10-10-2012

Genmica
estructural y funcional

Genmica
Genmica: conjunto de ciencias y tcnicas
dedicadas al estudio integral del
funcionamiento, contenido, evolucin y
origen del genoma:
Estructural: estudio de la organizacin y la
secuencia de la informacin gentica contenida
en los genomas
Funcional: recoleccin sistemtica de
informacin sobre la funcin de los genes,
mediante la aplicacin de aproximaciones
experimentales globales y haciendo uso de la
informacin y elementos de la genmica
estructural

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Caracterizacin e identificacin de
secuencias
Secuenciacin:
atgcgtagctgatgcttaggcttgacgtaagagta
cgttcagctacgtacgtactagcagatacagttgc
ggctaggctaggctaggctaccgtatgcgatcccc
actagagatcgtagctagctagctgctagctacgt
tgcgatcgatcgtagctagctactcttgatcgatc
tagaagaatacacacatatacatacagatctctgc
tagctagcgtactgtacagatacgatacgtacact
aagacatagacacacacacacatatacacattggg
ctctctctgatc

Secuenciacin por el mtodo de Sanger

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Secuenciacin
automtica

ORF scanning is an effective way of locating genes. The diagram shows 4522 bp of the
lactose operon of Escherichia coli with all ORFs longer than 50 codons marked. The sequence
contains two real genes - lacZ and lacY - indicated by the red lines. These real genes cannot
be mistaken because they are much longer than the spurious ORFs, shown in blue.

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Criterios para ORF:

ATG ----------- (TAA, TAG, TGA)
Frecuencia no aleatoria
Tamao mnimo

Proyectos de secuenciacin
Objetivo:
La completa secuencia del DNA del organismo bajo
estudio, idealmente integrado con los mapas fsicos
y genticos que permitan que genes y otras
caractersticas del genoma puedan ser localizados
en la secuencia.

Requisitos tcnicos:
Tcnicas y equipos de secuenciacin
Herramientas para ensamblar en el orden correcto
las secuencias cortas que se van generando a partir
de experimentos de secuenciacin individuales de
forma de obtener la secuencia completa de los
cromosomas que constituyen el genoma.

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Saccharomyces cerevisiae, la levadura

Clone contig

1996

Genoteca en
csmido

Genoteca por
digestin parcial

Ensamble de las
secuencias con
ayuda del mapa
gentico

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Estrategia shotgun y fuente de error

Caractersticas del genoma

secuenciado de S.cerevisiae
Realizado por un Consorcio Internacional de laboratorios de Europa,
Canad, USA. y Japn
Cepa S288C
12.5 + 1-2 Mb rDNA
16 cromosomas
75 kb mtDNA
Criterio para ORF:
ATG ----------- (TAA, TAG, TGA)
Frecuencia no aleatoria
Tamao mnimo
Cerca de 6000 ORFs
Tamao promedio de 483 codones
272 intrones

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Estrategias para asignar funcin a los

ORF deducidos

1. Anlisis computacional

2. Anlisis funcional

Anlisis computacional

Anlisis de similitud de sus secuencias de DNA

(% de identidad)

Anlisis de homologa de sus secuencias de

aminocidos

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6000 genes (1999)

5700 5800 (2004)

Orphan gene se refiere a genes que poseen una limitada distribucin

filogentica. Es decir, no existen homlogos a este gen en otros
organismos o si hay, estos corresponden a especies muy cercanas.

Categoras de fenotipos de levadura para asignar

funcin a genes desconocidos

DNA synthesis and the cell RNA synthesis and

cycle processing
Protein synthesis Stress responses
Cell wall synthesis and Transport of biochemicals
morphogenesis within the cell
Energy and carbohydrate Lipid metabolism
metabolism
Development DNA repair and
recombination
Meiosis Chromosome structure
Cell architecture Secretion and protein
trafficking
Based on the categories defined by the European Functional
Analysis Network.

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Anlisis funcional
Inactivacin gnica por reemplazo
Genetic Footprinting
Inactivacin gnica y genetic
footprinting
Co expresin
Genmica comparada

Inactivacin gnica

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Inactivacin gnica por reemplazo

Genmica Funcional

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Anlisis funcional:

Comparacin de la
expresin gnica entre
distintas condiciones:
tiempo, condiciones,
etc.

Efecto del grado de heterocigocidad sobre la

viabilidad de esporas en levaduras silvestres

Numero de
Poblacion Ho He Fis
Genotipos

Cauquenes 17 0,19 0,71 0,75

Maquehua 19 0,23 0,63 0,64

Checura 18 0,23 0,76 0,70

Sauzal 19 0,32 0,76 0,59

Valle de Ica 19 0,47 0,75 0,40

100
90
Viabilidad de Esporas (%)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Nmero de Loci Heterocigotos

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CASO 1: Anlisis de expresin entre

cepas homocigotas y heterocigotas
Estudio entre cepa heterocigota (L846) y su espora
L846-1A (homocigota)
Ciclo de vida en levaduras silvestres, homotalismo y
heterotalismo

Anlisis de expresin
59 genes presentaron menor y 28 mayor nivel de
expresin en la espora homocigota L-846 1A respecto
a la cepa heterocigota L-846.
El anlisis de los 59 genes con bajos niveles de
expresin en la cepa homocigota L-846 1A respecto a
la cepa heterocigota L-846, permiti establecer 3
grupos de genes relacionados funcionalmente:
un primer grupo compuesto por 11 genes asociados a
transposones,
un segundo grupo de 5 genes asociados al metabolismo de
lpidos y esteroles, y
un tercer grupo de 3 genes relacionados con transportadores
de membrana.
Los 28 genes con mayor nivel de expresin en la cepa
homcigota L-846 1A respecto a la cepa heterocigota L-
846 no permiti encontrar relacin funcional entre
ellos, sin embargo, destaca la expresin del gen SPT2
supresor de elementos Ty y el gen ASH1 inhibidor de la
expresin del gen HO.

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ORF* Gene Expression Gene description

name ratio**
YER161C SPT2 1.001 0.146 Protein involved in negative regulation of
transcription Inhibidor de
YKL185W ASH1 1.002 0.346 Zinc-finger inhibitor of HO transcription
YKL164C PIR1 1.023 0.378 O-glycosylated protein required for cell wall retrotransposones!
stability
YNL310C ZIM17 1.023 0.418 Heat shock protein with a zinc finger motif
YGR234W YHB1 1.042 0.193 Nitric oxide oxidoreductase,

YBR054W YRO2 1.047 0.082 Putative protein of unknown function

YOL110W SHR5 1.087 0.182 Subunit of a palmitoyltransferase

YJL159W HSP150 1.110 0.112 O-mannosylated heat shock protein

YPL250C ICY2 1.112 0.077 Protein of unknown function
YKL163W PIR3 1.115 0.442 O-glycosylated covalently-bound cell wall protein

YPL239W YAR1 1.131 0.321 Cytoplasmic ankyrin-repeat containing protein of

unknown function
YJL158C CIS3 1.181 0.102 Mannose-containing glycoprotein
YKL123W 1.206 0.113 Dubious open reading frame
YAL063C FLO9 1.208 0.288 Lectin-like protein with similarity to Flo1p
YER175C TMT1 1.226 0.040 Trans-aconitate methyltransferase
YNL265C IST1 1.229 0.429 Protein with a positive role in the multivesicular
body sorting pathway
YKL087C CYT2 1.254 0.069 Cytochrome c1 heme lyase
YJL035C TAD2 1.264 0.325 Subunit of tRNA-specific adenosine-34
deaminase
YBR028C - 1.275 0.250 Putative protein kinase
YGL028C SCW11 1.276 0.383 Cell wall protein with similarity to glucanases
YGL008C PMA1 1.428 0.288 Plasma membrane H+-ATPase
YKL040C NFU1 1.481 0.176 Protein involved in iron metabolism in
mitochondria
YLL063C AYT1 1.683 0.039 Acetyltransferase
YLR273C PIG1 1.714 0.082 Putative targeting subunit for the type-1 protein
phosphatase Glc7p
Table 4. Genes with high
YMR127C SAS2 1.909 0.341 Histone acetyltransferase (HAT)
YLR318W EST2 1.986 0.224 Reverse transcriptase subunit of the telomerase expression levels in the strain L-
holoenzyme 846 1A respect to the wild strain L-
YLR026C SED5 2.188 0.119 cis-Golgi t-SNARE syntaxin required for vesicular
846.
transport between the ER and the Golgi complex
* ORFs name of Saccharomyces genome
YOR087W YVC1 2.213 0.184 Vacuolar cation channel database.
** Expression value from normalized
microarray data and their standard
deviation.

Retrotransposones !

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Los grandes rearreglos cromosomicos pueden favorecer

la adaptacin de las levaduras, sin embargo, los
elementos Ty son capaces de realizar mutagnesis por
insercin

De esta forma, minimizar la retrotrasposicin de los

elementos Ty sera importante para la mantencin de la
integridad del genoma de la levadura

En conclusin, las cepas diploide homocigoto analizadas

tienen una baja expresin de retrotrasposones Ty1 y Ty2
respecto a las cepas diploide heterocigoto, esto
posiblemente se debe a una sobreexpresin del gen
SPT2, lo que nos lleva a proponer una mayor estabilidad
de los genomas diploide homocigotos respecto a los
genomas diploide heterocigotos.

CASO 2: Anlisis genmico estructural y

funcional para identificar genes vinculados
a fenotipos especficos

Cmo identificar nuevos genes y/o alelos

involucrados en fenotipos de inters?

Cmo asociar estas variantes genticas a los

fenotipos de inters?

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A nivel de expresin:

Comparacin de la expresin gnica bajo cultivo en

distintas condiciones de nitrgeno.

Durante la fermentacin, 2000 genes que cambian

su expresin (Rossignol et al., 2003).

Cambios en la concentracin de N, 70% del

transcriptoma (Mendes-Ferreira et al, 2007)

Cambios en el tipo de fuente de N, 401 genes

(Jimenez-Marti & del Olmo 2007).

Anlisis transcripcional
Comparacin de los perfiles de expresin
gnica entre cepas genticamente
similares, pero que difieran
fenotpicamente en el rasgo de inters, y Ho/Ho
cultivadas bajo las mismas condiciones

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Cepas nativas
(206 cepas)

Cepa parental Cepa parental

L-3145 L-3147

Hbrido
L-3044

Ascosporas (115)

Anlisis fenotpicos

Frecuencia de distribucin del consumo de nitrgeno en 115

cepas obtenidas por esporulacin del hbrido L3044

Amonio (mg/L) Aminocidos (mg/L)

L3145 L3147 L3044

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Cepas seleccionadas:
AC19: alto consumo de nitrgeno desde amonio
AC115: alto consumo de nitrgeno desde aminocidos

Todas corresponden a cepas que terminaron la fermentacin (<5 g/l azcar

residual) y no presentaron diferencias en otros parmetros.

Comparacin del perfil de expresin de las cepas

seleccionadas:

AC19 AC115

AC19: alto consumo de nitrgeno desde amonio

AC115: alto consumo de nitrgeno desde aminocidos

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Anlisis de expresin entre cepas con distinto

consumo de nitrgeno
Diferencias en consumo de aminocidos
(AC115 v/s AC19)

Cambios en la expresin
de 155 genes
Respuesta a sustancias
inorgnicas
Regulacin del
metabolismo de
compuestos nitrogenados
Metabolismo del RNA
Genes de funcin
desconocida

AC19: alto consumo de nitrgeno desde amonio

AC115: alto consumo de nitrgeno desde aminocidos confirmacin por
qPCR

Confirmacin mediante QPCR de genes con diferencias en su

expresin entre las cepas analizadas

Gen Open reading Description Strain with Fold change by Fold change
name frame more mRNA Microarraya,c,d by QPCRb,c,d
ATO2 YNR002C Putative protein involved AC19 1.46 2.64
in the ammonium
transport
ICY1 YMR195W Unknown function AC19 1.50 3.03
ZRT1 YGL255W Protein involved in the AC19 3.72 4.72
Zn transport
CMP2 YML057W Isoform of calcineurin A AC114 1.43 1.66
NHA1 YLR138W Na+/K+ pump AC114 2.03 1.25
RDL1 YOR285W Unknownfuntion AC114 2.52 1.87
VPS8 YAL002W Vacuolar localization AC114 3.25 2.60
ARR3 YPR201W Arsenite transporter AC115 5.73 3.08
ARR1 YPR199C Trancriptional factor AC115 1.57 3.24
RDL1 YOR285W Unknownfuntion AC115 1.59 3.04
TVP23 YDR084C Integral membrane AC115 9.51 2.02
protein of Golgi
a Average of four replicates. b Average of two replicates. c The number is the log ratio of gene
expression between the strains evaluated. d The data used in microarrays and QPCR 2 comes from
independent experiments.

Qu efecto produce en la incorporacin de nitrgeno desde

aminocidos si hacemos la actividad de ARR3 constitutiva?

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Efecto de la expresin constitutiva de ARR3 en la cepa

vnica industrial EC1118

Verificacin de la condicin control:

4.5
4.0
3.5
Nivel de expresin

3.0
2.5
2.0
1.5
C
1.0
0.5
0.0
0 50 100 150
Tiempo (h)

Expresin del gen ARR3 en la cepa vnica

EC1118 fermentada en mosto sinttico.

Clonamiento del gen ARR3

Amplificacin del gen ARR3 de la cepa EC1118

1: /EcoRI+HindIII; 2: producto hbrido entre el gen ARR3 y el
promotor del gen ACT1; 3: ARR3; 4: promotor del gen ACT1; 5: 100
pb. Gel de agarosa al 1%.

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Estrategia de clonamiento del gen ARR3

en el plsmido YEpAct4MX.

KANMX

pact ARR3
!
P1
Pbla

bla
YEpAct4MX
7736 bp
SOEing

Origen 2 micras Origen pBR322

SmaI (17) pact ARR3 AccI (1812)

M13 R
M13 F Acc I (3423)
Producto hbrido
Sma I (3973) Pact

Acc I

Eco RV Sma I

M13 R
Origen pBR322 Acc I (253)
KANMX
Pact
Sma I (803)
P1
bla M13 F
Acc I
bla

Pbla Origen 2 micras

+ ARR3 - YEpact4MX
ARR3-YEpAct4
8983 bp
8100 bp
Sma I
Origen 2 micras Origen pBR322

ADN ligasa M13 F M13 R

Sma I (5220) Acc I (3423)
Acc I (4915) Sma I (3120)

Pact1 Pact1 ARR3

ARR3

Transformacin de la cepa vnica industrial EC1118 con

plsmidos recombinantes
1 2 3 4 5 6 7 8

1.584 pb

947 pb
564 pb

Transformacin de la cepa EC1118 con plsmidos recombinantes

Se amplific DNA obtenido de las cepas de S. cerevisiae transformadas con los partidores M13R y
M13F. Carril 1: marcador de peso molecular /EcoRI+HindII; carril 2: EC1118-YEpact4MX; carril 3:
EC1118-ARR1; carril 4: EC1118-RDL1; carril 5: EC1118-TVP23; carril 6: EC1118-ARR3; carril 7:
EC1118 sin transformar; carril 8: marcador de peso molecular de 100 pb. Gel de agarosa al 1%.

Transformacin inversa de E. coli DH5

Transformacin de E. coli con ADN de EC1118-
YEpAct4MX y EC1118-ARR3.

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Efecto fenotpico de la expresin constitutiva de

los genes ARR1, ARR3, RDL1 y TVP23 en la cepa
EC1118

Varios fenotipos
Cepa Acido succnico Acido lctico Acido actico Trehalosa
(g/L) (g/L) (g/L) (g/L)
EC1118 -YEpAct4MX 0.43 0.06 0.1 0.0 2.10 0.36 0.5 0.1
EC1118-ARR1 0.33 0.06 0.1 0.0 2.07 0.06 0.5 0.0
EC1118-RDL1 0.40 0.10 0.1 0.0 2.00 0.10 0.5 0.0
EC1118-TVP23 0.43 0.06 0.1 0.0 1.97 0.06 0.5 0.0
EC1118-ARR3 0.33 0.06 0.1 0.0 2.13 0.06 0.5 0.0
EC1118 0.47 0.06 0.1 0.0 2.23 0.06 0.5 0.0
(a):
p<0,05; (b): p<0,01; (c):p<0,001. Diferencias estadsticamente significativas con
respecto a la cepa EC1118-YEpAct4MX

Cepa Glicerol Etanol Brix Rendimiento

(g/L) (%v/v) (Yp/s)
EC1118 -YEpAct4MX 13.33 1.75 10.40 3.06 9.00 0.80 0.37 0.12
EC1118-ARR1 11.90 0.3 14.67 0.35 8.70 0.31 0.50 0.01
EC1118-RDL1 12.6 1.3 11.8 1.10 10.05 2.62* 0.48 0.03
EC1118-TVP23 11.5 0.95 13.9 0.95 8.00 0.00* 0.46 0.04
EC1118-ARR3 13 0.53 12.47 1.10 8.07 0.61 0.42 0.61
EC1118 14.27 0.42 13.97 0.74 8.07 0.23 0.46 0.03

* Valor obtenido de duplicado. a): p<0,05; (b): p<0,01; (c):p<0,001. Diferencias
estadsticamente significativas con respecto a la cepa EC1118-YEpAct4MX

Efecto fenotpico de la expresin constitutiva de

los genes ARR1, ARR3, RDL1 y TVP23 en la cepa
EC1118

Nitrgeno

Cepa Consumo Consumo Consumo Total

Aminocidos Amonio (mg N/L)
(mg N/L) (mg N/L)
EC1118 -YEpAct4MX 95.47 0.23 101.57 4 197.04 3.88
EC1118-ARR1 93.61 0.71 (a) 92.73 9.39 186.34 9.73
EC1118-RDL1 93.10 1.82 70.82 21.69 163.92 23.48
EC1118-TVP23 92.08 0.54 (b) 87.31 10.89 179.39 11.41
EC1118-ARR3 127.10 1.9 (c) 102.29 6.31 229.39 5.78 (b)
EC1118 89.91 1.15 (b) 98.11 3.17 188.01 3.52 (a)
a): p<0,05; (b): p<0,01; (c):p<0,001. Diferencias estadsticamente significativas con respecto a la
cepa EC1118-YEpAct4MX

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Consumo de arginina en cepas transformantes

de EC1118

35
Consumo de Arginina (mg N/L) 30

25
20

15
10

5
0
EC1118 EC1118 EC1118 EC1118 EC1118 EC1118
YEpAct4MX ARR1 RDL1 TVP23 ARR3

Representacin grafica de la variacin del consumo

de arginina. Las determinaciones se realizaron en
triplicado, todos datos fueron analizados mediante el
anlisis estadstico ANOVA, *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p
<0,001.

Por lo tanto, ARR3 tambin tendra un papel en la incorporacin de

arginina adems de su funcin en el transporte de arsenito.

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