapermeablesepuedeafirmar
queelmaterialesporosoyademslosporosestninterconectadosentres,ya
queestehechoesnecesarioparaproducirelpasodefluidoatravsdelmaterial.
121
Pelegay,C.,CaracterizacindematerialescompuestosparasuusoenIngenieriade
Tejidos.Proyectofindecarrera2012.
120
Captulo3
Elclculodelapermeabilidad,,realizadosedetallaenelAnexoIV.
P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
9.99E15
Permeabilidad(m2)
9.67E15
18%
23%
0
F127Ac2
Figura3.53.ValoresmediosdePermeabilidad()paraloshidrogelesfotopolimerizados
deF127Ac2.
3.7.3.Ensayosdefatiga
LosdatosprocedentesdelosensayosdefatigaserepresentanendiagramasSN.
EnelejeYserepresentalatensinsoportada(S)yenelejeXelnmerodeciclos
121
Captulo3Captulokk
18%
Pluronic18%
30
23%
Pluronic23%
TensinSoportada(KPa)
25 y=5E05x+23,825
20 R=0,9531
15 y=5E05x+15,014
R=0,9718
10
5
0
0 50000 100000 150000
Ndeciclos
Figura3.54.GrficoSNparaloshidrogelesfotopolimerizadosdeF127Ac2.
3.7.4.Comparacinconpropiedadesmecnicasdelcartlago
122
Captulo3
123
Captulo3Captulokk
Tabla3.7.Propiedadesmecnicasdecartlagoarticularenmodeloanimal(oveja)ydel
cartlagoarticularhumanodeterminadasexperimentalmente.119,120,121
Valorespromedioexperimentales(oveja)
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
0.21 0.31 0.32 5.8E15
Valorespromedioexperimentales(humano)
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
0.625 0.7 <0.4 5.5E16
Propiedadesmecnicasexperimentalesdelcartlagoarticular
humano
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
Min. Max. Min. Max. Rango Min. Max.
0.45 0.8 0.5 0.8 <0.4 E16 E15
Tabla3.8.Propiedadesmecnicasmedidasendiferenteshidrogelesfotopolimerizados.
Valorespromedioexperimentales
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
P/H18F127Ac2 0.048 0.1 0.37 9.9E15
P/H23F127Ac2 0.099 0.15 0.42 9.67E15
P/H18F127Ac4 0.039
P/H23F127Ac4 0.111
P/H18F127Ac8 0.042
P/H23F127Ac8 0.050
124
CAPTULO4
HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:
TIOLENOS
Captulo4
Enestenuevocaptulodelamemoriasedescribeeltrabajodesarrolladoconel
findeprepararhidrogelestermosensiblesfotopolimerizablesquepermitanuna
va alternativa de fotorreticulacin, en concreto mediante la reaccin de tioles
con alquenos, tiolenos (SH/CH2=CHCOO).66, 95 Para ello se ha optado por
mezclas binarias de compuestos con grupos acrilato y de derivados con grupos
tiol(SH)ensusposicionesterminales.
Losgrupostiol(SH)sehanincorporadoadiferentesmateriales:PluronicF127,
F127OH4 y F127OH8 mediante funcionalizacin de sus grupos hidroxilo
terminales con cisteamina (NH2CH2CH2SH), a travs de enlaces carbamato. El
grupo carbamato puede favorecer interacciones por enlaces de hidrgeno
intermoleculares, lo que puede tambin contribuir a modificar propiedades de
gelificacin,degradacinyviabilidadcelularconrespectoalasdescritasparalos
anlogosconenlacessterdescritosenelCaptulo3.
127
Captulo4
4.1.DERIVADOSDEPLURONICCONGRUPOSTIOLTERMINALES
4.1.1.Sntesisycaracterizacin
4.1.1.1.Derivadolineal:F127SH2
La sntesis del derivado lineal F127SH2 ha sido descrita por varios autores.122,
123
Para formar el enlace carbamato, que permite introducir la cisteamina, es
necesarioactivarpreviamentelosgruposhidroxiloterminalesdePluronicF127
con cloroformiato de pnitrofenilo, utilizando el procedimiento de sntesis
descritoenelEsquema4.1.
Esquema4.1.SntesisdeF127PN2[14].Condicionesdereaccin:i)cloroformiatodep
nitrofenilo,base,diclorometano.
122
(a)Tao,Y.;Han,J.;Ye,C.;Thomas,T.;Dou,H.,JournalofMaterialsChemistry2012,
22(36),1886418871;(b)Bae,K.H.;Choi,S.H.;Park,S.Y.;Lee,Y.;Park,T.G.,Langmuir
2006,22(14),63806384.
123
(a)Ryu,J.H.;Lee,Y.h.;Kong,W.H.;Kim,T.G.;Park,T.G.,JournalofControlledRelease2011,
152 (1) 236237; (b) Ryu, J. H.; Lee, Y.; Kong, W. H.; Kim, T. G.; Park, T. G.; Lee, H.,
Biomacromolecules2011,12(7),26532659;(c)Lee,Y.;Chung,H.J.;Yeo,S.;Ahn,C.H.;Lee,H.;
Messersmith,P.B.;Park,T.G.,SoftMatter2010,6(5),977983.
129
Captulo4Capitulok
gruposhidroxiloterminalesdePluronicF127,talycomosecomprobpor 1H
RMN (Tabla 4.1). Por ello se ensayaron otros tipos de base como piridina (Py)
(mtodoB)124odimetilaminopiridina(DMAP)(mtodosCyD),enlugardeTEA.
As mismo, se variaron otros parmetros de reaccin como el nmero de
equivalentes de las distintas bases y de cloroformiato de pnitrofenilo, con
respectoalacantidaddepolmero,ascomoeltiempodereaccin.EnlaTabla
4.1 se recogen, adems las condiciones de reaccin ensayadas, los porcentajes
de funcionalizacin de los grupos hidroxilo terminales de Pluronic F127 a que
handadolugar.
Tabla4.1.CondicionesdereaccinutilizadasenlaobtencindeF127PN2.
Relacinmolar Tiempode
%
Mtodo PluronicF127/cloroformiatodep reaccin
funcionalizadoa
nitrofenilo/Base (h)
A 1/8/8.8(TEA) 24 62
B 1/8/28(Py) 24 100
C 1/14/14(DMAP) 24 37
D 1/14/14(DMAP) 4 100
a
Porcentajedegruposhidroxiloterminalesfuncionalizadosdeterminadopor1HRMN.
Loscompuestossintetizadossecaracterizaronprincipalmentepor 1HRMNyFT
IR.
124
Gillies,E.R.;Frchet,J.M.J.,JACS2002,124(47),1413714146.
130
Captulo4
EnlaFigura4.1semuestraelespectrode 1HRMNdeF127PN2.Seobservala
presenciadelassealescorrespondientesalosprotonesaromticosJyK(7.38
7.28 ppm), adems de la seal del triplete correspondiente a los protones
prximos al nuevo enlace carbonato formado, protones G (4.43 ppm). La
completafuncionalizacinseconfirmporlacorrectaintegracindelasseales
delosprotonesdelosgrupospnitrofenilo(KyJ)conrespectoalosprotonesdel
ncleodePluronicF127(AyB).
CDCl3
D,E;C,B A
K J
G F
207.5
69.2
3.6
4.0
4.3
1
Figura4.1.Espectrode HRMNdeF127PN2enCDCl3,300MHz.
ParalaobtencindelcompuestotioladoF127SH2apartirdeF127PN2sehan
descritoenlabibliografadosrutassintticasdiferentes,queserepresentanen
elEsquema4.2.Laprimeradeellas,mtodoE,consisteenelataquenuclefilo
delgrupocarbonatoconlacistaminaylaposteriorreduccindelenlacedisulfuro
a tiol utilizando ditiotreitol (DTT) que da lugara F127SH2.122 La segunda ruta,
mtodo F, supone el ataque nuclefilo al grupo carbonato de F127NF2
utilizandodirectamentecisteamina.123
131
Captulo4Capitulok
Esquema4.2.ObtencindeF127PN2[14]porlosmtodosdesntesisEyF.
Mediante1HRMNsecomproblatotaldesaparicindelosprotonesaromticos
de los grupos pnitrofenilo de la molcula precursora F127PN2, as como el
desplazamiento de la seal de los protones G, prximos al enlace carbamato
formado, que aparece a 4.20 ppm. La seal a 2.79 ppm del espectro de
F127SH2 corresponde a los protones tipo J adyacentes a los grupos tiol de la
molcula.
132
Captulo4
B A
K J G
G J
1
Figura4.2.Comparativadelosespectrosde HRMNdeF127PN2(partesuperior),y
F127SH2(parteinferior),ambosrealizadosenCDCl3.
LosprotonestipoIdelamolculaF127SH2,adyacentesalenlacecarbamatose
encuentranenmascaradosporlassealesdelncleocentralpolimricopresente
a3.5ppm.Laobservacindeestosprotones,ascomolacorrectaasignacinde
carbonos,serealizmedianteHSQC(verFiguraI.4delAnexoI).
EnlaFigura4.3seobservaenFTIRlabandacorrespondientealenlaceC=Odel
grupo carbonato de F127PN2, a 1769 cm1, y la banda a 1732 cm1
correspondiente al mismo enlace del grupo carbamato y del grupo ster de
F127SH2.Sinembargonoesposibledetectarlabandadebidaalgrupotiolen
tornoa2600cm1.
133
Captulo4Capitulok
Transmitancia(u.a.)
OCOO1769cm1
OCON/COO 1732
F127PN2 F127SH2
4.1.1.2.DerivadostioladosdendrticosF127SH4yF127SH8
134
Captulo4
Esquema4.3.Rutasintticaparalaobtencindelderivadodendrticodeprimera
generacincongruposhidroxiloactivadosenformadegrupospnitrofeniloyposterior
reaccinconcisteaminaparadarF127SH4.
Condicionesdereaccin:i)cloroformiatodepnitrofenilo,piridina,diclorometano;
ii)cisteamina,diclorometano.
Aligualqueparaelcompuestolineal,lacompletafuncionalizacinsedetermin
mediante 1HRMNyFTIR.EnlaFigura4.4semuestraelespectrode 1HRMNde
F127SH4.
135
Captulo4Capitulok
D,E,F C B A
J
I,G N
200.3
12.1
67.0
8.2
6.5
1
Figura4.4.Espectrode HRMNdeF127SH4enCDCl3,500MHz.
Lassealesqueaparecenentre4.25y4.28ppmcorrespondenalosprotonesde
losCH2delasestructurasdebisMPA(protonestipoI)yalosprotonestipoG,
queentotalsuman12protones.
Lassealesanchasqueaparecena2.75y2.79 ppm,quesuman8protonesen
total,correspondenalosprotonestipoNadyacentesalosgrupostiolterminales.
La seal de los protones I entre 4.25 y 4.28 ppm correlaciona con la seal de
carbonoa64.2ppm.AdemsseobservalacorrelacinentrelosprotonesG,que
aparecenjuntoconlosprotonesI,conlasealencarbonoa67.4ppm.
136
Captulo4
ProtonesM ProtonesN
f1 (ppm)
ProtonesI,I
ProtonesG
Figura4.5.EspectroHSQCdelamolculaF127SH4enCDCl3,500MHz.
Elgrupodesealesqueaparecena2.75y2.79ppmcorrespondenalosprotones
tipoNquecorrelacionanconelmismocarbonoa38.4ppm.
AdemssepuedeobservarlacorrelacinentrelosprotonestipoMa3.36ppm,
que se encuentran enmascarados por las seales del polmero, con su
correspondientecarbonoa41.8ppm.
EnlaFigura4.6serepresentaelespectrodeFTIRparaelderivadoF127SH4.Se
observaladesaparicindelasbandascorrespondientesalosgruposNO2a1527
cm1 yalgrupocarbonatoa1212cm1ya1772cm1,ascomolapresenciadela
banda de la vibracin del enlace C=O de los grupos carbamato y ster a
1733 cm1. Al igual que para el derivado lineal F127SH2, la banda
correspondientealosgrupostiolnosedetectporFTIR.
137
Captulo4Capitulok
Transmitancia%
OCOO1772cm1
OCON/COO1733cm1
F127PN4 F127SH4
Paralaobtencindelderivadodesegundageneracinactivadocon8gruposp
nitrofenilo(F127PN8),separtideF127OH8,comosemuestraenelEsquema
4.4. Las condiciones de reaccin fueron similares a las utilizadas para la
obtencindelosderivadoslinealydeprimerageneracin.
138
Captulo4
Esquema4.4.Rutasintticaparalaobtencindelderivadodendrticodesegunda
generacincongruposhidroxiloactivadosenformadegrupospnitrofeniloyposterior
reaccinconcisteaminaparadarF127SH8.
Condicionesdereaccin:i)cloroformiatodepnitrofenilo,piridina,diclorometano;
ii)cisteamina,diclorometano.
139
Captulo4Capitulok
como los I aparecen juntos en el espectro de 1HRMN, entre 4.35 y 4.53 ppm,
dandolugaraunmultiplete.
4.53
4.49
4.45
4.40
4.39
4.35
4.27
1.37
1.34
L,I,I G
D,E NJ A
CDCl3
C
S
S R
B
203.1
16.4
16.8
24.5
67.0
12.6
4.3
6.7
Figura4.7.EspectrodeprotndelamolculaF127PN8enCDCl3,300MHz.
Todosloscompuestos obtenidosenlasntesisdelosderivadostioladosfueron
caracterizados por GPC, tcnica que confirm la presencia de dos nicas
distribuciones, conforme a lo esperado considerando el material de partida, y
correspondientes al polmero totalmente funcionalizado. En la Figura I.6 del
AnexoI,semuestranamododeejemplo,loscromatogramasobtenidosparalos
derivadoscongruposterminalespnitrofenilo.
140
Captulo4
Los valores de peso molecular obtenidos por dicha tcnica y los calculados a
partirdelasumadelospesosmolecularesdelosbloquesindividualesserecogen
en la Tabla 4.2. La distribucin de mayor peso molecular coincide con el peso
molecularcalculadoapartirdelasumadelosbloquesindividuales.
Tabla4.2.Valoresmximosderelacinmasa/cargaobtenidosporMALDIMSparalos
compuestoscongrupospnitrofenilotiolterminales.
4.1.2.Determinacindelaspropiedadessolgel
Ladeterminacindelaspropiedadessolgeldeestospolmerossellevacabo
mediante el mtodo de inversin del vial y por DSC. Para ello se prepararon
muestrasdedistintasconcentracionesdeF127SH2yF127SH4(al5%,10%,
16%,18%,20%y23%(w/v)enPBS10mMpH7.4).
141
Captulo4Capitulok
LosproductosF127PN2,F127PN4yF127PN8seexcluyerondelestudiopor
suelevadainestabilidadendisolucionesacuosastalescomoelPBS.
4.1.2.1.EstudiodeGelificacinmedianteelmtododeinversindel
vial
EnlaFigura4.8semuestraeldiagramadefasesdelosdosderivadostiolados:
F127SH2 y F127SH4. Para ambos materiales se obtuvieron hidrogeles
termosensibles a partir de concentraciones iguales o superiores al 5% (w/v).
Comosepuedeobservar,ambospolmerosposenunintervalodetemperaturas
deexistenciadelhidrogelmuysimilar.
120
100 SOL
Temperatura(C)
80
F127SH2
60
GEL
F127SH4
40
20
SOL
0
0 5 10 15 20 25 30
Concentracin(%enpeso)
Figura4.8.Diagramadefasesdeloshidrogeles,preparadosenPBS10mMpH7.4,con:
F127SH2yF127SH4,aconcentracionesdel5%,10%,16%,18%,20%,23%y25%
(w/v).
142
Captulo4
Enestalneacomparativa,estoscompuestospuedenrelacionarseconanlogos
no azufrados preparados en nuestro grupo de investigacin como el que se
muestra en la Figura 4.9.125 Esta molcula es estructuralmente anloga al
derivado F127SH2 con la nica diferencia de la sustitucin de los grupos tiol
terminalesporgruposhidroxilo.
Figura4.9.EstructuraqumicadelderivadoF127NHOH2.
125
Herrer Jimnez, I. L., Thermosensitive and photopolymerizable hydrogels based on
PluronicF127.TrabajoFindeMaster,2013.
143
Captulo4Capitulok
4.1.2.2.EstudiodegelificacinmedianteCalorimetraDiferencialde
Barrido(DSC)
Elprotocoloseguidoenlaobtencindelostermogramashasidoeldescritoenel
apartado 6.2.b., de la Parte Experimental. Los termogramas para tres de las
disolucionesensayadas,concentracionesal5%,16%y25%(w/v),deF127SH2
yF127SH4semuestranenlasFiguras4.10y4.11,respectivamente.
144
Captulo4
a) 1,5 5%
1
Deriv.Flujocalor
19.5C
(mW/min)
0,5
0 29C
0,5
1
0 10 20 30 40
Temperatura(C)
16%
b) 1,5 12.7C
1
Deriv.Flujocalor
(mW/min)
0,5
0 21.7C
20C
0,5
1
0 10 20 30 40
Temperatura(C)
c) 2 25%
7.7C
1,5
Deriv.Flujocalor
1
(mW/min)
0,5
0 17.1C
15C
0,5
1
0 10 20 30 40
Temperatura(C)
Figura4.10.TermogramasdeDSCdeF127SH2:a)al5%(w/v),b)al20%(w/v)yc)25
%(w/v)enPBS10mMpH7.4,correspondientealarepresentacindederivadadelflujo
decalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclode
calentamiento;enmorado,Tdemicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCST
porDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial.
145
Captulo4Capitulok
a) 1,5
5%
1
Deriv.Flujocalor
19.1C
(mw/min)
0,5
0,5
1
0 10 20 30
Temperatura(C)
b) 1,5 16%
14.0C
1
Deriv.Flujocalor
(mW/min)
0,5
0 22.0C
20C
0,5
1
0 10 20 30
Temperatura(C)
c) 1,5 25%
8.8C
1
Deriv.Flujocalor
(mW/min)
0,5
0 18.9C
16C
0,5
1
0 10 20 30
Temperatura(C)
Figura4.11.TermogramasdeDSCdeF127SH4:a)al5%(w/v),b)al20%(w/v)yc)25
%(w/v)enPBS10mMpH7.4,correspondientealarepresentacindederivadadelflujo
decalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclode
calentamiento;enmorado,Tdemicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCST
porDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial.
146
Captulo4
4.1.2.3.Discusindelosresultados
EnlaTabla4.3seresumenycomparanlasLCSTobtenidasporambosmtodos
paralosdiferentesmaterialesestudiados.
Tabla4.3.LCSTytemperaturademicelizacindediferentesmaterialesobtenidascon
diferentesmetodologas.
LCSTa
Concentracin LCSTpor Micelizacin
inversin
(%w/v) DSC(C) (C)
vial(C)
5% 29 19.5
10% 22 23.8 16.4
16% 20 21.7 12.7
F127SH2 18% 19 21.6 12.3
20% 17 21.6 11.8
23% 16 19.5 10.0
25% 15 17.1 7.7
5% 36 19.1
10% 24 23.3 16.5
16% 20 22 14.0
F127SH4 18% 19 21.7 12.5
20% 18 20 10.2
23% 17 20 9.9
25% 16 18.9 8.8
a
LCST(LowCriticalSolutionTemperature)
Comosepuedeobservar,lasLCSTobtenidasporelmtododeinversindelvial
concuerdanbastantebienconlasLCSTobtenidasporDSC.Estecomportamiento
es diferente al descrito para los hidrogeles de los materiales estudiados en el
Captulo 3 de esta Memoria, donde las LCST obtenidas por el mtodo de
inversindelvialconcordabanmejorconlatemperaturaalacualseestabilizala
lnea base. Esta diferencia de comportamiento entre los materiales acrilados y
tioladospuedeserdebidaaqueparalosmaterialestioladossehaobservadouna
mayor velocidad de gelificacin con una mayor concordancia de las LCST
obtenidasporambosmtodosexperimentales.
147
Captulo4Capitulok
4.1.3.Ensayosdeviabilidadcelular
LosensayosdeviabilidadcelularsehanllevadoacaboconclulasMSChumanas
utilizandoelprotocolodepreparacindeclulas,preparacindelasdisoluciones
depolmeroypreparacindelosensayosdeviabilidadcelularensistemas2Dy
3Ddescritosenelapartado6.2.f.,delaParteExperimental.Laviabilidadcelular
sedeterminporelmtodolive/dead(AnexoIII).
Enensayos2D(Figura4.12),loshidrogelesdeambosmaterialespresentanuna
elevadaviabilidadcelulartantoendisolucincomoenestadogel.Losvaloresde
este parmetro tras 72 horas de ensayo son superiores o prximos al 90% en
todosloscasos.Elaumentodeconcentracinsuponeunaligeradisminucinde
laviabilidad.
148
Captulo4
a) 2D/D2.5F127SHn(=2,4)
Viabilidadcelular(%)
99.8 100.1 99.2 97.1 99.6 98.9
100
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
b) 2D/H5F127SHn(n=2,4)
100
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
c) 2D/H10F127SHn(n=2,4)
97.9 99.1 97.8 95.9 97.8
100 87.9
Viabilidadcelular(%)
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
F127SH2F127SH4
Figura4.12.ViabilidadcelulardederivadostioladosF127SH2yF127SH4,enentorno
2D:a)al2.5%(w/v)endisolucin,b)al5%(w/v)enestadogelyc)al10%(w/v)en
estadogel.
149
Captulo4Capitulok
a) 3D/H5F127SHn(n=2,4)
99.6 96.2 99.8 96.0 97.3
94.6
Viabilidadcelular(%)
100
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
b) 3D/H10F127SHn(n=2,4)
99.3 91.5 94.6 89.2 94.7 91.7
100
Viabilidadcelular(%)
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
F127SH2F127SH4
Figura4.13.ViabilidadcelulardelosderivadostioladosF127SH2yF127SH4,en
entorno3Denestadogel:a)al5%(w/v)yb)10%(w/v).
150
Captulo4
Figura4.14.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127SH2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
151
Captulo4Capitulok
Figura4.15.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127SH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
Figura4.16.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127SH2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
152
Captulo4
SH4(imgenesencontrastedefases,Figura4.17).Enelestudiodelasimgenes
decontrastedefasesparaelensayo3Daconcentracindel5%(w/v)a24,48y
72horas(Figura4.18)sepuedecomprobarqueelnmerodeclulasalargadas
adheridasalfondodelpocilloaumentaconelpasodeltiempo,loqueseatribuye
denuevoalamigracindelasclulasatravsdeunhidrogelmsblando.
Figura4.17.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127SH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.
Figura4.18.Imgenesencontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesal5%(w/v)
deF127SH4tras24,48y72horasdeensayo.
Losbuenosresultadosdeviabilidadcelularobtenidosparahidrogelesbasadosen
las molculas gelificantes F127SH2 y F127SH4, permitirn en un futuro la
utilizacin de estos hidrogeles como soportes para el cultivo de clulas
endotelialesenentorno2D.DichoestudioserealizarencolaboracinconelDr.
ngelLuisGarcaOtn,delGrupodeInvestigacindeProgenitoresAdultosdel
153
Captulo4Capitulok
SistemaCardiovascular(GIPASC),pertenecientealInstitutoAragonsdeCiencias
delaSalud(IACS).
Comoyasehaindicado,elobjetivoprincipaldetrabajarconderivadosdetipo
tiol ha sido el de disponer de hidrogeles termosensibles reticulables con una
menor densidad de grupos acrilato, pero capaces de polimerizar mediante una
reaccindetipotiolenoentregrupostiolygruposacrilato.
4.2.1.MaterialesbasadosenmezclasdeF127SHn(n=2,4)conF127Acn(n=
2,4,8)
154
Captulo4
Eldesarrollodeestapartedeltrabajoprecisanalizardiferentesaspectos:
a)Laseleccindelaproporcindeloscomponentes.
b)Lametodologadepreparacindelasmezclas.
c)Establecerlascondicionesmsadecuadasdereticulacinqumica.
EnlaTabla4.4seresumenlosdiferentesensayosllevadosacaboconelfinde
seleccionar las condiciones de trabajo ms adecuadas respecto a los tres
aspectosmencionados.EsteestudioselimitamezclasdeF127Ac2conF127
SH2. Adems, con el fin de conocer el comportamiento de los polmeros de
forma individual en determinadas condiciones de trabajo, en casos indicados,
tambinsetrabajconhidrogelesmonocomponente.
155
156
Captulo4kjdflkjdaslkfjasldkjfdslkjflkjkjsdlkjflfkjdlkjjlsdkjflksdjflkjfjlkj
Tabla4.4.Resumendelosensayosrealizadosparalaseleccindelascondicionesdetrabajo.
%(w/v)
Componente Componente Relacinmolar % Mezclado Reticulacin
N Material I2959 Resultado*** N
C1 C2 C1:C2 w/v
M1* M2* 0.1 0.5 PSL** PL**
1 + + negativo 1
2 + + negativo 2
3 + + + negativo 3
F127Ac2 F127SH2 1:1 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH2
4 + + + negativo 4
5 + + + negativo 5
6 + + + positivo 6
7 + + negativo 7
8 + + negativo 8
9 + + + negativo 9
F127Ac2 F127SH2 1:1.2 10 H10(1:1.2)F127Ac2/F127SH2
10 + + + negativo 10
11 + + + negativo 11
12 + + + positivo 12
13 + negativo 13
14 F127Ac2 5 D5F127Ac2 + + negativo 14
15 + + positivo 15
16 + negativo 16
17 F127SH2 5 H5F127SH2 + + negativo 17
18 + + negativo 18
Condicionesdetrabajo
1:1 10 M2 0.5 PL
seleccionadas
*M1:Preparacindelasdisolucionesdeloscomponentesporseparadoyposteriormezclado,M2:preparacinconjuntadeladisolucindelosdos
componentes**PSL.Polimerizacinsinluz,PL:polimerizacinconluz.***Ensayopositivo:Noreversindelhidrogelalestadosoltrasmantenerloa
4Cdurante10minutos.
Captulo4
a)Seleccindelaproporcindeloscomponentes:
Eltrabajodesarrolladosehacentradoendiferentescomposiciones,atendiendo
a la relacin molar de los componentes y la relacin estequiomtrica de los
gruposreactivos(CH2=CHCOO/SH).
b)Metodologadepreparacindelasmezclas:
ElprocedimientodemezcladoquedenominaremosM1,suponeladisolucinde
cadaunodelosdospolmerosqueformanlamezclaporseparadoysuposterior
mezclado. Este procedimiento probablemente favorecera una organizacin en
micelasmonocomponenteenlamezcla(Figura4.19(a)).
157
Captulo4Capitulok
a)
b)
Grupoterminalacrilato/Grupoterminaltiol
CadenaPEGhidrfila
CadenaPPGhidrfoba
Figura4.19.Representacinesquemticadelasmicelasqueformanloshidrogeles
preparadosporlosdistintosprocedimientosdemezclado,M1yM2.a)Organizacinen
micelaspurasfavorecidasenelprocedimientodemezcladoM1,b)organizacinen
micelasmixtasfavorecidasenelprocedimientodemezcladoM2.
Losprocedimientosdetrabajohansido:
MtodoM2:Enunrecipienteseintrodujolacantidadcorrespondiente
al 5 % (w/v) de cada uno de los polmeros y se aadi el volumen
158
Captulo4
correspondientedePBS10mMpH7.4.Lospolmerossedejarondisolver
a4Cduranteunanocheyenoscuridad.
c)Condicionesoptimasdereticulacin:
Enelprocesodereticulacinqumica,atravsdelaadicindelgrupotiolaun
doble enlace, existen numerosas variables experimentales que se pueden
modificar,yenparticular,unaesencialeselusoonodefotoiniciadorparaque
se produzca la reaccin de adicin, lo que condiciona un mecanismo de
fotopolimerizacinradicalariaounmecanismoinico,respectivamente.66
Respondiendoalobjetivoinicialdeestatesis,lainvestigacinsehacentradoen
elprocesodefotopolimerizacinconluz(reticulacinidentificadacomoPL).No
obstante, dada la alternativa inica, tambin se ha estudiado la polimerizacin
sinluz(reticulacinidentificadacomoPSL).
Reticulacin qumica con luz (PL): Una vez preparadas las muestras de
losmaterialesaestudioenPBS10mMpH7.4,quecontenaun0.10.5
%enpesodelfotoiniciadorI2959previamentedisuelto,porlosdistintos
mtodosdemezclado,sellevacabolafotopolimerizacindelhidrogel
siguiendoelprotocolodetrabajo6.2.c.,descritoenlaParteExperimental.
Traslafotopolimerizacin,loshidrogelesobtenidossemantuvierona4C
durante10minutosparaobservarsilareticulacinqumicahabatenido
lugar.
Reticulacinqumicasinluz(PSL):Unavezpreparadaslasmuestrasde
losmaterialesaestudioenPBS10mMpH7.4,porlosdistintosmtodos
demezclado,seintrodujeronenunaestufaa37Cconelfindeprovocar
la reaccin entre los grupos acrilato y grupos tiol, manteniendo el
materialenestascondicionesdurante7das.Adeterminadosintervalos
de tiempo, la muestra se extrajo de la estufa, se enfri y se mantuvo
durante 10 minutos a 4 C para comprobar si el hidrogel reverta a su
estadosol,loqueseraindicativodequeelprocesosolgelesreversibley
portanto,indicabaquenosehabaproducidoreticulacin.
159
Captulo4Capitulok
LosresultadosobtenidosenlosensayosrealizadosquesemuestranenlaTabla
4.4permitenconcluirque:
Lareticulacinqumicaconluzdelosmaterialesbicomponenterequiere
unaumentodelaconcentracindefotoiniciadorhastael0.5%enpeso
(experimentos n 6 y 12) y slo se produce en el caso de que los
polmerossedisuelvenconjuntamente(M2).
160
Captulo4
EnlaFigura4.20semuestraelaspectodelhidrogelP/H10(1:1)F127Ac2/F127
SH2obtenidomediantelaaplicacindeestascondicionesdetrabajo.
Figura4.20.AspectodelhidrogelP/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2,obtenidoenlas
condicionesexperimentalesestablecidascomomsidneas.
Enlasformulacionesbasadasenelderivadolinealcongrupostiol,F127SH2y
copolmeros dendrticolinealdendrtico de primera y segunda generacin con
gruposacrilato(F127Ac4yF127Ac8),seprobarondosrelacionesenmoles,la
relacin 1:1 molar (H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 y H10(1:1)F127Ac8/F127
SH2)quesuponeunexcesodegruposacrilatoconrespectoalosgrupostiol;yla
relacin 1:2 molar (H10(1:2)F127Ac4/F127SH2) y 1:4 (H10(1:4)F127Ac
8/F127SH2),quesuponeunarelacinestequiomtricaentregruposfuncionales
acrilatoytiol.Lasconcentracionesfinalesdelasmezclassemantuvieronal10%
(w/v),utilizandoelmtodoM2comoprocedimientodemezcladoydisolucinde
los componentes en PBS 10 mM pH 7.4 y presencia de 0.5 % en peso de
fotoiniciadorI2959.
161
162
Captulo4kjdflkjdaslkfjasldkjfdslkjflkjkjsdlkjflfkjdlkjjlsdkjflksdjflkjfjlkj
Tabla4.5.ResumendelosexperimentosrealizadosparamezclasF127Acn(n=2,4,8)yF127SHn(n=2,4).
Relacin %(w/v)
Componente Componente Proporcin % Mezclado Reticulacin
N molar Material I2959 Resultado*** N
C1 C2 C=C:SH w/v
C1:C2 M2* 0.5 PL**
6 F127Ac2 F127SH2 1:1 1:1 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 + + + positivo 6
19 F127Ac4 F127SH2 1:1 2:1 10 H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 + + + positivo 19
20 F127Ac4 F127SH2 1:2 1:1 10 H10(1:2)F127Ac4/F127SH2 + + + negativo 20
21 F127Ac8 F127SH2 1:1 4:1 10 H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 + + + positivo 21
22 F127Ac8 F127SH2 1:4 1:1 10 H10(1:4)F127Ac4/F127SH2 + + + negativo 22
23 F127Ac2 F127SH4 1:1 1:2 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 + + + positivo 23
24 F127Ac2 F127SH4 2:1 1:1 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 + + + negativo 24
25 F127Ac4 F127SH4 1:1 1:1 10 H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 + + + positivo 25
26 F127Ac8 F127SH4 1:1 2:1 10 H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 + + + positivo 26
27 F127Ac8 F127SH4 1:2 1:1 10 H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 + + + negativo 27
Relacinmolarptima 1:1 + + +
*M2:preparacinconjuntadeladisolucindelosdoscomponentes**PL:polimerizacinconluz.***Ensayopositivo:Noreversindelhidrogelal
estadosoltrasmantenerloa4Cdurante10minutos.
Captulo4
Figura4.21.AspectodeloshidrogelesP/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2(exp.n6),
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2(exp.n19),P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2
(exp.n21),P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH4(exp.n23),
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4(exp.n25),P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4
(exp.n26).
163
Captulo4Capitulok
Paraladeterminacindelaspropiedadessolgelseprepararonmuestrasdelas
mezclas H10(1:1)F127Ac2/F127SH2, H10(1:1)F127Ac4/F127SH2,
H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 as como de H10(1:1)F127Ac2/F127SH4
H10 (1:1)F127Ac4/F127SH4 y H10(1:1)F127Ac8/F127SH4, disueltas en
PBS10mMpH7.4,preparadasmedianteelprocedimientoM2,ymanteniendo
lasmuestrasduranteunanochea4Cparasudisolucin.
Suscomportamientossolgelseestudiaronutilizandoelmtododeinversindel
vial y la calorimetra diferencial de barrido (DSC), siguiendo los protocolos de
trabajo6.2.a.y6.2.b.,descritosenlaParteExperimental.
EnlaFigura4.22y4.23semuestranlostermogramasobtenidosparalasmezclas
dederivadosF127Acn(n=2,4,8)conF127SH2yF127SH4,respectivamente.
164
Captulo4
a) 2
17C
1,5
Deriv.Flujocalor
1
(mW/min)
0,5
0 25C
23C
0,5
1
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
2
b)
Deriv.Flujodecalor
1,5 17C
1
(mW/min)
0,5
0 25.7C
23C
0,5
1
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
c) 2
1,5
Deriv.Flujocalor
16.9C
1
(mW/min)
0,5
0 23C 25.5C
0,5
1
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
Figura4.22.DSCdelasmezclas:a)H10(1:1)F127Ac2/F127SH2,b)H10(1:1)F127Ac
4/F127SH2yc)H10(1:1)F127Ac8/F127SH2enPBS10mMpH7.4correspondientes
alarepresentacindeladerivadadelflujodecalorconrespectoaltiempo(mW/min)
frentealatemperaturaenelciclodecalentamiento;enmorado,Tdemicelizacin
(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCSTporDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtodo
deinversindelvial.
165
Captulo4Capitulok
a)
1,1 16.9C
Deriv.FlujoCalor
0,9
0,7
(mW/min)
0,5
0,3
0,1
0,1 24C25C
0,3
0,5
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
b) 1,1 16.7C
0,9
Deriv.FlujoCalor
0,7
(mW/min)
0,5
0,3
0,1 25C
0,1 25C
0,3
0,5
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
1,1
c) 16.5C
0,9
Deriv.FlujoCalor
0,7
(mW/min)
0,5
0,3
0,1
0,1 24.2C25C
0,3
0,5
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
Figura4.23.DSCdelasmezclas:a)H10(1:1)F127Ac2/F127SH4,b)H10(1:1)F127
Ac4/F127SH4yc)H10(1:1)F127Ac8/F127SH4enPBS10mMpH7.4,
correspondientesalarepresentacindeladerivadadelflujodecalorconrespectoal
tiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclodecalentamiento;enmorado,T
demicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCSTporDSC),enverde,LCST
obtenidaporelmtododeinversindelvial.
166
Captulo4
EnlaTabla4.6serecogenlosresultadosdelastemperaturasdetransicinsol
gel (LCST) para todas las mezclas estudiadas, obtenidas por ambos mtodos.
Adems, se muestran las transiciones gelsol determinadas por el mtodo de
inversindelvialylasCMTestablecidasporDSC.
Tabla4.6.Temperaturasdetransicindefasesdelasmezclasobtenidasporel
mtododeinversindelvialyporDSC.
Temperatura
LCST
gelsol LCSTpor
inversin Micelizacin
inversindel DSC
delvial (C)
vial (C)
(C)
(C)
H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 23 86 25 17
H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 23 80 25.7 17
H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 25 88 24 16.9
H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 25 84 25 16.7
LasLCSTobtenidasporelmtododeinversindelvialconcuerdanbastantebien
con las LCST obtenidas por DSC. Las LCST y la temperatura de micelizacin
obtenidasporDSCsonmuysimilaresentrelasmezclas,sinapreciarsediferencias
enfuncindeltipodederivadoacriladoutilizado.
4.2.1.3.CaracterizacindelamorfologainternaporSEM
167
Captulo4Capitulok
En las Figuras 4.24, 4.25 y 4.26 se pueden observar las estructuras internas
porosas de los tres hidrogeles fotopolimerizados basados en F127SH2 con
F127Ac2,F127Ac4yF127Ac8,respectivamente.EnlasFiguras4.27y4.28se
muestran las estructuras internas porosas de dos de los hidrogeles
fotopolimerizados basados en F127SH4 con F127Ac4 y F127Ac8,
respectivamente. El hidrogel P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 se degrad
completamente antes de transcurrir los tres das de incubacin en PBS,
necesariosparalapreparacindelasmuestrasparasuestudioconSEM.
168
Captulo4
100m 50m
a)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2
30m 10m
c)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 d)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2
Figura4.24.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac2/F127SH2,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).
100m 50m
a)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2
Figura4.25.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac4/F127SH2,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).
200m 100m
a)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2
Figura4.26.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac8/F127SH2,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).
169
Captulo4Capitulok
100m 30m
a)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 b)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4
Figura4.27.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac4/F127SH4,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).
200m 100m
a)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 b)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4
Figura4.28.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac8/F127SH4aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).
170
Captulo4
Tabla4.7.Tamaodeporodeloshidrogelesdemezclasdederivadostioladosy
acriladosobservadoporSEM.
HIDROGEL Tamaosdeporoa(m)
P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 535
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 440
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 830
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 520
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 2560
a
Intervaloscorrespondientesalosvaloresmnimoymximodetamaode
poroobservadosporSEM(estudionoestadstico).
4.2.1.4.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados
Elprocesodedegradacindelosseishidrogelesfotopolimerizadospreparados,
serealizsiguiendoelprotocolodetrabajoquesedescribeenalapartado6.2.e.,
de la Parte Experimental. Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras
4.29y4.30,respectivamente.
LosperfilesdedegradacindelosgelesP/H10(1:1)F127Acn(n=4,8)/F127SH
4nomostraronhinchamientoinicial(Figura4.30),produciendounadegradacin
de forma gradual y continua en el tiempo. El tiempo de degradacin de estos
hidrogelesessuperiora150das,siendounensayoqueenlaactualidadnoseha
concluido.
171
Captulo4Capitulok
1,4 P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2
1,2
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2
1
35das 63das92das
Hinchamiento
0,8
0,6
a b c
0,4
0,2
0 d e
0 50 100 150
Tiempo(das)
Figura4.29.HinchamientodeloshidrogelesP/H10(1:1)F127Acn(n=2,4,8)/F127SH
A 2enfuncindeltiempo.
1,4 P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4
1,2
63das92das
1
Hinchamiento
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 50 100 150 200
Tiempo(das)
Figura4.30.HinchamientodeloshidrogelesP/H10(1:1)F127Acn(n=4,8)/F127SH4
enfuncindeltiempo.
172
Captulo4
Tabla4.8.Tiempodedegradacindehidrogelesfotopolimerizadosdemezclas
F127Acn(n=2,4,8)/F127SHn(n=2,4).
Tiempodedegracin
HIDROGEL
(das)
P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 42
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 107
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 135
P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 3
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 >150a
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 >150a
a
Ensayosenproceso.
4.2.1.5.Ensayosdeviabilidadcelular
Sehanllevadoacaboestudiosdeviabilidadcelular,tantoenensayos2Dcomo
3D,sobrediferentestiposdemateriales:mezclasdecomponentesendisolucin,
hidrogeles sin polimerizar e hidrogeles polimerizados. Estos estudios in vitro se
realizaron con clulasMSC humanas, utilizando el protocolo de preparacin de
clulas y preparacin de las disoluciones de polmero descrito en el apartado
6.2.f.,delaParteExperimental.
ParaestosensayosseutilizDMEMcomodisolventeenelcasodelasmezclasen
disolucinyenelcasodelosensayossinfotopolimerizar,yDMEMcon0.5%de
fotoiniciador I2959 en los ensayos sujetos a fotopolimerizacin, utilizando en
todosloscasosparalapreparacindelasmezclaselprocedimientoM2descrito
enestecaptulo.
173
Captulo4Capitulok
174
Captulo4
a) 2D/D5(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
95.1 99.7 94.1
100
Viabilidadcelular(%)
81.1 66.0 76.3
80
44.0
60 40.3 46.2
40
20 5.6 4.2 0
0
24horas 48horas 72horas
b) 2D/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
100 94.0 88.9
82.6
Viabilidadcelular(%)
77.6 75.5
80
59.6
60
40 25.9
12.6
20
0 1.8 0 0
0
24horas 48horas 72horas
c) 2D/P/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
100 88.7 87.996.5 85.4 85.0 83.0
Viabilidadcelular(%)
75.1 77.4
80 66.9
60
40
14.4
20 6.2 2.0
0
24horas 48horas 72horas
F127Ac2/F127SH2F127Ac4/F127SH2
F127Ac2/F127SH4F127Ac4/F127SH4
Figura4.31.ViabilidadcelulardemezclasF127Ac2/F127SH2,F127Ac4/F127SH2,
F127Ac2/F127SH4yF127Ac4/F127SH4,enentorno2D:a)al5%(w/v)en
disolucinb)al10%(w/v)enestadogelsinfotopolimerizaryc)al10%(w/v).enestado
gelfotopolimerizado.
Elaumentodeconcentracindegelificante,yportantoelpasoaestadogelpor
efectodelatemperatura(Figura4.31(b)),proporcionaresultadosdiferentesen
funcin de los materiales estudiados. As, supone un ligero aumento de la
175
Captulo4Capitulok
Entodosestosensayos,elmayornmerodegruposacrilatolibrequeconfierela
presencia del derivado F127Ac4 puede explicar la mayor toxicidad observada
enlosmaterialesqueloincluyenensucomposicin.
Paralosensayos2Dsobremezclasdehidrogelesfotopolimerizados(Figura4.31
(c)) se obtuvieron viabilidades celulares superiores al 75%, para tres de los
materiales, destacando particularmente el material 2D/P/H10(1:1)F127Ac
4/F127SH4 que hace posible la viabilidad celular nicamente en el gel
fotopolimerizado.Aligualqueseobservaenlosmaterialessinfotopolimerizar,el
hidrogel2D/P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2muestraunaaltatoxicidad.
Porotraparte,lamorfologiainternaobservadaporSEMparaP/H10(1:1)F127
Ac4/F127SH4 (Figura 4.27) sugiere una mayor densidad de poros e
interconexin entre ellos que podra ser determinante a la hora de facilitar el
transporte de nutrientes y sustancias de desecho a travs del hidrogel poroso
hastalasclulas,aumentandosusupervivenciaconrespectoaP/H10(1:1)F127
Ac4/F127SH2quepresentabaunaestructuramenosporosa(Figura4.25).
176
Captulo4
a) 3D/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
100 85.8
82.4
Viabilidadcelular(%)
80 61.0 57.1
60
38.7 27.6
40 23.8 26.8
20 6.9
0 0 0
0
24horas 48horas 72horas
b) 3D/P/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
100
Viabilidadcelular(%)
80
59.3
60 47.9
36.5
40 21.1 21.6
17.3
20 3.9 3.4 1.8 0 0 0
0
24horas 48horas 72horas
F127Ac2/F127SH2F127Ac4/F127SH2
F127Ac2/F127SH4F127Ac4/F127SH4
Figura4.32.ViabilidadcelulardemezclasF127Ac2/F127SH2,F127Ac4/F127SH2,
F127Ac2/F127SH4yF127Ac4/F127SH4,enentorno3D:a)al10%(w/v)enestado
gelsinfotopolimerizaryb)al10%(w/v)enestadogelfotopolimerizado.
Laelevadamortalidadcelularendisolucinoenhidrogelessinfotopolimerizarse
haatribuidoalapresenciadegruposacrilatolibres.Sinembargo,enhidrogeles
fotopolimerizadossepuedeatribuiralaformacindeestructurasinternasms
compactas para P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 y P/H10(1:1)F127Ac8/F127
177
Captulo4Capitulok
SH4,conmenorinterconexinentreporos,talycomosepuedededucirdelas
imgenes de SEMenel apartado 4.2.1.3 de este captulo,en las Figuras 4.26 y
4.28,respectivamente.
Porotraparte,enelcasodeloshidrogelesbicomponentetantoendisolucin,
comoenestadogelnofotopolimerizadoyfotopolimerizadoenunentorno2D,
se ha observado que la morfologa celular es la tpica alargada de las clulas
adheridasalfondodelpocillo,mientrasqueparaelentorno3Dlamorfologade
las clulas es redondeada, lo que sugiere la baja adhesin de las clulas al
material.
EnlaFigura4.33semuestranimgenes,encontrastedefasesyfluorescencia,en
las que se aprecian las clulas con morfologa alargada, para los ensayos con
diferenteshidrogelesfotopolimerizadosbasadosenF127Acn(n=2,4)/F127SH
n(n=2,4),tras72horasdeensayoenunentorno2D.
178
Captulo4
2D/P/H10(1:1)
179
Captulo4Capitulok
3D/P/H10(1:1)
Conelfindeinvestigarlaposibilidaddereticularlosgelesbasadosenpolmeros
tiolados con otros reticulantes tipo acrilato, se seleccionaron 4 reticulantes de
caractersticas muy diferentes (Figura 4.35): a) un derivado comercial con 4
gruposacrilatoreactivos,elpentaeritrioltetracrilato(PET),b)yc)dosdiacrilatos
lineales de PEG de diferente longitud, un compuesto comercial con 4 unidades
de etilengligol (TEGAc2) y otro con 45 unidades de etilenglicol (PEGAc2)
sintetizado para este estudio (compuesto [19]), y d) un derivado lineal de
PluronicF127,conenlacescarbamatoydosgruposacrilatoterminalestambin
preparadoparaesteestudio(F127NHAc2[21]).
180
Captulo4
a)
b) TEGAc2n=4
PET
c) PEGAc2n=45
d)
F127NHAc2
Figura4.35.Estructuraqumicadelosreticulantesacriladosutilizados.
Paragarantizarlagelificacindelasmuestraseseleccionunaconcentracinde
lospolmerosF127SHn(n=2,4)al5%(w/v),enproporcin1:1enmolesconlos
reticulantes,mezclndolosporelmtodoM2enPBS10mMpH7.4quecontena
un0.5%defotoiniciadorI2959.
Traslafotopolimerizacinloshidrogelessemantuvierona4Cparacomprobar
lareticulacinqumica.
ElnicoreticulantequeprodujolareticulacinqumicadeF127SH2yF127SH
4 fue F127NHAc2, formando hidrogeles fotopolimerizados con el aspecto que
semuestraenlaFigura4.36.
181
Captulo4Capitulok
a) b)
Figura4.36.Aspectodeloshidrogelesa)P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2yb)P/H10
(1:1)F127NHAc2/F127SH4.
4.2.2.2.CaracterizacindelamorfologainternaporSEMdehidrogeles
polimerizadosbasadosenF127NHAc2
100m 100m
a)P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4
Figura4.37.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizados:a)
F127NHAc2/F127SH2;b)F127NHAc2/F127SH4aconcentracionesdel10%en
peso(1:1enmoles).
182
Captulo4
4.2.2.3.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados
P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)
2
1,8 P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2
1,6 P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4
1,4
Hinchamiento
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tiempo(das)
Figura4.38.Hinchamientodeloshidrogeles
P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)enfuncindeltiempo.
183
Captulo4Capitulok
4.2.2.4.Ensayosdeviabilidadcelular
Aligualqueloobservadoenlosestudiosanteriores,estosmaterialesmuestran
unabuenaviabilidadcelularenunentorno2D,conun44%desupervivenciaen
P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2y70%deviabilidadcelularparaP/H10(1:1)
F127NHAc2/F127SH4, tras 72 horas de ensayo. El mayor valor de viabilidad
celular observado para P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4 podra estar
relacionadoconelmayortamaodeporoobservadoporSEM,quepermiteuna
mejordifusindenutrientesysustanciasdedesechodelasclulas.Sinembargo
losresultadosensistemas3Ddenuevoindicanlaprcticamortalidadcelular.
184
Captulo4
a) 2D/P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)
100 89.4 89.0
90 82.8 84.8
80
Viabilidadcelular(%) 70.2
70
60 F127NHAc2/F127SH2
50 44.1
F127NHAc2/F127SH4
40
30
20
10
0
24horas 48horas 72horas
b)
3D/P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)
100
90
80
Viabilidadcelular(%)
70
60 F127NHAc2/F127SH2
50
F127NHAc2/F127SH4
40 34.833.5
30
18.1
20 13.1
10 4.9 4.1
0
24horas 48horas 72horas
Figura4.39.ViabilidadcelulardemezclasF127NHAc2/F127SH2,F127NHAc2/F127
SH4,hidrogelesal10%(w/v)enrelacinmolar(1:1)fotopolimerizados:
a)enentorno2Db)enentorno3D.
185
Captulo4Capitulok
EnlaTabla4.9serecogenconfinescomparativoslosdatosobtenidosderango
detamaodeporosobservadosporSEM,tiempodedegradacinyporcentajes
deviabilidadcelulardeensayos2Dy3Dtras72horas,delosdistintoshidrogeles
fotopolimerizadosdescritostantoenelCaptulo3comoenestecaptulo.
Tabla4.9.Resumendepropiedadesdeloshidrogelesfotopolimerizadosdescritosenel
Captulo3yenelCaptulo4.
Viabilidad
MATERIAL Porosidad(m) Tiempo celular(%)a
%
HIDROGELPOLIMERIZADO (SEM) degradacin 72h.
(w/v)
(P/H)* (das)
2D 3D
18 225 57 47 3
F127Ac2
23 215 57 58 2
CAPTULO3
18 225 93 85 31
F127Ac4
23 240 98 76 19
18 16 276 0 0
F127Ac8
23 14 286 0 0
F127Ac2/F127SH2 10 535 42 75 37
F127Ac4/F127SH2 10 440 107 2 0
F127Ac8/F127SH2 10 830 135 0 0
CAPTULO4
F127Ac2/F127SH4 10 3 77 0
F127Ac4/F127SH4 10 520 >150** 83 0
F127Ac8/F127SH4 10 2560 >150** 0 0
F127NHAc2/F127SH2 10 1545 87 44 5
F127NHAc2/F127SH4 10 3575 100 70 4
*Mezclasbicomponenteenrelacin1:1molar;**Ensayosenproceso.
186
Captulo4
Losmaterialesestudiadoshanpresentadotamaosdeporoqueoscilanentrelas
2 m y las 75 m, y tiempos de degradacin que oscilan entre los 2 y los 10
meses.
187
CAPTULO5:
HIDROGELESNANOESTRUCTURADOS(NANOGELES)
Captulo5
Coneltrminonanogelesseidentificaahidrogelesestructuradosenformade
nanopartculas dispersas en disolucin acuosa. Desde el punto de vista de su
aplicacin, los nanogeles deben cumplir algunas de las especificaciones en
cuantoaestabilizacinytamaoquesecomentanacontinuacin.
Anteunaposibleaplicacindelosnanogelescomotransportadoresdefrmacos,
y con la finalidad de inyectarlos en organismos vivos donde los nanogeles
alcanzanunaltogradodedilucin,resultaimportanteasegurarlaestabilidadde
los nanogeles. La fijacin de estructuras micelares con la luz permite evitar la
conversindelasmicelasencopolmerosbloqueendisolucin,cuandostosse
encuentranencondicionesdealtadilucin,pordebajodesuCMC.
Con este mismo fin, otro aspecto a tener en cuenta es el tamao del nanogel,
que debe ser optimizado para su utilizacin como sistemas de transporte y
liberacincontroladadefrmacos.Eldiferentetamaodelosnanogelesafectaa
su tiempo de permanencia en el torrente sanguneo, as como a su
internalizacin en la clula y a la biodisponibilidad de las nanopartculas que
contienen el frmaco.126 El tamao ideal de los nanogeles para garantizar su
internalizacin por endocitosis en las posibles clulas diana debe ser inferior a
100 nm. Nanogeles con tamaos entre los 5 y los 10 nm son eliminados por
excrecinrenal.Laspartculasentre10y70nmpermitenunmayortiempode
permanenciaeneltorrentesanguneo,ysupequeotamaopermitellegaralos
capilaresdepequeotamaoquepresentanalgunostejidos.Laspartculasentre
70 y 200 nm presentan los tiempos de permanencia en el torrente sanguneo
ms prolongados.126, 127 Las partculas con tamaos mayores de 200 nm son
eliminadas directamente por el bazo o por fagocitosis en las clulas, lo que se
traduce en un menor tiempo de permanencia en el torrente sanguneo. Por
126
Stolnik,S.;Illum,L.;Davis,S.S.,AdvancedDrugDeliveryReviews1995,16(23),195
214.
127
Ishida, O.; Maruyama, K.; Sasaki, K.; Iwatsuru, M., International Journal of
Pharmaceutics1999,190(1),4956.
191
Captulo5Capitulo
Estetamaopermite,adems,aprovecharelfenmenodevectorizacinpasiva
conocidocomoefectoEPR(EnhancedPermeationRetentionEffect),129quese
produce en tejidos tumorales debido a la hiperpermeabilidad de los vasos
sanguneos que los rodean. Este fenmeno, junto con la escasa eliminacin de
losnanogelesporpartedelsistemalinftico,permitelaacumulacinselectivade
losnanogeleseneltumor.
128
Vinogradov, S. V.; Bronich, T. K.; Kabanov, A. V., Advanced Drug Delivery Reviews
2002,54(1),135147.
129
Khandare,J.;Calderon,M.;Dagia,N.M.;Haag,R.,ChemicalSocietyReviews2012,41
(7),28242848.
130
Han,J.;Zhou,C.;Wu,Y.;Liu,F.;Wu,Q.,Biomacromolecules2013,14(5),15291540.
192
Captulo5
193
Captulo5
5.1.PREPARACINDENANOGELES
Paralapreparacindeloshidrogelesnanoestructuradossehaseguidoelmtodo
descrito por Tae et al. utilizado para la preparacin de nanogeles de F127Ac
2,76b, 102, 103, 131, el cual se ha adaptado con pequeas modificaciones. Este
mtodo consiste en la preparacin de una disolucin del correspondiente
copolmero bloque a concentracin superior a su CMC, con la consiguiente
formacin de micelas, y la posterior fijacin de las estructuras micelares por
fotopolimerizacin en la disolucin precursora. La utilizacin de este mtodo
suponelapreparacindelosnanogelesenunsolopasoydeformasencilla.
5.1.1.DeterminacindelaCMC
131
Choi,W.I.;Kim,Y.H.;Tae,G.,MacromolecularResearch2011,19(6),639642
132
(a) Ashjari, M.; Khoee, S.; Mahdavian, A. R.; Rahmatolahzadeh, R., S, Journal of Materials
ScienceMaterialsinMedicine2012,23(4),943953;(b)Kulthe,S.S.;Inamdar,N.N.;Choudhari,
Y.M.;Shirolikar,S.M.;Borde,L.C.;Mourya,V.K.,ColloidsandSurfacesb:Biointerfaces2011,88
(2),691696;(c)Sharma,P.K.;Bhatia,S.R.,InternationalJournalofPharmaceutics2004,278(2),
361377; (d) Kabanov, A. V.; Nazarova, I. R.; Astafieva, I. V.; Batrakova, E. V.; Alakhov, V. Y.;
Yaroslavov,A.A.;Kabanov,V.A.,Macromolecules1995,28(7),23032314.
195
Captulo5Capitulo
Elmtododelpirenosefundamentaenladiferenciadelespectrodeexcitacin
del pireno segn se encuentre en un entorno hidrfilo (exc max = 332 nm) o
hidrfobo (exc max = 335 nm). En disoluciones diluidas de copolmero bloque
lineal o dendrticolinealdendrtico (por debajo de la CMC), el pireno se
encuentraenunentornohidrfilo,mientrasqueendisolucionesporencimade
la CMC, el pireno se localizar preferentemente en la parte hidrfoba de las
micelas,dadalanaturalezahidrfobadeste,loqueproduceeldesplazamiento
de su mximo de excitacin de 332 nm a 335 nm. El grfico para la
determinacindelaCMCseobtieneconlarepresentacindelarelacindelas
intensidadesI335/I332,frenteallogaritmodelaconcentracin(LogC).Cuandola
concentracin del polmero anffilo supera la CMC, la relacin I335/I332 aumenta
considerablemente y alcanza un mximo que indica que se ha encapsulado la
mayor concentracin posible de pireno. La CMC del polmero se determina
calculandolainterseccindelasdoszonasrectasendichagrfica.
Lapreparacindelasmuestrasascomolascondicionesdemedidasedescriben
condetalleenelapartado6.2.h.,delaParteExperimental.
196
Captulo5
a) F127Ac2
1,2
Relaciondeintensidades
1,15
1,1
1,05
(I335/I332)
1
0,95
0,9
0,85
5 4 3 2 1 0
LogC(%(w/v))
b) F127Ac4
1,2
1,15
Relaciondeintensidades
1,1
1,05
(I335/I332)
1
0,95
0,9
0,85
5 4 3 2 1 0
LogC(%(w/v))
c) F127Ac8
1,2
Relaciondeintensidades
1,15
1,1
1,05
(I335/I332)
1
0,95
0,9
0,85
5 4 3 2 1 0
LogC(%(w/v))
Figura5.1.RepresentacingrficadelarelacindeintensidadesI335/I332frenteal
logaritmodelaconcentracin(logC),a)F127Ac2,b)F127Ac4yc)F127Ac8.
EnlaTabla5.1serecogenlosvaloresdeCMCobtenidosporelmtododelpireno
paralostrescopolmerosestudiados.
197
Captulo5Capitulo
Tabla5.1.CMCsobtenidasporelmtododelpirenoparaloscompuestosacrilados,
F127Ac2,F127Ac4yF127Ac8.
DERIVADO CMC(%(w/v))a25C
F127Ac2 0.032
F127Ac4 0.014
F127Ac8 0.011
LaCMCdelosderivadosacriladossintetizadosesconsiderablementeinferiorala
descritaparaPluronicF127(0.25%(w/v)).133Laintroduccindegruposacrilato
en Pluronic F127 supone una importante disminucin de la CMC. Adems, la
funcionalizacin de la estructura de Pluronic F127 con dendrones es efectiva
para la reduccin de la CMC, tal y como se observa al pasar del copolmero
bloquelineal,F127Ac2,aloscopolmerosbloquedendrticolineal,F127Ac4y
F127Ac8.
5.1.2.Fotopolimerizacindelosnanogeles
Paralaobtencindelosnanogelesfotopolimerizadosseprepararondisoluciones
precursoras de F127Ac2, F127Ac4 y F127Ac8 en concentracin del 0.77 %
(w/v),utilizandoparasudisolucinaguadestiladaconun0.1%defotoiniciador
I2959.Estaconcentracinseeligideacuerdoalosestudiospreviosrealizados
porTaeetal,103enlosqueseobtuvieronnanogelesdeF127Ac2condiamtros
dealrededorde60nm.Asuvez,estaconcentracinessuperioralaCMCdelos
tres compuestos estudiados, lo que garantiza la autoorganizacin en micelas
necesariaparalaposteriorformacindelosnanoagregados.
133
(a)Perry,C.C.;Sabir,T.S.;Livingston,W.J.;Milligan,J.R.;Chen,Q.;Maskiewicz,V.;
Boskovic,D.S.,JournalofColloidandInterfaceScience2011,354(2),662669;(b)Gao,
Q.;Liang,Q.;Yu,F.;Xu,J.;Zhao,Q.;Sun,B.,ColloidsandSurfacesb:Biointerfaces2011,
88(2),741748.
198
Captulo5
micelasnofotopolimerizadaspresentesenelsistemayeliminarlasenformade
monmerolibreendisolucin.Adems,trasesteproceso,seeliminanagregados
de tamao menor a 30 nm, debido a las caractersticas de la membrana de
dilisis.Finalmente,lasdisolucionessometidasadilisissefiltraronconfiltrosde
0.2 m para la eliminacin de agregados de tamao superior a los 200 nm. La
preparacin detallada de los nanogeles se describe en el apartado 6.2.i., de la
ParteExperimental.
EnlaFigura5.2semuestradeformaesquemticaelprocesodeformacindelos
nanogeles.Lasmicelasendisolucin(Figura5.2(a)),unavezfotopolimerizadas
(Figura5.2(b)),proporcionannanogelescondominioshidrfobosformadospor
los bloques de PPG y dominios hidrfilos formados por los bloques de PEG en
contactoconelagua.
UV365nm
10min
Gruposacrilato
CoronadePEG
NcleodePPG
a) C>CMC b)Nanogelfotopolimerizado
Figura5.2.Representacinesquemticadelprocesodeformacinmediante
fotopolimerizacindelosnanogeles,a)micelasformadasaconcentracinsuperiorala
CMC(ConcentracinMicelarCrtica);b)Nanogelfotopolimerizado.
Conelfindeidentificarlosdiferentesnanogelessehautilizadolanomenclatura
queseexplicaconelsiguienteejemplo.PDF/NF127Ac2identificaunnanogel
en el que las letras PDF/N indican que se trata de un nanogel (N) obtenido
mediantefotopolimerizacin(P),dializado(D)yfiltradoconfiltrode0.2m(F),
preparadoapartirdelcopolmeroF127Ac2.
199
Captulo5Capitulo
Traslafotopolimerizacina37C,losnanogelespresentaronmorfologaesfrica
contamaosdelordendelasmicras,comosepuedeobservarenlaFigura5.3
(a). Sin embargo los agregados obtenidos tras la fotopolimerizacin a 25 C
presentaron tamaos nanomtricos manteniendo la forma esfrica (Figura 5.3
(b)).Elmayortamaoobtenidoalrealizarlafotopolimerizacina37Csepuede
explicarporlamayormovilidadqueadquierenlasmicelasaestatemperatura,lo
quefavoreceelcontactomicelaryconellolaformacindeagregadosdemayor
tamao. Por otra parte, tambin se ha descrito que en los copolmeros bloque
queposeenLCST,elaumentodetemperaturafavoreceelaumentodelnmero
demolculasqueformanlasmicelas,formandomicelasdemayortamao.84
200
Captulo5
0.5m 0.5m
a)PD/NF127Ac2 b)PDF/NF127Ac2
Fotopolimerizacina37C Fotopolimerizacina25C
Figura5.3.ImgenesTEMdenanogelesdeF127Ac2,a)nanogelesobtenidosmediante
polimerizacina37Cydializados,b)nanogelesobtenidosmediantepolimerizacina
25C,dializadosyfiltrados.
Noobstante,paralavalidacindelmtododeobtencinporfotopolimerizacin
establecidoparalosnanogelesyaplicadoalosmaterialesF127Ac4yF127Ac8,
tras la fotopolimerizacin de las muestras a 25 C, y como paso previo al
tratamiento de dilisis y filtracin, se comprob la correcta formacin de
nanogelesmedianteTEMySEM.
EnlaFigura5.4y5.5semuestranlasimgenesdeTEMySEMrespectivamente
detodoslosmaterialesestudiados,antesdesersometidosaprocesosdedilisis
yfiltracin.Entodaslasmuestras,tantoporTEMcomoporSEM,seobservla
presencia de nanogeles de forma esfrica y tamao nanomtrico tras la
fotopolimerizacin a 25 C, lo que confirma tambin la viabilidad del mtodo
descritoporTaeetal.yadaptadoparalapreparacindenanogelesapartirde
losderivadosF127Ac4yF127Ac8.
201
Captulo5Capitulo
200nm 50nm
a)P/NF127Ac2 b)P/NF127Ac2
500nm 100nm
c)P/NF127Ac4 d)P/NF127Ac4
100nm 50nm
e)P/NF127Ac8 f)P/NF127Ac8
Figura5.4.ImgenesTEMdenanogelespreparadosporpolimerizacina25C,a)yb)
P/NF127Ac2,c)yd)P/NF127Ac4,d)yf)P/NF127Ac8.
202
Captulo5
2m 1m
a)P/NF127Ac2 b)P/NF127Ac2
1m 500nm
c)P/NF127Ac4 d)P/NF127Ac4
1m 500nm
e)P/NF127Ac8 f)P/NF127Ac8
Figura5.5.ImgenesSEMdenanogelespreparadosporpolimerizacina25C,a)yb)
P/NF127Ac2,c)yd)P/NF127Ac4,d)yf)P/NF127Ac8.
5.1.3.Liofilizacindelosnanogelesfotopolimerizados
Unavezdemostradalaformacindenanogelestraslafotopolimerizacin,ytras
su purificacin por dilisis y filtracin, se procedi a la eliminacin del agua
medianteliofilizacin.Deestaformasepudoestimarelrendimientodelproceso
depreparacindelosnanogelesllevadoacabo.
203
Captulo5Capitulo
Tabla5.2.Miligramosdenanogelobtenidostraseltratamientodedilisisyfiltracinde
losnanogelesfotopolimerizados.
a
Obtenidostraslaliofilizacindealcuotasde5mL.
S.D.DesviacinEstandar
Estosresultadostienenimplicacionesenestudiosposteriores,comoporejemplo
los estudios de encapsulacin de molculas enel interior de los nanogeles y la
determinacin de la viabilidad celular, ya que es fundamental conocer la
concentracindelasdisolucionesconlasquesetrabaja.Paraelcasodelosdos
materialesquenopermitensuredisolucin,PDFNF127Ac4yPDFNF127Ac
8, las concentraciones de trabajo utilizadas son las que se recogen en la Tabla
5.2.
204
Captulo5
5.2.ENCAPSULACINENNANOGELESPDF/NF127Acn(n=2,4y8)
Parademostrarlaposibilidaddeencapsulacinambostiposdemolculassehan
realizado estudios eligiendo como molcula hidrfila la rodamina B y como
molculahidrfobaelpireno,cuyasestructurassemuestranenlaFigura5.6.
RodaminaBmolculahidrfilaPirenomolculahidrfoba
Figura5.6.EstructuraqumicadeRodaminaByPirenoutilizadosparalaencapsulacin
enlosnanogeles.
205
Captulo5Capitulo
Tabla5.3.ResultadosdeencapsulacinderodaminaBypirenoenlosnanogeles.
gencap./mg
NANOGEL EE(%) %encap.a
nanogel
PDF/NF127Ac2ROD 56.9 40.6 37.2
PDF/NF127Ac4ROD 68.9 48.8 45.3
PDF/NF127Ac8ROD 71.1 50.6 47.1
PDF/NF127Ac2PIR 67.8 46.3 42.6
PDF/NF127Ac4PIR 54.7 37.8 34.4
PDF/NF127Ac8PIR 59.4 40.9 37.4
a
%enpesodemolculaencapsuladaconrespectoalpesodefluorforo(rodaminaB
opireno)aadido(0.15mgdefluorforo/mgdenanogel).
LacantidadderodaminaBypirenoencapsuladoexpresadacomolaEficienciade
Encapsulacin(EE%),secalculaapartirdelassiguientesecuaciones:79b
% 100
% 100
206
Captulo5
% 100
207
Captulo5Capitulo
800 =332
700
600
PFF/NF127Ac2PIR
500
Intensidad
PFF/NF127Ac4PIR
400
300 PFF/NF127Ac8PIR
200
100
0
300 310 320 330 340 350
Longituddeonda(nm)
Figura5.7.Espectrosdeexcitacindelosnanogelescargadosconpireno.
Desplazamientodelmximodeexcitacina335nmdebidoalpirenosituadoenun
entornohidrfobo.
5.3.CARACTERIZACINMORFOLGICADENANOGELESPDF/NF127Acn(n=2,
4y8)
Lamorfologaytamaodelosdistintosnanogelespreparadosfueestudiadapor
TEM,SEMyDLS.
Morfologa
208
Captulo5
500nm 100nm
a)PDF/NF127Ac2 b)PDF/NF127Ac2
100nm 100nm
c)PDF/NF127Ac4 d)PDF/NF127Ac4
500nm 50nm
e)PDF/NF127Ac8 f)PDF/NF127Ac8
Figura5.8.ImgenesTEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializadosyfiltados
a)yb)PDF/NF127Ac2,c)yd)PDF/NF127Ac4,d)yf)PDF/NF127Ac8.
209
Captulo5Capitulo
1m 500nm
a)PDF/NF127Ac2 b)PDF/NF127Ac4
200nm 500nm
c)PDF/NF127Ac4 d)PDF/NF127Ac8
Figura5.9.ImgenesSEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializadosyfiltrados
a)PDF/NF127Ac2,b)yc)PDF/NF127Ac4yd)PDF/NF127Ac8.
210
Captulo5
200nm 100nm
a)PDF/NF127Ac2REDISUELTO b)PDF/NF127Ac2REDISUELTO
Figura5.10.ImgenesTEMdenanogelesPDF/NF127Ac2redisueltosenaguadestilada
trassersometidosaliofilizacin.
500nm 500nm
a)PDF/NF127Ac2REDISUELTO b)PDF/NF127Ac2REDISUELTO
Figura5.11.ImgenesSEMdenanogelesPDF/NF127Ac2redisueltosenaguadestilada
trassersometidosaliofilizacin.
Por lo que respecta a los nanogeles cargados, mediante TEM (Figura 5.12) se
observlamorfologaredondeadadelosnanogelestraslacargaderodaminaB.
211
Captulo5Capitulo
100nm 200 nm
a)PDF/NF127Ac2ROD b)PDF/NF127Ac2ROD
200nm 200nm
c)PDF/NF127Ac4ROD d)PDF/NF127Ac4ROD
100nm 100nm
e)PDF/NF127Ac8ROD f)PDF/NF127Ac8ROD
Figura5.12.ImgenesTEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconrodaminaB:a)PDF/NF127Ac2RODencampoclaro,b)PDF/NF127
Ac2RODencampooscuroc)PDF/NF127Ac4RODencampoclaro,d)PDF/NF127Ac
4RODencampooscurod)PDF/NF127Ac8RODencampoclaro,f)PDF/NF127Ac8
RODencampooscuro.
212
Captulo5
Cabe destacar, que ninguno de los nanogeles sin cargar present difraccin de
electrones,confirmandoqueladifraccinesdebidaalarodaminaBcargadaen
el interior de los nanogeles. En la Figura 5.13 (a) se muestran los puntos de
difraccin obtenidos para los nanogeles PDF/NF127Ac2ROD, donde se
observaladifraccinatribuidaalarodaminaBenelinteriordelosnanogelesy
para los nanogeles PDF/NF127Ac2 sin cargar (Figura 5.13 (b)), donde no se
observaningunasealdedifraccin.
a) b)
Figura5.13.PatronesdedifraccindelosnanogelesPDF/NF127Ac2a)nanogeles
cargadosconrodaminaByb)nanogelessincargar.Lospuntosblancoscorrespondena
distintospuntosdedifraccin,algunosdeloscualessesealanconflechas.
213
Captulo5Capitulo
500nm 400nm
a)PDF/NF127Ac2ROD b)PDF/NF127Ac2ROD
400nm 300nm
c)PDF/NF127Ac4ROD d)PDF/NF127Ac4ROD
1m 500nm
e)PDF/NF127Ac8ROD f)PDF/NF127Ac8ROD
Figura5.14.ImgenesSEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconrodaminaBa)yb)nanogelesdeF127Ac2,c)yd)nanogelesdeF127Ac
4,d)yf)nanogelesdeF127Ac8.
214
Captulo5
Por TEM (Figura 5.15) y por SEM (Figura 5.16) se observaron morfologas
redondeadasparalosnanogelesPDF/NF127Ac2PIRyPDF/NF127Ac4PIR.
100nm 50nm
a)PDF/NF127Ac2PIR b)PDF/NF127Ac2PIR
200nm 100nm
c)PDF/NF127Ac4PIR d)PDF/NF127Ac4PIR
Figura5.15.ImgenesTEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconPirenoa)yb)PDF/NF127Ac2PIR,c)yd)PDF/NF127Ac4PIR.
215
Captulo5Capitulo
500nm 400nm
a)PDF/NF127Ac2PIR b)PDF/NF127Ac2PIR
500nm 400nm
c)PDF/NF127Ac4PIR d)PDF/NF127Ac4PIR
Figura5.16.ImgenesSEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconPirenoa)yb)PDF/NF127Ac2PIR,c)yd)PDF/NF127Ac4PIR.
Tamao
EltamaodelosnanogelesobtenidosendisolucinsemidimedianteDLS.No
obstante, se midieron tambin los dimetros medios de los nanoobjetos
observados en las imgenes de TEM y SEM. En la Tabla 5.4 se recogen los
dimetros estimados mediante TEM, SEM y DLS para diferentes nanogeles,
PDF/NF127Acn(n=2,4,8)sincargar,PDF/NF127Ac2red,nanogelredisuelto
despus de ser liofilizado y los nanogeles cargados con rodamina B y pireno,
PDF/NF127AcnROD(n=2,4,8)yPDF/NF127AcnPIR(n=2,4,8).
216
Captulo5
Tabla5.4.Dimetrosdediferentesnanogelesestudiados,estimadosporTEMySEMy
porDLSa25Cy37C.
61.91 520.3
PDF/NF127Ac2 9542 13822b
0.1950.006 0.1790.009
74.90.7 56.50.9
PDF/NF127Ac4 5216 4110
0.4390.009 0.3910.011
126.59.2 1020.9
PDF/NF127Ac8 6331 119.838
0.5590.071 0.3580.021
62.411.4 31.53.4
PDF/NF127Ac2redis 81.336.8 69.228
0.5430.069 0.1970.051
130.21.5 123.31.8
PDF/NF127Ac2ROD 82.544 68.227
0.4730.012 0.3790.050
891 72.18.1
PDF/NF127Ac4ROD 89.840 59.130
0.4230.012 0.4390.117
146.91.6 124.44.1
PDF/NF127Ac8ROD 145.531b 135.731b
0.2940.009 0.3030.008
55.80.5 49.90.4
PDF/NF127Ac2PIR 61.225 64.413
0.1820.005 0.1880.02
76.13 63.21.1
PDF/NF127Ac4PIR 46.614.4 58.813.5
0.5180.078 0.5700.03
95.72.6 85.01.2
PDF/NF127Ac8PIR
0.3770.002 0.2820.008
a
Tamaoscalculadoscomolamediadelamedidade,almenos,20nanogeles.
b
Tamaoscalculadoscomolamediadelamedidademenosde10nanogeles.
S.D.DesviacinEstndar.
Antesdepasaracomentarlosresultadosencontradosesprecisotenerencuenta
quelatcnicadeDLSmideeldimetrohidrodinmico,mientrasqueporSEMy
TEM las medidas se realizan sobre muestras deshidratadas, lo que puede dar
lugaraunadiscordanciaenlostamaosestimadosdeldimetroconrespectoa
217
Captulo5Capitulo
losnanogelesendisolucin,talycomosehaobservado.Adems,enalgunosde
los casos se obtienen diferencias significativas de tamao entre lo medio por
TEM y lo medido por SEM, que pueden ser debidas a la presencia de un
recubrimientodeorocomopartedelapreparacindelamuestraparaSEM.Este
recubrimiento puede alcanzar un espesor suficiente que enmascara los
nanoobjetosdemenortamao,dandolugaramedidasquepuedensererrneas.
Finalmente,enalgunasmuestrasdeTEMy/oSEMelmuestreofueinferiora20
nanogelesoinclusoenPDF/NF127Ac8PIRnosevisualizaronlosnanogeles,lo
queseatribuyaldeteriorodelamuestra.
Porloanteriorexpuesto,ydadoqueelmediodeaplicacindelosnanogeleses
en disolucin, la discusin se va a centraren los resultados obtenidos por DLS.
Conelfindeobservarlaposibletermosensibilidaddelosnanogeles,lasmedidas
serealizaronadostemperaturas,25Cy37C.
Tal y como se observa en los datos obtenidos por DLS a 37 C, los nanogeles
estudiadostienendimetrosentre50100nm,porloquesepuededecirque,en
general,sutamaoeseladecuadoparasuaplicacinentransporteyliberacin
controladadefrmacos.
DelanlisisdeestosdatosexperimentalessepuedecomentarquemedianteDLS
a 25 C los nanogeles fotopolimerizados PDF/NF127Acn (n=2, 4, 8) muestran
unincrementodeltamaoconelaumentodegeneracindelderivadoutilizado,
loqueresultacoherenteconelmayortamaodelasmolculasalincrementarla
generacindelaestructuradendrtica.
218
Captulo5
Del anlisis de los resultados obtenidos con los nanogeles cargados, se puede
comentarqueenelcasodelosnanogelescargadosconrodaminaBseprodujo
un aumento del tamao con respecto a los nanogeles no cargados, siendo la
variacin de tamao de 68.3 nm para PDF/NF127Ac2ROD, de 14 nm para
PDF/NF127Ac4RODyde20.4nmparaPDF/NF127Ac8(medidasa25C).El
incremento ms significativo de tamao, que se produce para los nanogeles
PDF/NF127Ac2ROD, puede atribuirse a una estructura externa del nanogel
menos rgida debido a la menor cantidad de grupos acrilato presentes, lo que
permiteunamayordeformacindelnanogelparaalojarlarodaminaB.
Aligualqueenlosotroscasosestudiados,losnanogelescargadosmantienensu
comportamiento termosensible como se deduce de los tamaos determinados
porDLS,alasdostemperaturas(Tabla5.4).Lasvariacionesdetamaocoinciden
conlasobservadasenlosnanogelessincargar.
5.4.ENSAYOSCELULARES
219
Captulo5Capitulo
5.4.1.Viabilidadcelular
ConelmaterialPDF/NF127Ac2seensayarontresconcentraciones,0.25,0.5y
1 mg/mL, preparando estas muestras por disolucin directa del material
liofilizadoenmediodecultivoDMEMF12paraclulasMSCyDMEMhighglucose
paraclulasHeLa,alaconcentracindeseada.
EnelcasodePDF/NF127Ac4(conunaconcentracinenaguadestiladade0.54
mg/ml)los ensayosdeviabilidadcelularsloserealizaronaunaconcentracin
de0.25mg/ml.Porelcontrario,conPDF/NF127Ac8(conunaconcentracinen
aguadestiladade1.9mg/ml)seensayaronalastresconcentraciones,0.25,0.5y
1mg/ml.
EnlaFigura5.17semuestranlosresultadosdeviabilidadcelularobtenidospara
lostrestiposdenanogelesestudiadosconlasdoslneascelulares.
220
Captulo5
a) PDF/NF127Acn(n=2,4,8) b) PDF/NF127Acn(n=2,4,8)
0.25mg/mLHeLa 0.25mg/mlMSC
140
ViabilidadCelular(%) 117,0 140
ViabilidadCelular(%)
102,0 111,3
120 120
80,4
100 63,3 81,2 100 75,1
74,8 64,5 62,7
80 80
57,4 43,1 53,0
60 60 19,6 32,6 56,1
40,9
40 40 12,9
20 20
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
c) PDF/NF127Acn(n=2,8) d) PDF/NF127Acn(n=2,8)
0.5mg/mLHeLa 0.5mg/mlMSC
140 119,0 140
ViabilidadCelular(%)
ViabilidadCelular(%)
120 120
100 77,9 100
61,6 71,6
80 61,2 54,7 80 59,6
60 42,1 60 33,4
40 40 30,9 24,0
20 20 14,7
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
e) PDF/NF127Acn(n=2,8) f) PDF/NF127Acn(n=2,8)
1mg/mLHeLa 1mg/mlMSC
140 140
ViabilidadCelular(%)
ViabilidadCelular(%)
120 108,8
120
100 100
80 80 53,3
47,6 53,1 50,2
60 48,3 60
40 40 18,9
12,9 17,1 8,4 8,1
20 4,9 20
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas
PDF/NF127Ac2PDF/NF127Ac4PDF/NF127Ac8
Figura5.17.ViabilidadcelulardelosnanogelesPDF/NF127Ac2,PDF/NF127Ac4y
PDF/NF127Ac8,aconcentraciones0.25mg/mL(ayb),0.5mg/mL(cyd)y1mg/mL
(eyf),encultivosconclulasHeLa(columnadelaizquierda)yconclulasMSC
(columnadeladerecha).
ParaclulasHeLa,losnanogelesPDF/NF127Ac4yPDF/NF127Ac8sonmenos
citotxicos a concentracin 0.25 mg/ml tras 72 horas de ensayo que los
nanogelesPDF/NF127Ac2.Cabedestacar,quelosnanogelesPDF/NF127Ac8
221
Captulo5Capitulo
Por otra parte, con el fin de poder comparar nuestros resultados con anlogos
descritos en la literatura, decir que los nicos valores de viabilidad celular
comparables, han sido descritos para PDF/NF127Ac2. Estos nanogeles a una
concentracin de 1 mg/mL, tras 24 horas de ensayo, con cultivos con clulas
tumorales SCC7, mostraron viabilidades prximas al 100%.76b Estos resultados
reflejan la clara influencia del tipo de clula utilizada para la realizacin de los
ensayosenelvalordelaviabilidadcelular.
5.4.2.Ensayosdeinternalizacin
Conelfindeanalizarlacapacidaddeestosnanogelesdeaccederalinteriorde
las clulas, se han realizado tambin ensayos de internalizacin celular,
utilizandoparaelmarcajedelosnanogelesrodaminaByunamolculaderivada
delamisma,talycomosediscuteenlossiguientessubapartados.
EstudiosdeinternalizacindenanogelescargadosconrodaminaB
222
Captulo5
Paraestosestudios,los filamentosdeactinadelcitoesqueletodelasclulasse
marcaron utilizando el fluorforo verde Alexa fluor 488, y el ncleo se ti
utilizando el fluorforo azul DAPI. Esta tincin permite distinguirlos de los
nanogeles cargados que se observaron de color rosa, caracterstico de la
rodamina B. El procedimiento de preparacin, incubacin de las clulas con la
disolucin de nanogel cargado con rodamina B y marcaje de las clulas se
describeenelapartado6.2.l.,delaParteExperimental.
EnlaTabla5.5serecogenlascaractersticasgeneralesrelativasalosensayosde
internalizacin realizados. En la primera y la segunda columna se incluyen la
concentracin de nanogel y la cantidad de rodamina B encapsulada por
miligramodenanogelenladisolucininicialdenanogeles,respectivamente.La
tercera columna recoge la concentracin final de nanogel utilizada en los
ensayos de internalizacin tras ajustar la concentracin por adicin de DMEM
highglucose,hastaunvolumentotalde500L.Lacuartacolumnacorresponde
alacantidadtotalderodaminaBencapsuladapresenteenelensayo.
Tabla5.5.ConcentracindenanogelesycantidadderodaminaButilizadaenlos
ensayosdeinternalizacin.
gROD
C.disa C.Intb gRODc
NANOGEL encap./mg
(mg/mL) .(mg/mL) encap.
nanogel
PDF/NF127Ac2ROD 1.0* 56.9 0.8 23
PDF/NF127Ac4ROD 0.54 68.9 0.5 17
0.675 23
PDF/NF127Ac8ROD 1.90 71.1
1.35 48
a
Concentracindenanogelenladisolucininicial,enaguadestilada
b
Concentracindenanogelenelensayodeinternalizacin.
c
g de rodamina B encapsulados presentes en un volumen de 500 L utilizados en el
ensayodeinternalizacin.
*Concentracinobtenidaporredisolucindenanogelesliofilizadosenaguadestilada.
223
Captulo5Capitulo
LaconcentracinfinalderodaminaBdelnanogelPDF/NF127Ac4RODestuvo
limitada por la baja concentracin de nanogel obtenida tras la preparacin y
tratamiento de los nanogeles, proporcionando disoluciones con menor
contenidodenanogelesyrodaminaBencapsulada.
EnelcasodelarodaminaBencapsuladaenlosnanogelesPDF/NF127Ac2ROD
y PDF/NF127Ac8ROD (Figura 5.18 (c) y (e) respectivamente) tambin se
observ internalizacin de rodamina B en las clulas. En este caso, y debido al
tamaoquepresentanlosnanogelescargadosconrodaminaB,cabeesperarun
procesodeinternalizacinporendocitosis.134Uncasoparticulareselobservado
con PDF/NF127Ac4ROD (Figura 5.18 (d)), detectndose la ruptura del
citoesqueleto, probablemente debido a la baja concentracin de medio de
cultivo presente en el ensayo, que da lugar a una disolucin hipotnica y la
consiguiente explosin de las paredes celulares. Con estos ensayos cualitativos
realizados es difcil percibir el grado de internalizacin de los nanogeles con
rodaminaBconrespectoaloscontrolesascomodiferenciarsilarodaminaBse
liberaantesdeentrarenlaclula,alaqueentrapordifusin.
134
Alberts,B.,Johnson,A.,Lewis,J.,Raff,M.,Roberts,K.,Walter,P.,MolecularBiology
oftheCell,4thedition,GarlandScience,NewYork.2002.
224
Captulo5
a) b)
CONTROL37CROD(23g) CONTROL37CROD(17g)
c) d)
PDF/NF127Ac2ROD37C(23g) PDF/NF127Ac4ROD37C(17g)
e)
PDF/NF127Ac8ROD37C(23g)
Figura5.18.Imgenesdemicroscopaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaBlibrea37C:a)23gyb)
17g.EnsayosconrodaminaBencapsulada:c)PDF/NF127Ac2ROD,d)PDF/NF127
Ac4RODye)PDF/NF127Ac8ROD.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadel
citoesqueleto,enrojo:rodaminaB.Laescalacorrespondea20m.
225
Captulo5Capitulo
EnamboscontrolessedetectalainternalizacinderodaminaBensuformalibre
debida a procesos de difusin (imagenes (a) y (b)). Como se ha observado y
comentadoanteriormente,a37Cdenuevoseproducelainternalizacindelos
nanogeles (imagen (c)), siendo difcil percibir el grado de internalizacin con
respecto al control. A 4 C se observa un aumento de la fluorescencia en el
interiordelasclulas(imagen(d))conrespectoalensayoanlogorealizadoa37
C(imagen(c)).ConsiderandoquelarodaminaBencapsuladaenlosnanogeles
nopuedeinternalizarseporquea4Cseproducelainhibicindelaendocitosis,
elaumentodefluorescenciadebecorresponderarodaminaBlibreinternalizada
porunprocesodedifusin.Porello,estosresultadosparecenindicarquedebido
a la termosensibilidad que presentan los nanogeles, stos experimentan un
aumento de tamao con la disminucin de la temperatura, lo que produce la
liberacinalmediodelarodaminaBencapsulada,creandoasungradientede
concentracin responsable de la internalizacin de la rodamina B en su forma
libreporunprocesodedifusin.Estacircunstanciahacequeesteexperimento
226
Captulo5
a) b)
CONTROL37CROD(48g) CONTROL4CROD(48g)
c) d)
PDF/NF127Ac8ROD37C(48g) PDF/NF127Ac8ROD4C(48g)
Figura5.19.Imgenesdemicroscopiaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaBlibre:a)48g,37Cyb)
48g,4C.EnsayosconrodaminaBencapsulada:c)PDF/NF127Ac8RODa37C,d)
PDF/NF127Ac8RODa4C.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadelcitoesqueleto,
enrojo:rodaminaB.Laescalacorrespondea20m.
ConelfindemodificarlarpidaliberacindelarodaminaBa4Calmediode
ensayo,debidofundamentalmenteasuelevadasolubilidadenagua,sepensen
un modelo ms adecuado que permitiera comprobar la encapsulacin y los
procesos de internalizacin por endocitosis de los nanogeles cargados, modelo
queseexplicaacontinuacin.
227
Captulo5Capitulo
ConestefinsediseunamolculafuncionalizadaconundendrndebisMPA
de primera generacin con cadenas terminales de cido esterico (Rodamina
EST), cuya estructura se muestra en la Figura 5.20. Esta molcula, que ha sido
sintetizada y utilizada en el grupo de investigacin, ha demostrado una mayor
capacidaddeinternalizacinenlasclulaspordifusinensuformalibrequela
rodaminaB,loquepuedefacilitarestudioscomparativoscualitativos.
Figura5.20.EstructuraqumicadelarodaminaESTquesecaracterizaporsucarcter
anffilo.
228
Captulo5
ParalaincubacindelasclulasHeLaconlosnanogelescargadosconrodamina
ESTylatincindelasclulasconAlexafluor488yDAPIseprocediconformeal
procedimientodescritoenelapartado6.2.l.,delaParteExperimental.
Tabla5.6.ConcentracindenanogelesycantidadderodaminaESTutilizadaenlos
ensayosdeinternalizacin.
gRODEST
C.dis.a C.intb gRODEST
NANOGEL encap./mg
(mg/mL) (mg/mL) encap.
nanogel
PDF/NF127Ac2RODEST 1.0* 150 0.64 50
PDF/NF127Ac4RODEST 0.54 150 0.32 25
PDF/NF127Ac8RODEST 1.90 150 0.64 50
a
Concentracindenanogelenladisolucininicial,enaguadestilada.
b
Concentracindenanogelenelensayodeinternalizacin.
c
gderodaminaESTencapsuladospresentesenunvolumende500Lutilizadosenel
ensayodeinternalizacin.
*Concentracinobtenidaporredisolucindenanogelesliofilizadosenaguadestilada.
229
Captulo5Capitulo
temperaturaenelprocesodeinternalizacin,denuevosehatrabajadoa37Cy
4C.
EnlaFigura5.21(a)y(b)semuestraslasimagenesdecontrolobtenidasconuna
cantidad de rodaminaEST de 50 g, a las dos temperaturas, 4 C y 37 C
respectivamente. Como se puede observar, la internalizacin de rodaminaEST
libreesindependientedelatemperatura.
230
Captulo5
a) b)
CONTROL37CRODEST(50g) CONTROL4CRODEST(50g)
c) d)
PDF/NF127Ac2RODEST37C(50g) PDF/NF127Ac2RODEST4C(50g)
e) f)
PDF/NF127Ac8RODEST37C(50g) PDF/NF127Ac8RODEST4C(50g)
Figura5.21.Imgenesdemicroscopiaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaESTlibre:a)50g,37C,b)
50g,4C;EnsayosconrodaminaESTencapsulada:c)PDF/NF127Ac2RODESTa
37C,d)PDF/NF127Ac2RODESTa4C.c)PDF/NF127Ac8RODESTa37C,d)
PDF/NF127Ac8RODESTa4C.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadel
citoesqueleto,enrojo:rodaminaEST.Laescalacorrespondea20m.
231
Captulo5Capitulo
EnlaFigura5.22semuestranlosresultadosdeinternalizacinobservadospara
losensayosconnanogelesPDF/NF127Ac4RODEST, consuscorrespondientes
controles. A diferencia de lo observado con los otros dos tipos de nanogeles
ensayados se visualiza un aumento de la intensidad de fluorescencia a baja
temperatura, con respecto a los mismos ensayos realizados a 37 C. Estos
nanogeles,a4C,producenlaliberacindelarodaminaESTencapsuladaloque
permite la internalizacin de la molcula por procesos de difusin. Todava
queda por resolver la diferencia de comportamiento de estos nanogeles con
respectoalosotrosdos.
a) b)
CONTROL37CRODEST(25g) CONTROL4CRODEST(25g)
c) d)
PDF/NF127Ac4RODEST37C(25g) PDF/NF127Ac4RODEST4C(25g)
Figura5.22.Imgenesdemicroscopiaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaESTlibre:a)25g,37C,b)
25g,4C.EnsayosconrodaminaESTencapsulada:c)PDF/NF127Ac4RODESTa
37C,d)PDF/NF127Ac4RODESTa4C.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadel
citoesqueleto,enrojo:rodaminaEST.Laescalacorrespondea20m.
232
Captulo5
Tabla5.7.ResumendeensayosdeinternalizacinrealizadosenclulasHeLa.
Ensayodeinternalizacinpositivo:ensayoquepresentafluorescenciaenelinteriorde
lacluladebidaalapresenciadefluorforo(rodaminaBorodaminaEST),ensuforma
libreoencapsuladaenelnanogel.
233
Captulo5Capitulo
Losresultadosdeinternalizacinydeencapsulacindemolculaspermitirnel
usodelos nanogelescomosistemasdeencapsulacindefrmacoshidrfobos,
como la Camptotecina, frmaco con baja solubilidad en agua y elevada
citotoxicidad en su forma libre, activo contra la hepatitis. As mismo, se
comprobar la efectividad y toxicidad de los nanogeles cargados con
Camptotecina al producirse la internalizacin celular, en comparacin con el
frmacolibre.DichosexperimentosserealizarnencolaboracinconOlgaAbin
del Instituto Universitario de Investigacin de Biocomputacin y Fsica de
SistemasComplejos(BIFI),pertenecientealIACS.
234
CAPTULO6
PARTEEXPERIMENTAL
Captulo6
Enestecaptuloseincluyentodosaquellosaspectosrelacionadosconeltrabajo
experimentaldesarrolladoparaestatesisdoctoral.
Paraellosehanconsideradolossiguientesapartados:
Sntesisycaracterizacindeloscompuestos:
Apartado en el que se describen los procedimientos experimentales que han
permitido obtener los diferentes compuestos, as como los datos relativos a su
caracterizacinqumica.
Lanomenclaturaynumeracinqueidentificacadacompuestoeslautilizadaen
losesquemassintticosytextoincluidosenlosCaptulos3y4.
Protocolosdetrabajo:
Apartado en el que se recogen los diferentes procedimientos experimentales
puestos a punto, estandarizados y desarrollados para la preparacin o
caracterizacindelosdiferentesmateriales.
Materialesytcnicasexperimentales.
Apartadoenelqueseincluyenlosmateriales,tcnicasyequiposutilizadosenla
preparacinycaracterizacindelosdistintosmateriales.
237
Captulo6
6.1.SNTESISYCARACTERIZACINDELOSCOMPUESTOS
CompuestoF127Ac2[1]
DescritoporTirellietal.,MacromolecularChemistryandPhysics2002,203(10
11),14661472.(Referencia101c).
1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),3.373.82(m,~1100H,B,
C, D, E, F), 4.31 (m, 4H, G), 5.83 (dd, Jcis=10.4 Hz, Jgem=1.6 Hz, 2H, J), 6.15 (dd,
Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,2H,I),6.42(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.6Hz,2H,J).
13
CRMN (125 MHz, CDCl3): (ppm): 17.317.4 (A), 63.6 (G), 68.469.1 (F), 70.5
(D,E),72.973.3(C),75.175.375.5(B),128.2(I),130.9(J),166.1(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2882(CHst),1724(C=O),1114
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5201.1y13449.6.
239
Captulo6Capitulo
Compuesto[2]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).
Enunmatrazsedisuelvecido2,2bis(hidroximetil)propinico(10g,74.5mmol),
2,2dimetoxipropano (13.8 mL, 112 mmol) y cido ptoluensulfnico
monohidrato(0.7g,3.7mmol)en50mLdeacetonaseca.Lamezcladereaccin
se agita durante 2 horas en atmsfera de argn a temperatura ambiente.
Transcurridoestetiemposeadicionaalamezcladereaccin1mLdeunamezcla
amoniaco/etanol1.1(v/v).Acontinuacinseeliminaeldisolventeenrotavapory
elresiduoblancoseredisuelveen250mLdediclorometano.Lafaseorgnicase
extrae con 20 mL de agua (x2), se seca con MgSO4, se filtra y evapora a
sequedad.Elproductoseobtienecomounslidoblanco.10.3g.Rto.:79%.
1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.21(s,3H,D),1.42(s,3H,A),1.45(s,3H,
A),3.68(d,J=12Hz,2H,C),4.18(d,J=12Hz,2H,C).
13
CRMN(100MHz,CDCl3):(ppm):18.4(D),21.8(A),25.3(A),41.7(E),65.9(C,
C),98.3(B),180.0(F).
FTIR(cm1,KBr):3142(COOHst),29952891(CHst),1723(C=O).
MS(ESI+)paraC8H14O4,calculado:174.09,experimental:(M+Na+)196.9.
240
Captulo6
Compuesto[3]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).
Enunmatrazsedisuelvecido2,2bis(hidroximetil)propionico(18g,134mmol)
y KOH (8.6 g, 154 mmol) en 100 mL de dimetilformamida seca. La reaccin se
mantiene a 100 C durante una hora. Transcurrido este tiempo se adiciona
bromuro de bencilo (19 mL, 162 mmol). La mezcla de reaccin se mantiene
durante15horasa100C.Elcrudodereaccinseevaporaenelrotavaporyse
redisuelveen300mLdediclorometano.Acontinuacinseextraecon50mLde
agua(x2),sesecalafaseorgnicaconMgSO4,sefiltrayeldisolventeseevapora
en el rotavapor. El aceite amarillo obtenido se cristaliza en una mezcla
diclorometano/hexano1:1(v/v).Elproductoseobtienecomounslidoblanco.
Rto.:4354%.
1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.08(s,3H,A),3.74(d,J=12Hz,2H,C),3.94
(d,J=12Hz,2H,C),5.21(S,2H,E),7.36(M,5H,G,H,I).
13
CRMN(100MHz,CDCl3):(ppm):17.2(A),49.3(B),66.7(C,C),68.4(E),127.9
(G),128.4(I),128.7(H),175.8(D).
IR(cm1,nujol):3351.6(OH),2923.22853.2(CHst),1701.3(C=Ost).
MS(MALDI+)paraC12H16O4,calculado:224.2,experimental:(M+Na+)246.8.
241
Captulo6Capitulo
Compuesto[4]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).
Enunmatrazsedisuelven[2](10g,57.4mmol),[3](6.1g,27.4mmol)yDPTS
(3.2 g, 10.9 mmol) en 90 mL de diclorometano seco. La mezcla de reaccin se
enfra a 0 C y se purga con argn. A continuacin se aade
N,Ndicicliohexilcarbodimida(DCC)(14.3g,69.1mmol)previamentedisueltaen
diclorometano.Lamezcladereaccinsemantieneatemperaturaambienteyen
atmsfera de argn durante una noche. El precipitado de N,Ndiciclohexilurea
(DCU)formadosefiltrayelfiltradoseevaporaenelrotavaporparaobtenerun
aceite amarillo. El crudo se purifica por cromatografa en columna eluyendo
inicialmente con hexano e incrementando gradualmente la polaridad del
disolvente de elucin hasta hexano/acetato de etilo 60:40. El producto se
obtieneenformadeaceiteamarillentoviscoso.10.2g.Rto.:70%.
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.09(s,3H,D),1.30(s,3H,H),1.34(s,3H,A),
1.41(s,3H,A),3.58(d,J=12Hz,4H,C),4.11(d,J=12Hz,4H,C),4.34(s,4H,G),
5.16(s,2H,K),7.34(m,5H,M,N,O).
13
CRMN(100MHz,CDCl3):(ppm):17.6(H),18.4(D),22.2(A),24.9(A),42.0
(E),46.8(I),65.3(C,C),65.9(G),66.9(K),98.0(B),128.1(M),128.3(O),128.5
(N),135.4(L),172.3(J),173.4(F).
FTIR(cm1,puro):2991.42876.7(CHst),1737(C=Ost).
MS(MALDI+)paraC29H43O10,calculado:536.6,experimental:(M+Na+)559.2.
242
Captulo6
Compuesto[5]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).
Enunmatrazsedisuelve[4](4g,7.5mmol)en40mLdeacetatodeetiloyse
aadeun10%enpesodePd/C.Serealizan3ciclosvacoargnylamezclade
reaccin se deja en atmsfera de hidrgeno durante 4 horas a temperatura
ambiente. El crudo se filtra sobre Celite para eliminar el Pd/C. El producto se
obtienecomounslidoblancotraslaevaporacindeldisolvente.2.8g.Rto.:83
%.
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.15(s,3H,D),1.31(s,3H,H),1.35(s,3H,A),
1.41(s,3H,A),3.62(d,J=12Hz,4H,C),4.16(d,J=12Hz,4H,C),4.33(s,4H,G).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):3180(COOHst),29882884(CH
st),1731(C=O).
Compuesto[6]
DescritoporFrchetetal.,JACS2001,123(25),59085917.(Referencia62).
243
Captulo6Capitulo
1
HRMN (300 MHz, CDCl3): (ppm): 1.11 (s, 3H, G), 3.70 (d, J=11.7 Hz, 2H, F),
4.64(d,J=11.4Hz,2H,F),5.49(s,1H,E),7.37(m,3H,A,B),7.47(m,2H,C).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.7(G),42.1(H),73.4(F),101.9(E),126.2
(C),128.3(B),129.0(A),137.5(D),178.8(I).
FTIR(cm1,KBr):3005(OH),2865(CHst),1702(C=O).
MS(ESI+)paraC12H14O4,calculado:222.24,experimental:(M+Na+)245.
ANLISISELEMENTALparaC12H14O4,calculado:C,64.85;H,6.35.,experimental:
C,64.39;H,6.37.
Compuesto[7]
DescritoporFrchetetal.,JACS2001,123(25),59085917.(Referencia62).
Enunmatrazsedisuelve[6](15.5g.,69.7mmol)en100mLdediclorometano
seco. En otro matraz se disuelve DCC (8.05 g, 39 mmol) en 40 mL de
diclorometano seco. La disolucin de DCC se aade sobre la disolucin del
compuesto [6] y la mezcla de ambos se deja con agitacin a temperatura
ambientedurantetodalanoche.ElsubproductoDCUformadosefiltrayselava
con un pequeo volumen de diclorometano. El filtradoo se concentra en
rotavaporyseprecipitaen1Ldehexano.Traslafiltracinseobtiene[7]como
unslidoblanco.Rto.:8896%.
1
HRMN (300 MHz, CDCl3): (ppm): 1.12 (s, 6H, G), 3.69 (d, J=11.6 Hz, 4H, F),
4.66(d,J=11.7Hz,4H,F),5.47(s,2H,E),7.34(m,6H,A,B),7.45(m,4H,C).62
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):16.9(G),44.2(H),73.2(F,F),102.1(E),126.3
(C),128.2(B),129.1(A),137.6(D),169.1(I).
FTIR(cm1,KBr):2865(CHst),1816(C=Ostsim),1746(C=Ostas).
MS(MALDI+)paraC12H26O7,calculado:426.46,experimental:465.1(M+K+)
244
Captulo6
ANLISISELEMENTALparaC24H14O4,calculado:C,67.59;H,6.15.,experimental:
C,66.93;H,6.07.
CompuestoF127Bn2[8]
EnunmatrazsedisuelvePluronicF127previamenteseco(10.0g,0.79mmol),
en20mLdediclorometanoseco.SeaadeDMAP(0.12g,0.95mmol)sobrela
disolucin anterior y una vez disuelto este producto se aade [7] (2.0 g, 4.76
mmol). La mezcla de reaccin se mantiene a temperatura ambiente, bajo
atmsferadeargndurante48horashoras.Transcurridoesetiemposeaaden
6 mL de metanol, para la destruccin del anhdrido en exceso, y la mezcla se
mantienebajoagitacindurante6horas.Elcrudodereaccinseviertesobre1L
dedietilterfrio.Elslidoqueprecipitasedejadecantarduranteunanocheen
elfrigorfico,sefiltrayselavacondietilterfrio.Slidoblanco.Rto.:8899%
1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.04(s,6H,J),1.13(m,201H,A),3.373.82
(m,~1100H,B,C,D,E,F,I),4.35(m,4H,G),4.66(d,J=11.6Hz,4H,I),5.44(s,2H,
L),7.32(m,6H,P,Q),7.42(m,4H,N).
13
CRMN (100 MHz, CDCl3): (ppm): 17.3, 17.4 (A), 17.9 (J), 42.4 (K), 64.2 (G),
68.568.669.1(F),70.5(D,E),72.973.3(C,I,I),75.175.375.5(B),101.7(L),
126.2(N),128.2(Q),128.9(P),137.9(M),173.9(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2883(CHst),1737(C=O),1114
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5050.2y13297.2
ANLISIS ELEMENTAL para C621H1220O272, calculado: C, 57.29; H, 9.38.,
experimental:C,56.68;H,9.55.
245
Captulo6Capitulo
CompuestoF127OH4[9]
En un matraz se disuelven 9.5 g (0.73 mmol) de [8] en 200 mL de acetato de
etilo. Una vez disuelto se aade un 10 % en peso de Pd/C. A continuacin se
realizan 3 ciclos vacoargn y se deja la mezcla de reaccin bajo atmsfera de
hidrgeno durante toda la noche. El Pd se filtra sobre Celite y el filtrado se
evaporaasequedadparaobtenerunslidoblanco.Rto.:96%.
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.11(s,6H,J),1.13(m,201H,A),3.373.82
(m,~1100H,B,C,D,E,F,I),4.34(m,4H,G).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.1(J),17.317.4(A),49.5(K),63.2(G),67.3
(I),68.7(F),70.5(D,E),72.973.3(C),75.175.375.5(B),175.6(H).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 3482 (OH), 2884 (CH st), 1728
(C=O),1112(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5213.9y13780.1.
ANLISIS ELEMENTAL para C607H1212O272, calculado: C, 56.42; H, 9.44.,
experimental:C,56.04;H,9.98.
CompuestoF127Bn4[10]
246
Captulo6
paraladestruccindelanhdridoenexceso,ylamezclaseagitadurante7horas.
El crudo de reaccin se vierte sobre 500 mL de dietil ter fro. El precipitado
formadosefiltraylavacondietilterfroparaobtener[10].Slidoblanco.Rto.:
7194%
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):0.93(s,12H,N),1.13(m,201H,A),1.24(s,
6H,J),3.373.82(m,~1100H,B,C,D,E,F,L),4.11(m,4H,G),4.37(s,8H,I),4.56
(d,J=11.5Hz,8H,L),5.40(s,4H,P),7.28(m,12H,S,T),7.38(m,8H,R).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.317.4(A),17.6(N),17.7(J),42.5(K),46.7
(M),64.1(G),65.4(I),68.468.6(F),70.5(D,E),72.973.3(C,L,L),75.175.3
75.5(B),101.6(P),126.1(R),128.0(T),128.8(S),137.7(Q),173.1(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2883(CHst),1741(C=O),1113
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5615.9y13844.4.
ANLISIS ELEMENTAL para C655H1260O284, calculado: C, 57.59; H, 9.23.,
experimental:C,56.89;H,9.74.
CompuestoF127OH8[11]
Enunmatrazsedisuelve[10](2.8g,0.21mmol)en100mLdeacetatodeetilo.
Unavezdisueltoseaadeun10%enpesodePd/C.Acontinuacinserealizan3
ciclos vacioargn y se deja la reaccin bajo atmsfera de hidrgeno durante
toda la noche. El Pd se filtra sobre Celite y el filtrado se evapora a sequedad
paraobtenerunslidoblanco.Rto.:96%Cuantitativo.
247
Captulo6Capitulo
1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.05(s,12H,N),1.13(m,201H,A),1.28(s,
6H,J),3.373.79(m,~1100H,B,C,D,E,F,L),4.264.38(IIq,8H,II=35Hz,JII=
11.2Hz,I,I),4.26(m,4H,G).
13
CRMN (100 MHz, CDCl3): (ppm): 17.1 (N), 17.3 17.4 (A), 17.9 (J), 46.4 (K),
49.7(M),64.3(I),64.9(G),67.367.4(L),68.568.8(F),70.5(D,E),72.973.3(C),
75.175.375.5(B),172.9(H),174.9(H).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 3457 (OH), 2884 (CH st), 1733
(C=O),1113(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5286.1y13693.8.
ANLISIS ELEMENTAL para C627H1244O284, calculado: C, 56.59; H, 9.36.,
experimental:C,56.17;H,9.98.
CompuestoF127Ac4[12]
Enunmatrazsedisuelve[9](2.0g,0.16mmol)en20mLdediclorometanoseco.
Se aade trietilamina (0.39 mL, 2.76 mmol) y 4metoxifenol (200 mg) como
inhibidor de la polimerizacin. Se realizan en la mezcla de reaccin tres ciclos
vacoargn y a continuacin la mezcla se enfra con hielo. Trancurridos 10
minutos se aade cloruro de acriloilo (0.22 mL, 2.66 mmol), gota a gota, con
agitacinylamezcladereaccinsedejabajoatmsferadeargnyenoscuridad
durante 48 horas. El crudo de reaccin se filtra a travs de una columna de
almina neutra para eliminarel subproducto formado, y el filtrado sesecacon
Na2CO3anhidrodurante2horas.Transcurridoestetiemposefiltrayelfiltradose
concentraenrotavapor.Acontinuacin,elconcentradoseprecipitaen300mL
dedietilterfro.Elproductoseobtienecomounslidoblancotraslafiltracin.
Rto.:4578%
248
Captulo6
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.30(s,6H,J),3.373.82
(m,~1100H,B,C,D,E,F),4.34(IIq,8H,II=7.6Hz,JII=11.2Hz,I,I),4.27(m,4H,
G),5.85(dd,Jcis=10.4Hz,Jgem=1.3Hz,4H,N),6.10(dd,Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,
4H,M),6.39(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.3Hz,4H,N).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.317.4(A),17.7(J),46.3(K),65.4(I),68.7
(G), 70.5 (D, E, F), 72.9 73.3 (C), 75.1 75.3 75.5 (B), 127.8 (M), 131.2 (N, N),
165.4(L),172.5(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2869(CHst),1733(C=O),1110
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5920.3y13255.4.
ANLISIS ELEMENTAL para C619H1220O276, calculado: C, 56.93; H, 9.35.,
experimental:C,56.52;H,9.73.
CompuestoF127Ac8[13]
249
Captulo6Capitulo
rotavaporysepurificaporprecipitacinen250mLdedietilterfro.Elproducto
seobtienetrasfiltracincomounslidoblanco.Rto.:4782%.
1
HRMN (300 MHz, CDCl3): (ppm): 1.13 (m, 201H, A), 1.23 (s, 6H, J), 1.27 (s,
12H,N),3.373.87(m,~1100H,B,C,D,E,F),4.234.30(m,28H,G,I,L),5.85(dd,
Jcis=10.4Hz,Jgem=1.3Hz,4H,Q),6.10(dd,Jtrans=17.3Hz,Jcis=10.4Hz,4H,R),6.39
(dd,Jtrans=17.3Hz,Jgem=1.3Hz,4H,Q).
13
CRMN(125MHz,CDCl3):(ppm):17.317.4(A),17.7(J,N),45.8(K),46.5(M),
64.9(G),65.365.6(I,L),68.568.7(F),70.5(D,E),72.973.3(C),75.175.375.5
(B),127.7(Q),131.5(R),165.4(P),171.9172.0(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2867(CHst),1733(C=O),1109
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5761.4y14176.6.
ANLISIS ELEMENTAL para C651H1260O292, calculado: C, 56.90; H, 9.18.,
experimental:C,56.48;H,9.66.
CompuestoF127PN2[14]
DescritoporParketal.Langmuir2006,22(4),17581762.
ProcedimientoexperimentalconcondicionesdereaccinB
250
Captulo6
Elproductoseobtienetrasfiltracinylavadocondietilterfrocomounslido
blanco.Rto.:7585%.
ProcedimientoexperimentalconcondicionesdereaccinD
1
HRMN(300MHz,CDCl3)(ppm):1.13(m,201H,A),3.373.85(m,~1000H,B,
C,D,E,F),4.414.44(m,4H,G),7.38(m,4H,J),8.26(m,4H,K).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),68.4(G),68.7(F),70.7(D,E),
72.973.5(C),75.275.475.6(B),121.8(J),125.4(K),145.5(L),152.5(H),155.6
(I).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1769 (C=O st
carbonato),1520(NO2stas),1200(COstascarbonato),1110(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z4999.3y12842.8.
ANLISISELEMENTALparaC611H1202N2O274,calculado:C,56.63;N,0.22;H,9.28.,
experimental:C,56.12;N,0.11;H,8.64.
251
Captulo6Capitulo
CompuestoF127SH2[15]
DescritoporParketal.,Langmuir2006,22(14),63806384.
MtododesntesisE
Enunmatrazsedisuelve[14](0.5g,0.041mmol)en25mLdeaguadestilada.A
continuacinseaadedihidroclorurode2,2diaminoetildisulfuro(cistamina)y
0.5 mL de TEA. La mezcla de reaccin se mantiene a temperatura ambiente y
atmsferadeargndurantetodalanoche.Acontinuacinelcrudodereaccin
se dializa con membrana (Spectra/Por Dyalisis membrane MWCO 3500,
Spectrum)hastaladesaparicindelatonalidadamarillentadelsubproductode
reaccin pnitrofenol (7 das). Una vez eliminado el subproducto se aade al
dializado 148 mg de D,L ditiotreitol (DTT) como agente reductor y se deja
reaccionardurante6horasenatmsferadeargn.Elcrudosedializadurante3
dasutilizandobufferdecitratoapH=4paralaeliminacindelagentereductor.
Elproductoseobtienetrasliofilizacindeldializado.
MtododesntesisF
Enunmatrazdedisuelve[14](2g,0.16mmol)en30mLdediclorometanoseco.
A continuacin se aade cisteamina (24 mg, 0.32 mmol) bajo atmsfera de
argn.Lamezcladereaccinsemantieneatemperaturaambienteconagitacin
durantetodalanoche.Elcrudodereaccinseprecipitaen200mLdedietilter
fro, se filtra y se lava con dietil ter fro para eliminar el subproducto p
nitrofenol.Elproductoseobtienecomounslidoamarillo.Rto.:9196%.
1
HRMN(500MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),2.79(t,4H,J),3.373.77
(m,~1000H,B,C,D,E,F,I),4.20(m,4H,G).
13
CRMN (125 MHz, CDCl3): (ppm): 17.4 17.5 (A), 38.2 (J), 39.9 (I), 64.2 (G),
68.668.769.7(F),70.7(D,E),72.973.5(C),75.275.475.6(B).
252
Captulo6
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1732 (C=O
carbamato),1525(NO2stas),1108(C_O_C).
MS(MALDI+):mximoam/z4849.7.
ANLISIS ELEMENTAL para C603H1206N2O268S2, calculado: C, 56.50; N, 0.22; H,
9.42,S,0.50.,experimental:C,55.83;N,0.11;H,8.64,S,0.76.
CompuestoF127PN4[16]
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.38(s,6H,J),3.373.85
(m,~1000H,B,C,D,E,F),4.34(m,4H,G),4.52(ABq,8H,AB=31.8Hz,JAB=9Hz,
I,I),7.37(m,8H,M),8.26(m,8H,O).
13
CRMN (75 MHz, CDCl3): (ppm): 17.4 17.5 (A), 17.7 (J), 46.5 (K), 64.5 (G),
68.668.769.2(F),70.7(D,E,I,I),72.973.5(C),75.275.475.6(B),121.7(M),
125.3(O),145.5(P),152.1(L),155.2(N),171.5(H).
253
Captulo6Capitulo
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1772 (C=O st
carbonato),1732(C=Oester),1527(NO2 stas),1212(COstascarbonato),1113
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5340.8y13561.3.
ANLISISELEMENTALparaC635H1224N4O288,calculado:C,54.65;N,0.40;H,8.78.,
experimental:C,56.10;N,0.35;H,9.02.
CompuestoF127SH4[17]
1
HRMN(500MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.23(s,6H,J),2.792.95
(m,8H,N),3.373.76(m,~1000H,B,C,D,E,F,M),4.27(m,12H,I,G).
13
CRMN(125MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),18.3(J),38.5(N),41.8(M),
64.2(I),67.4(G),68.668.769.0(F),70.7(D,E),72.973.5(C),75.275.4 75.6
(B),156.2(L).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2880 (CH st), 1733 (C=O st
carbamato,C=Oester),1112(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5184.5y13217.4.
ANLISIS ELEMENTAL para C619H1232N4O276S4, calculado: C, 56.08; N, 0.42; H,
9.30,S,0.97.,experimental:C,55.59;N,0.14;H,8.97,S,1.29.
254
Captulo6
CompuestoF127PN8[18]
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.34(s,6H,J),1.37(s,12H,
N),3.373.85(m,~1000H,B,C,D,E,F),4.27(m,4H,G),4.45(m,24H,I,L),7.37
(m,16H,R),8.26(m,16H,S).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),17.7(J,M),46.6(K,M),65.8
(G),69.1(F),70.7(D,E,I),72.973.5(C),75.275.475.6(B),121.7(R),125.3(S),
145.6(T),152.0(P),155.2(Q),171.05(H,H).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1771 (C=O st
carbonato), 1736 (C=O st ester), 1526 (NO2 st as), 1212 (CO st as carbonato),
1008(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5871.7y14635.1.
ANLISISELEMENTALparaC683H1268N8O316,calculado:C,56.07;N,0.77;H,8.67.,
experimental:C,55.62;N,0.67;H,7.66.
255
Captulo6Capitulo
CompuestoPEGAc2[19]
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):3.64(s,180H,A),3.74(t,4H,B),4.31(t,4H,
C),5.83(dd,Jcis=10.2Hz,Jgem=1.5Hz,2H,F),6.15(dd,Jtrans=17.1Hz,Jcis=10.2Hz,
2H,E),6.42(dd,Jtrans=17.1Hz,Jgem=1.5Hz,4H,F).
CompuestoF127NH(CH2)6OH2[20]
Enunmatrazdedisuelve[14](2.5g,0.2mmol)en15mLdediclorometanoseco.
Acontinuacinseaade6amino1hexanol(50mg,0.43mmol)bajoatmsfera
de argn. La mezcla de reaccin se mantiene a temperatura ambiente con
agitacindurantetodalanoche.Elcrudodereaccinseprecipitaen200mLde
dietil ter fro, se filtra y se lava con dietil ter fro para eliminar pnitrofenol
256
Captulo6
formadocomosubproducto.Elproductoseobtienecomounslidoblanco.1.8
g.Rto.:70%.
1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.34(m,8H,K,L),1.53(m,
8H,J,M),3.16(q,4H,I),3.373.77(m,~1000H,B,C,D,E,N),3.87(m,4H,F),4.20
(m,4H,G).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),25.3(L),26.3(J),29.9(K),32.5
(M), 40.9 (I), 62.6 (G), 63.8 (N), 68.6 (F), 70.7 (D, E), 72.9 73.5 (C), 75.2 75.4
75.6(B),156.4(H).
FTIR(cm1,neto,ATR):2867(CHst),1726(C=Ocarbamato),1108(C_O_C).
CompuestoF127NHAc2[21]
1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.37(m,8H,K,L),1.52(m,
4H,J),1.67(m,4H,M),3.16(q,4H,I),3.373.77(m,~1000H,B,C,D,E),3.81(m,
4H, F), 4.20 (m, 4H, G), 5.81 (dd, Jcis=10.4 Hz, Jgem=1.6 Hz, 2H, F), 6.10 (dd,
Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,2H,E),6.39(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.6Hz,4H,F).
257
Captulo6Capitulo
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),25.6(L),26.3K),28.5(K),29.8
(M), 40.9 (I), 64.4 (N), 66.9 (G), 68.6 (F), 70.7 (D, E), 72.9 73.5 (C), 75.2 75.4
75.6(B),128.6(Q),130.5(R),156.4(H),166.2(P).
FTIR(cm1,ATR):2867(CHst),1728(C=O),(1108(C_O_C).
258
Captulo6
6.2.PROTOCOLOSDETRABAJO
Lasdisolucionespreparadasalasdistintasconcentraciones16.5%,18%,20%,
23%y25%(w/v)enPBS10mMpH7.4,semantuvieronduranteunanochea4
Cyenoscuridadparaasegurarlacompletadisolucindelpolmero.
100Ldedisolucinaestudiosedispusieronenunvialde2mL.
lamuestrasecalentconunbloquecalefactoraunavelocidadde1C/mincon
el fin de producir la transicin solgel. Se consider como temperatura de
transicin de fase (LCST) la temperatura a la cual, tras inversin del vial, no se
observaflujodelamuestradurante10segundos.
unavezalcanzadoelestadogelsecontinucalentandoalamismavelocidadel
gelfsicohastaconseguirlatransicindegeladisolucin(transicingelsol).
b.ProtocolodeestudiodegelificacinmedianteDSC
c.Protocolodepreparacindeloshidrogelesfotopolimerizados
Elpolmerofotopolimerizable(F127Ac2,F127Ac4oF127Ac8)sedisolvien
PBS10mM(pH7.4)con0.1%enpesodefotoiniciadorIrgacure2959(I2959),a
dosconcentracionesdiferentesdelpolmero:18%(w/v)y23%(w/v).
La disolucin se mantuvo una noche a 4 C y en oscuridad para su completa
disolucin.
259
Captulo6Capitulo
d.ProtocolodecaracterizacindelosmaterialesporSEM
ParallevaracaboelestudioporSEMdeloshidrogelesfotopolimerizados,stos
fueron incubados en 2 mL de PBS 10 mM pH 7.4 a 37 C durante 3 das para
conseguirelestadodeequilibrio.
Loshidrogelesequilibradosseintrodujeronennitrgenolquido,sefracturaron
y se liofilizaron durante una noche. La congelacin con nitrgeno lquido y la
posterior fractura en fro, permite que la morfologa interna del hidrogel no se
veaalteradaenelprocesodefractura.
Las muestras se fijaron en cinta de carbono y se recubrieron con oro para su
observacinporSEM.
e.Protocolodeestudiodedegradacindeloshidrogeles
260
Captulo6
f.Protocolodeensayosdeviabilidadcelularenhidrogeles
Preparacindelasclulas:LasclulasMSChumanasutilizadasenlosensayos
fueron cultivadas en medio de cultivo alfaMEM (Minimum Essential Medium)
con FGF (Fibroblast Growth Factor) y un 10 % de FBS (Fetal Bovine Serum). El
mediosecambicada34dasylasclulasfuerontripsinizadas,conelfinde
separarlasclulasdesusoporte,cuandosealcanzun80%deconfluencia.
Preparacindelasdisolucionesdepolmero:
el polmero en estado slido se esteriliz previamente exponindolo a
luzUVdurante1hora.
A continuacin los polmeros esterilizados se disolvieron en la
concentracin correspondiente, en medio de cultivo DMEM (Dulbeccos
Modified Eagles Medium), que contena 0.1 % (w/v) de fotoiniciador
I2959 o sin fotoiniciador en el caso de ensayos sin fotopolimerizar,
manteniendo la muestra durante una noche a 4 C. El medio de cultivo
conosinfotoiniciadorseesterilizpreviamenteporfiltracinatravsde
unfiltrode0.22m.
Ensayosdeviabilidad:
Todos los ensayos tanto en entorno 2D como en 3D se han realizado por
triplicado.
preparacindemuestras2D:enunaplacade96pocillossesembraron
10000clulasencadapocillo,secubrieroncon100Ldeladisolucinde
polmeroyseincubarondurante5minutosa37Chastalaformacindel
hidrogelfsico.
Una vez formado el hidrogel fsico, en el caso de los ensayos sin
fotopolimerizar, o tras la fotopolimerizacin, en el caso de los ensayos
con geles fotopolimerizados, se aadieron 100 L de medio de cultivo
fresco (DMEM con 20 % de FBS) para mantener las condiciones usuales
decultivocelular.
Paralarealizacindelosensayoscelularesconelpolmeroendisolucin
se prepar una muestra del polmero del doble de la concentracin
261
Captulo6Capitulo
necesariaparaelensayodisueltaenDMEM.Acontinuacinladisolucin
del polmero se diluy a la mitad (concentracin del ensayo) utilizando
DMEMcon20%deFBS,ysedejdisolvera4Cdurante1hora.
200Ldeladisolucinresultanteseadicionaronalospocillossobreuna
capa de clulas para la determinacin de la viabilidad celular en
disolucin.
preparacin de muestras 3D: las clulas se dispersaron en las
disoluciones de polmero a una densidad final de 1x105 clulas/mL. 100
Ldelasdisolucionesdepolmeroconclulassetransfirieronaunaplaca
de 96 pocillos (10000 clulas por pocillo), y se incubaron durante 5
minutosa37Chastalaformacindelhidrogelfsico.
Una vez formado el hidrogel fsico, en el caso de los ensayos sin
fotopolimerizar, o tras la fotopolimerizacin en el caso de los ensayos
fotopolimerizados se aadi 100 L de medio de cultivo fresco (DMEM
con 20 % de FBS) a cada pocillo, tras la formacin del hidrogel, para
mantenerlascondicioneshabitualesparaelcultivocelular.
Procesodefotopolimerizacin:
loshidrogelesconclulasenentorno2Do3Dseincubandurante5min
a37Chastalaproduccindelgelfsico.
elgelseexponearadiacinultravioleta(365nm)durante10minutos,
conunadistanciadelalmparaalamuestrade8cm.
Clculodeviabilidadcelular:
Loshidrogelesconclulassecultivarona37Cy5%deCO2durante24,
4872horas.
Transcurridosestostiempos,lasclulassetieronconCalceinAMycon
Ethidiumhomodimer.Pararealizarlatincinseadicionencadapocillo
50Ldeunadisolucindelasiguientecomposicin:1LdeCalceinAM+
1ldeEthidiumhomodimer+660LdeDMEM.
262
Captulo6
100
Viabilidadcelular(%)
80
60 24HORAS
40 48HORAS
72HORAS
20
0
CONTROL
Concentracin(%enpeso)
Figura6.1.Viabilidadcelulardelensayodecontrol.
263
Captulo6Capitulo
Marcajedelasclulasenhidrogelesparaobservacinpormicroscopiaconfocal:
Loshidrogelesconclulassecultivarona37Cy5%deCO2durante24
horas.Acontinuacin,lasclulassetieroncon50Ldeunadisolucin
de Calcein AM (1L Calcein AM en 660 L de DMEM). Las placas con
tincinseincubarondurante30minutosa37Cy5%deCO2.Unavez
transcurridoesetiemposeadicionaron5LdeDAPIdirectamenteenel
pocilloylasmuestrassevolvieronaincubardurante30minutosa37Cy
5%deCO2.Lasclulassevisualizaronconmicroscopiaconfocal.
g.Protocolodecaracterizacinmecnicadeloshidrogeles
Loshidrogelessefotopolimerizarondelaformadescritaenelapartado6.2.c.
Unavezobtenidoslosgelesfotopolimerizadosfueronalmacenadosa37Cen
PBS10mMpH=7.4hastasuensayo(nuncamsde4horas).
Losdatosexperimentalesobtenidosencadaensayoseanalizaronmedianteel
uso de un ejecutable en el programa MatLab, a partir del cual se gener la
curva de tensindeformacin (), de la que se obtuvieron diferentes
parmetros mecnicos en funcin del mtodo utilizado (monotnico o carga
relajacin)ydeltipodeensayoencondicionesNCoCC.
Losvaloresdelosdistintosparmetrosmecnicossemuestrancomolamedia
de los valores obtenidos con 6 probetas ensayadas, con su correspondiente
error.
Paralarealizacindelosensayosdefatigasehanutilizadocmarasdeensayo
(Figura 6.2) que permiten mantener los hidrogeles fotopolimerizados entre los
dosmbolosmetlicos,sumergidosenPBS10mMpH7.4a37C,utilizandoun
baotermostatizadoexterno(Figura6.3).Paraevitarlaaparicindehongosse
adicion al PBS un 1% v/v de una mezcla de antibiticos
(Penicilina/Estreptomicina)yun0.5%v/vdeFungizona.
264
Captulo6
Figura6.2.Detalledelascmarasdeensayoutilizadasparalosensayosdefatiga.
Figura6.3.Detalledelascmarasdeensayoutilizadasparalosensayosdefatigaconel
baotermostatizadoexterno.
h.ProtocolodedeterminacindelaCMC
Lasdisolucionesdeloscopolmerosbloquelinealydendrticolinealdendrtico
demayorconcentracin(1,0.5,0.3y0.1%(w/v))seprepararonpordisolucin
directa de los materiales en agua destilada. Las disoluciones de menor
concentracin (0.05, 0.01, 0.001, 0.0001 % (w/v)) se prepararon por dilucin a
partir de una disolucin de mayor concentracin. Todas las disoluciones se
mantuvierondurante4horasa4C.
Paralapreparacindeladisolucindepirenosedisolvieron0.485mgdepireno
en200mLdeagua(1.2x105M).Paragarantizarunacompletadisolucindeste
ydadasubajasolubilidadenagua,elpirenosedisolvipreviamenteenacetona,
265
Captulo6Capitulo
yestadisolucinseadicionsobre200mLdeaguadestilada.Acontinuacinla
acetonaseevapordurante4horasavaco.
Sobrelasdisolucionesacuosasdelosdiferentescopolmerosseadicionaron10
Ldeladisolucindepireno(1.2x105M)paraconseguirunaconcentracinfinal
de pireno de 6x108 M. Las disoluciones se incubaron durante 1 hora a
temperaturaambienteyenoscuridad.
Elespectrodeexcitacindelasdiferentesmuestrasconpirenosemidienel
intervalode300a350nmconemisin=390nm.Deestosespectrossetrabajcon
elvalordelaintensidad,a332nm(I332)ya335nm(I335),paracadaunadelas
concentracionesdematerialpreparadas.
i.Protocolodepreparacindenanogelesfotopolimerizados
Sepreparunadisolucinal10%(w/v)delcopolmeroenaguadestilada,que
contenaun0.1%(w/v)defotoiniciadorIrgacure2959previamentedisuelto.Esta
disolucinsemantuvoduranteunanochea4Cparasucompletadisolucin.
Estadisolucinal10%(w/v)sefiltrutilizandounfiltrode0.2mdeacetatode
celulosaparaeliminarposiblespartculasensuspensin.
A partir de esta disolucin del 10% (w/v) se prepararon disoluciones de
concentracin0.77%(w/v),utilizandoparasudilucinunadisolucinacuosacon
un0.1%(w/v)defotoiniciadorI2959previamentefiltradaconfiltrode0.2m.
Las disoluciones precursoras al 0.77% (w/v) se equilibraron durante 1 hora a
temperaturaambiente,paraconseguirelestadodeequilibrio.
5 mL de las disoluciones precursoras con el copolmero reactivo se
fotopolimerizaron en un recipiente de vidrio cilndrico de 6 cm de dimetro,
irradiandoconluzultravioleta(365nm)durante10minutosaunadistanciade8
cmdelalmparaalamuestra.
Lafotopolimerizacinsellevacaboa25C.Paramantenerlatemperaturade
fotopolimerizacin constante se utiliz una placa calefactora, sobre la cual se
colocelmoldecilndricodevidrio.
266
Captulo6
j.ProtocolodecaracterizacinporTEMySEMdenanogelesfotopolimerizados
ParalapreparacindemuestrasdeTEM,seadicionaunagotadeladisolucin
acuosa de los nanogeles sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono. El
exceso de muestra se seca con papel de filtro y la rejilla se deja secar a
temperaturaambiente.
Para la preparacin de muestras de SEM, se adiciona una gota de disolucin
acuosadenanogelessobreuncubreredondodevidriode12mmdedimetro.
Lamuestrasedejasecaratemperaturaambienteyunavezsecaserecubrecon
oro.
k.Protocolodeencapsulacinennanogeles
EncapsulacinderodaminaB
267
Captulo6Capitulo
Encapsulacindepireno
Sepreparunadisolucindepirenodeconcentracin0.15mg/mlenacetona.
Esta disolucin se adicion sobre la disolucin de cada uno de los nanogeles,
PDF/NF127Acn(n=2,4y8).Lacantidaddepirenoadicionadaconrespectoala
cantidaddenanogelesfue0.15mgdepireno/mgdenanogel.
A continuacin la mezcla de ambas disoluciones se incub a temperatura
ambientedurante24horas.
La acetona se evapor con agitacin orbital, produciendo la precipitacin del
pirenonoencapsuladoenladisolucinacuosadenanogeles.
La disolucin acuosa de nanogeles cargados con pireno y pireno no
encapsuladoenformadeprecipitadosefiltratravsdefiltrosdeteflnde0.45
m.Elfiltroselavconacetonaparalarecuperacindelpirenonoencapsulado
ysucuantificacin.
268
Captulo6
Elpirenonoencapsuladoprecipitadosecuantificporfluorescencia,utilizando
elespectrodeexcitacin(maxenacetona=332.5nm).Paralarealizacindelacurva
de calibrado del pireno se utilizaron disoluciones de pireno en acetona en el
rangodeconcentraciones13.4268g/ml.Lacantidaddepirenoencapsuladose
calcul de forma indirecta como la diferencia entre la cantidad de pireno
adicionada inicialmente y la cantidad de pireno no encapsulado en forma de
precipitado.
6.3.l.Protocolodeensayoscelularesconnanogeles
Preparacindelasclulas:LasclulasHeLasecultivaronenDMEMhighglucose
(4.5g/l),4mMdeLglutamina,10%deFBS,1%dePenicilina/Estreptomicinay
1%deAnfotericinaBylasclulasMSCderatnsecultivaronenDMEMF12(3g/l
deglucosa)2mMdeLglutamina,10%deFBS,1%dePenicilina/Estreptomicinay
1%deAnfotericinaB.Lasclulassemantuvierona37C,con21%O2y5%CO2
paraHeLay3%O2y5%CO2paraMSC.Cuandolasclulasalcanzaronun8090%
deconfluenciaselavaronconDPBS(DulbbeccosPhosphateBufferedSaline),se
aadisolucindetripsinaal1%yseincubarondurante5minutosa37C,para
permitir la rotura de las protenas que producen la adhesin de las clulas al
recipiente de cultivo. La accin de la tripsina se detuvo aadiendo medio de
cultivofresco.
Preparacin de las disoluciones de nanogeles: En el caso de los nanogeles
PDF/F127Ac2,trassuliofilizacin,seredisolvieronalaconcentracindeseada
directamente en DMEM high glucose para ensayos con HeLa y en DMEM F12
paraensayosconMSC.ParalosnanogelesPDF/NF127Ac4yPDF/NF127Ac8,
disueltosenaguadestilada,laconcentracinseajustporadicindemediode
cultivo DMEM high glucose para ensayos con HeLa y con DMEM F12 para
ensayos con MSC. Previo al ajuste de la concentracin, las disoluciones de
nanogeles de PDF/NF127Ac4 y PDF/NF127Ac8 en agua destilada una vez
fotopolimerizadasydializadassefiltraronconfiltrosde0.22mparaesterilizar.
Todas las manipulaciones de redisolucin, filtrado o ajuste de la concentracin
269
Captulo6Capitulo
poradicindemediodecultivoserealizaronencampanadeflujolaminarpara
garantizarlascondicionesdeesterilidad.
Ensayosdeviabilidad:LasclulasHeLaoMSCsesembraronaunadensidadde
10000 clulas por pocillo, utilizando placas de 96 pocillos. Tras 24 horas de
incubacinseretirelmediodecultivoyseaadieron100Ldedisolucinde
nanogeles de la concentracin deseada. Todos los ensayos se realizaron por
triplicado.
Elmediodecultivoconnanogelesseretirtras24,48o72horasdeincubaciny
se aadi medio de cultivo fresco. A continuacin se aadi una disolucin de
AlamarBlue,enunacantidaddel10%delvolumendemediopresenteencada
pocillo. Tras 2 horas de incubacin a 37 C, la fluorescencia se ley a 530/590
(excitacin/emisin)enunlectordeplacas.Laviabilidadcelularseexprescomo
la viabilidad de clulas relativa al control (% comparado con las clulas control
incubadassloconmediodecultivo).
Ensayosdeinternalizacin:
LasclulasHeLasesembraronaunadensidad40000clulasporpocillo,
sobreportasde12mmdispuestosenelfondodelospocillosdeplacasde
cultivode24pocillos.
Para la incubacin con los nanogeles cargados con rodamina B o
rodaminaEST se adicion disolucin de nanogel con rodamina B o
rodaminaEST disuelto en agua destilada, cuya concentracin se ajust
previamenteporadicindemediodecultivoDMEMhighglucose,siendo
elvolumenfinaldelensayode500L.Lasclulasseincubarondurante4
horasa37Coa4C.
Transcurrido ese tiempo, se retir el medio de cultivo con nanogel
cargadoconrodaminaylasclulasselavaron3vecesconPBS.
La fijacin de las clulas se realiz por adicin de 300 L de
formaldehido al 4% e incubacin durante 20 minutos a temperatura
ambiente.
Acontinuacinlasclulasselavarondurante5minutosconPBS(x2).
270
Captulo6
Pararealizarelmarcajedelaactinadelasclulasseutilizelfluorforo
verdeAlexafluor488.Elportaconlasclulassedispusosobreunagota
de 40 L de Alexa fluor y se incub durante 1 hora a temperatura
ambiente.Lasclulasselavarondurante5minutosconPBSBS(PBS+1%
BSA(BovineSerumAlbumin)+0.1%Saponina),PBSB(PBS+1%BSA)yagua
destilada.
Los cubres se secaron con papel de filtro. Para realizar el marcaje del
ncleo de las clulas se aadi sobre el cubre 5 L de DAPIMowiol. El
cubresetapconunporta,sesellconlacadeuastransparenteytras
su secado se almacen a 4 C en oscuridad hasta observacin por
microscopiaconfocal.
6.3.MATERIALESYTCNICAS
271
Captulo6Capitulo
Las clulas MSC de ratn (bone marrow of C57BL/6 mouse at 8 weeks after
gestation)fueronsumistradasporGibco.
Elanlisiselementaldeloscompuestosseharealizadoenunmicroanalizador
Perkin Elmer CHN 2400, equipo perteneciente al Servicio de Anlisis Elemental
delCEQMA.
LostermogramasdeDSCsehanrealizadoenelequipoQ20V24.10Build122de
TA Instruments, utilizando cpsulas de aluminio para la preparacin de las
muestras.EquipodelServiciodeCalorimetradelCEQMA.
LasmuestrasdeSEMsehanobservadoenunequipoInspectF50perteneciente
alLaboratoriodeMicroscopiasAvanzadas(LMA)delInstitutodeNanocienciade
Aragn(INA).
272
Captulo6
Las medidas de TEM han sido realizadas en un microscopio TECNAI G20 (FEI
COMPANY), 200 kV, perteneciente al LMA del INA. Las muestras fueron
preparadasenrejillasholleycarbonfilm300MeshCu(50)deAgarScientific.
LasmedidasdeGPCsehanrealizadosobremuestrasdeconcentracin1mg/ml
utilizando un equipo Waters e2695 Alliance equipado con un detector de
dispersin de luz, columnas Styragel HR1 de Waters o PLgel 5m MIXEDC de
AgilentTechnologies.LasmedidassehanrealizadoconTHF(gradoHPLC)como
disolvente,conunflujode1ml/min.Paraelcalibradosehanutilizadopatrones
depoliestireno.
LaliofilizacinserealizenunliofilizadorCryodos50deTelstarperteneciente
alINA.
273
Captulo6Capitulo
LafluorescenciaenelmtodoAlamarBluesedeterminconunlectordeplacas
Synergy HT de Biotek perteneciente a la Unidad de Investigacin Translacional
(UIT)delHospitalMiguelServet,IACS.
274
CAPTULO7
CONCLUSIONES
Captulo7
LoscopolmeroscongruposterminalesCOCH=CH2soncompuestosadecuados
para la preparacin de nanogeles, va procesos de fotopolimerizacin,
obteniendo nanopartculas con tamaos entre 50 y 100 nm a 37 C, y
viabilidadescelularesinvitro(clulasHeLa)superioresal50%alas72horas.
Estosnanogelessontermosensiblesypuedencargarseconmolculashidrfilas
e hidrfobas, as como producir su transporte e internalizacin en medios
celularesinvitro(clulasHeLa),loquepermitepensarensuposibleaplicacin
comosistemasdeTransporteyLiberacincontroladadefrmacos.
277
ANEXOS
ANEXOS
281
ANEXOS
ANEXOI.CARACTERIZACINESTRCUTURAL
FiguraI.1.EspectrodeHSQCparalamolculaF127Ac8ENCDCl3,500MHz.
FiguraI.2.EspectrodeHMBCparalamolculaF127Ac8enCDCl3,500MHz.
283
ANEXOSCapitulo
50
a) 1200 b)
40
800 30
LSU
LSU
20
400
10
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
c) 120 d) 150
100
80 100
LSU
LSU
60
40 50
20
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
e) 120 f) 80
100
60
80
LSU
LSU
60 40
40
20
20
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
g) 700 h) 25
600 20
500
15
400
LSU
LSU
300 10
200
5
100
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
FiguraI.3.CromatogramasdeGPCdelosderivadosdePluronicF127descritos:
a)PluronicF127,b)F127Ac2,c)F127Bn2,d)F127OH4,e)F127Ac4,f)
F127Bn4,g)F127OH8yh)F127Ac8.Cromatogramasa),d)yg)realizados
concolumnaStyrageHR1THFWaters,restodecromatogramasrealizadoscon
columnaPLgel5mMIXEDCdeAgilentTechnologies.
284
ANEXOS
30
I J 35
40
45
f1 (ppm)
50
55
G 60
65
4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5 3.3 3.1 2.9 2.7
f2 (ppm)
FiguraI.4.EspectrodeHSQCparalamolculaF127SH2enCDCl3,500MHz.
J
O M
I,IGF
FiguraI.5.Espectrode1HRMNparalamolculaF127PN4enCDCl3,300MHz.
285
ANEXOSCapitulo
100
a) 90
80
70
60
LSU
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo(minutos)
100
b)
90
80
70
60
LSU
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo(minutos)
100
c) 90
80
70
60
LSU
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo(minutos)
FiguraI.6.CromatogramasobtenidosporGPCconcolumnasPLgel5mMIXEDCde
AgilentTechnologiesparaa)F127PN2,b)F127PN4yc)F127PN8.
286
ANEXOS
a)
100
Intensidad(%)
50
0
2000 7000 12000 17000
m/z
b)
100
Intensidad(%)
50
0
2000 7000 12000 17000
m/z
c)
100
Intensidad(%)
50
0
2000 7000 12000 17000
m/z
d)
100
Intensidad(%)
50
0
2000 7000 12000 17000
m/z
e)
100
Intensidad(%)
50
0
2000 7000 12000 17000
m/z
FiguraI.7.EspectrosMALDIMS:a)F127PN2,b)F127SH2,c)F127PN4,d)F127SH4y
e)F127PN8.
287
ANEXOSCapitulo
ANEXOII.CARACTERIZACINDEHIDROGELESPORDSC
LautilizacindelatcnicadeDSCparaladeterminacindelaLCST(LowCritical
SolutionTemperature)dePluronicF127hasidodescritaporvariosautores.135
En los termogramas se muestra el flujo de calor frente a la temperatura,
observndose dos cambios de la lnea base, adjudicados al proceso de
micelizacinydegelificacin(FiguraII.1).
(a)
(b)
FiguraII.1.TermogramadeDSCdeunadisolucinacuosaal30%w/vdePluronic
F127.135d
ElsegundopicodelaFiguraII.1(b),tambinendotrmico,ycorrespondienteal
procesodegelificacin,aparececomounpequeopicoaladerechadelpicode
micelizacinypermiteladeterminacindelaLCST.Enlagelificacinporefecto
135
(a)Nie,S.F.;Hsiao,W.L.W.;Pan,W.S.;Yang,Z.J.,Int.J.Nanomed.2011,6,151166;
(b)Barba,A.A.;d'Amore,M.;Grassi,M.;Chirico,S.;Lamberti,G.;Titomanlio,G.,Journal
ofAppliedPolymerScience2009,114(2),688695;(c)Li,L.;Lim,L.H.;Wang,Q.;Jiang,S.
P., Polymer 2008, 49 (7), 19521960; (d) Cabana, A.; AtKadi, A.; Juhsz, J., Journal of
ColloidandInterfaceScience1997,190(2),307312.
288
ANEXOS
EnlaFiguraII.2(a)semuestraeltermogramacorrespondienteaunadisolucin
de F127Ac4 al 25 % (w/v) dnde solo se aprecia el proceso reversible de
micelizacinenelcalentamientoyenelenfriamiento.Porello,paraunamejor
determinacin de la temperatura de gelificacin, se ha trabajado con la
representacin de la derivada del flujo de calor respecto al tiempo frente a la
temperatura(FiguraII.2(b)).135aElprimerpicomsgrande,debidoaunmayor
valordeentalpa,correspondealprocesodemicelizacin(CMT),mientrasqueel
segundopicomspequeo,debidoaunmenorvalordeentalpa,correspondea
latransicinsolgel(LCST).
289
ANEXOSCapitulo
0,4
a) SOL GEL
0,3
Flujodecalor(W/g)
0,2
0,1
0
0,1
0,2 SOL GEL
0,3
0,4
10 10 30 50
Temperatura(C)
Micelizacincalentamiento
b) 4
3
DerivadaFlujodeCalor
2
(mW/min)
Gelificacincalentamiento
1
2
0 10 20 30
Temperatura(C)
FiguraII.2.TermogramadeDSCdeF127Ac4al25%w/venPBS10mMpH7.4,a)Flujo
decalor(W/g)frentealatemperaturaenelprocesodecalentamientoyenfriamiento,
b)Derivadadelflujodecalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperatura
enelprocesodecalentamiento.
290
ANEXOS
ANEXOIII.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR
MtododeMTTparaladeterminacindelaviabilidadcelular
ElmtodoMTTfuedesarrolladoporMosmann118ben1983ymodificadoen1986
porFranoisDenizotyRitaLang.118a
MTT(coloramarillo) Formazn(colorazul)
FiguraIII.1.ReduccinmetabolicadelMTTaFormaznproducidaporlaenzima
succinatodeshidrogenasa.
En nuestro caso se aadi el MTT a cada uno de los pocillos. Tras incubacin
durante4horasa37Cy5%deCO2seprocediaredisolverelFormaznparasu
cuantificacin.Enestepuntoseobservquepartedeloshidrogelesretenanel
Formazn en su estructura, siendo imposible su total disolucin y por tanto su
cuantificacin.Estehechoeramsnotableenloshidrogelesfotopolimerizados.
Por tanto este mtodo se descart para la medida de viabilidad de nuestros
hidrogeles.
291
ANEXOSCapitulo
Mtodolive/deadparaladeterminacindelaviabilidadcelular
FiguraIII.2.HidrlisisdeCalceinAMparadarlugaraCalceinproducidaporlaenzima
estearasaenelinteriordelaclulas.
292
ANEXOS
FiguraIII.3.EstructuraqumicadelamolculaEthidiumhomodimer1.
MtodoAlamarBlueparaladeterminacindelaviabilidadcelular
293
ANEXOSCapitulo
FiguraIII.4.TransformacindeResaruzinaaResorufinaporreaccionesdereduccinen
lasclulasviablesometabolicamenteactivas.
294
ANEXOS
ANEXOIV.CARACTERIZACINMECNICADEHIDROGELES.
i)Ensayosdecompresinuniaxialmonotnica
Enestetipodeensayoslacargasevaaplicandodeformalinealyuniforme.Con
estosensayosseobtienenelMdulodeRigidez(Emedido):MdulodeYoung(ES)y
MduloAgregado(HA).
295
ANEXOSCapitulo
ii)Ensayosdecompresinuniaxialdecargarelajacin
CoeficientedePoisson()
es la relacin entre la deformacin lateral y la deformacin axial en una
probetaconcargaaxial.
Paraelclculodeserepresentanlosvaloresobtenidosdetensindeformacin
por los mtodos de NC y CC y se obtienen ES y HA, de la forma descrita en el
apartado anterior. Cabe destacar que estos valores obtenidos son diferentes a
loshalladosatravsdelmtododecompresinuniaxialdecargamonotnicaya
que en los ensayos de cargarelajacin se extrae el agua del interior de los
hidrogeles por lo que se evala nicamente las propiedades de la matriz
polimrica.seobtienedeformaempricamediantelacombinacindeESyHA
por medio de la Ecuacin (1). Esta frmula slo es aplicable dentro del lmite
elsticodelmaterial.
(1)
296
ANEXOS
Permeabilidad()
Elclculodelapermeabilidad,,serealizaaplicandolaEcuacin(2),dondees
el tiempo de relajacin, h es el espesor de la muestra y HA es el Mdulo
Agregado.ElclculodeyHAserealizanconensayosdecompresinuniaxialde
cargarelajacindetipoCC.
(2)
LaFiguraIV.1(a)muestralacurvatpicadetensindeformacinobtenidapara
los ensayos de cargarelajacin. En ella se observa el ajuste lineal por mnimos
cuadrados(enrojo)delospuntosdemximarelajacinquepermiteobteneral
valordeHA.
a) b)
c)
FiguraIV.1.a)Curvatpicadetensinvs.deformacinobtenidaparaP/H23F127Ac2enun
ensayodecompresinuniaxialdecargarelajacinconfinada.Encolorrojo,elajustelineal
pormnimoscuadradosenlospuntosdemximarelajacin,b)Curvatpicadefuerzavs.
tiempoparaunarampadecargarelajacin,c)Seleccin(enrojo)yajusteexponencial(en
azul)paraelclculodelapermeabilidadapartirdeunacurvaderelajacin.
297
ANEXOSCapitulo
Paraelclculode,enunensayodeCCdecargarelajacinsepuedemedirla
fuerzadereaccinenfuncindeltiemporequeridoparaalcanzarelequilibrioen
cadacicloderelajacin.LaEcuacin(3)esunafuncinexponencialdeltiempo
dondeFeslafuerzaaplicada,Feslafuerzaamximarelajacin(t=infinito)yse
suponequeesigualacero,F0eslafuerzaamximatensin(t=0)y(tiempode
relajacin)eselparmetroacalcular.EnlaFiguraIV.1(b)semuestralagrfica
correspondientealafuerzaaplicadafrentealtiempo.
(3)
Elajusteexponencialpormnimoscuadradosenlospuntosdemximarelajacin
encadacurvaderelajacinpermiteobtener.
La Figura IV.1 (c) muestra la zona seleccionada para llevar a cabo el ajuste (en
colorrojo)ascomoelajusteexponencialpormnimoscuadrados(encolorazul)
apartirdelcualsecalcula.119
298