Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

DIAGNSTICO MOLECULAR

PROLOGO
El siguiente apartado no tiene como finalidad desarrollar absolutamente todas las
tcnicas de diagnstico molecular de uso actual (en virologa), como tampoco
profundizar en sus tcnicas operatorias de laboratorio.
En el ANEXO I, se detallan los detalles pertinentes a la organizacin del laboratorio
de biologa molecular, los aspectos pre-analticos, analticos, las fuentes de interferencia
y los controles de calidad que deben realizarse en biologa molecular.

OBJETIVO
Llevar al alumno una herramienta ms de estudio que le ayude a interpretar el uso de
una u otra tcnica de laboratorio, como as tambin comprender los principios bsicos
de funcionamiento de cada una de ellas

INTRODUCCIN
La tecnologa empleada para la deteccin de genomas virales mediante la
amplificacin de secuencias especficas (PCR y reacciones isotrmicas), tanto como la
hibridacin de cidos nucleicos, han recibido un significativo impulso en los ltimos
aos.
La muy alta especificidad, sensibilidad y disponibilidad de reactivos estandarizados,
hacen del uso de estas tcnicas una herramienta valiosa para la deteccin de infecciones
virales.
La deteccin de genomas virales puede proveer valiosa informacin que no podra ser
obtenida por otros mtodos. Algunas situaciones que favorecen el empleo de las
tcnicas de diagnstico molecular de enfermedades virales son:
Cuando no es posible detectar virus infeccioso por defectos en la obtencin o
transporte de las muestras; o cuando el virus esta asociado a complejos inmunes
(Ag/Ac).
Cuando existe mas de un virus en la muestra a analizar.
Cuando se carece de sistemas in Vitro de aislamiento y cultivo, o bien la
propagacin en cultivo es lenta.
Ante la falta de reactivos para detectar antgenos virales.
Para determinar niveles de replicacin viral en portadores crnicos.
Para identificar clulas individualmente infectadas y realizar estudios de
fisiopatogenia.
Las tcnicas de diagnstico molecular (TDM) tienen su utilidad no solo en su
importancia diagnstica sino tambin en el seguimiento de los tratamientos de pacientes
con terapia antiviral.
En la actualidad se disponen de una amplia gama de reactivos comerciales que
permiten la deteccin y diagnstico de distintas familias de virus, aumentando as la
confiabilidad de las tcnicas que en su comienzo eran artesanales, carentes de controles
apropiados debido a la complejidad de la misma y factibilidad de ocurrencia de errores
del tipo carry-over (contaminacin cruzada).
Para aquellos agentes virales que son de menor inters econmico(para los laboratorio
que desarrollan kits comerciales) y que, por lo tanto, no se dispone de kits, y en caso de
que los haya, no son de fcil aplicacin o bien de costo elevado, se emplean mtodos
optimizados en los propios laboratorios. Estos mtodos requieren diversos controles
para evaluar la reproducibilidad, sensibilidad y especificidad.
Podramos dividir a las TDM en:
1. Mtodos de hibridacin de cidos nucleicos (captura de hbridos, Branched
DNA)
1
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

2. Mtodos de amplificacin de cido nucleicos (PCR e isotrmicos)

1. MTODOS DE HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS:

Quiero aclarar que si bien todos los mtodos desarrollados en este apartado incluyen
en uno o todos sus pasos la hibridacin de cidos nucleicos, los que a continuacin
son descriptos no tienen amplificacin de secuencias blanco, de aqu esta clasificacin.
Branched-DNA: esta tecnologa se basa en la amplificacin lineal de la seal,
obtenida al hibridar con sondas de captura la secuencia blanco de inters, la que
posteriormente ser tambin hibridada con otras sondas (amplificadoras) en diferentes
regiones del genoma investigado. Finalmente, esas sondas amplificadoras a su vez
tambin sern hibridadas con sondas marcadas con enzima, lo cual permitir su
deteccin por quimioluminiscencia. Esta metodologa fue puesta en el mercado por
Chiron Diagnosis Corporation y es aplicada en la deteccin de RNA de HIV, HCV y
HBV. Los resultados se expresan como n de copias/ml.
Secuencia (fig.1):
1) El RNA viral es liberado usando un buffer de lisis
2) Se coloca la muestra en la microplaca que posee pegada en el fondo sondas de
captura
3) Se colocan sondas que hibridan con sondas preamplificadoras
4) Se aaden las sondas de preamplificadoras
5) Se colocan las amplificadores que hibridan sobre los preamplificadotes
6) Para finalmente hibridizarse las sondas marcadas

Figura 1
No existe una correlacin absoluta entre los equivalentes de copias genmicas del b-
DNA con los valores de copias obtenidas por la amplificacin de secuencia blanco
(PCR competitiva, NASBA, Real Time PCR), por lo tanto el monitoreo de teraputicas
iniciado por una de las metodologas no debera ser luego intercambiado por otra.
Entre las ventajas de la utilizacin de esta tcnica encontramos:
Deteccin de niveles reales de genomas virales
No amplifica DNA
Reproducibilidad
Ahorro de tiempo
2
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

Rango dinmico de cuantificacin 0,2 120 Meq

Mientras que las desventajas seran:
Menor sensibilidad (con respecto a la PCR semicuantitativa, y a la PCR
cuantitativa)
Posibles falsos positivos entre 0,2 y 0,5 Meq/ml
Sobrevaloracin del nmero de Meq en sueros hiperlipmicos.

Captura de hbridos: es otro mtodo de deteccin de DNA viral y amplificacin de la

seal. Utiliza sondas de RNA dirigidas contra secuencias especficas del target. El
ensayo se fundamenta en una hibridacin en fase liquida. Si el DNA viral esta presente
en la muestra los hbridos son capturados por anticuerpos especficos ANTI-hbridos,
pegados en las paredes del pocillo, en un paso posterior se agregan anticuerpos
conjugados con enzima, para finalmente agregar el sustrato quimioluminiscente que
permite el revelado de la reaccin. Este ensayo puede ser utilizado en forma tanto
cualitativa como tambin cuantitativa. Se usa en la deteccin de HPV, CMV y DNA de
HBV.

METODOS DE AMPLIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS:

Aqu no dedicaremos a describir las distintas tcnicas de amplificacin de cidos
nucleicos que podemos clasificar en:
1) REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
2) AMPLIFICACIN ISOTRMICA

1) REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Desde su introduccin a mediados de la dcada del 1980, la Reaccin en Cadena de la

Polimerasa (Polimerase chain reaction, PCR), se utiliz como una herramienta en el
estudio de los cidos nucleicos, ya sea en la secuenciacin del ADN, clonacin de
genes, diagnstico de infecciones por microorganismos, enfermedades genticas,
cncer, etc. La PCR slo se ha consolidado como un procedimiento realmente til en
virologa, al ser una buena alternativa al aislamiento por cultivo celular.
El fundamento de esta tcnica es la amplificacin enzimtica de un fragmento de
DNA flanqueado por dos oligonucletidos (primers) que hibridan con las cadenas
opuestas de la secuencia nucleotdica de inters (secuencia blanco).
La sensibilidad de esta tcnica es la de detectar 1 10 copias de ADN presentes en la
muestra. Obteniendo al final de los 25 35 ciclos, 30.000.000 de copias
aproximadamente, que pueden ser observados en la tincin con bromuro de etidio, al
final de la electroforesis en gel de agarosa. (fig. 2)

Figura 2

Aunque existen diversas variantes de la PCR, el formato convencional o standard,

incluye 3 ciclos (Fig. 3) de:
3
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

1- desnaturalizacin de la doble hebra de ADN en simple hebra y activacin de la

enzima Taq Polimerasa a altas temperaturas 94-96C en un tiempo de 30-90 seg.
2- hibridizacin de las secuencias del ADN con los primers especficos entre 37-65C
por 30-120 seg.
3- elongacin de los primers por la enzima entre 70-75C por 30-120 segundos.

Figura 3

NESTED PCR: Aqu vamos a utilizar una segunda reaccin de amplificacin con un
nuevo par de primers, dirigidos a una region interna de la secuencia previamente
amplificada. De esta manera aumentamos la sensibilidad y la especificidad, y es la
tcnica de eleccin para el diagnstico viral en muestras que posean escasa cantidad de
partculas virales (LCR). Los productos de la primera reaccin no interfieren ya que se
realiza una dilucin con el agregado de los reactivos de la segunda.(fig.4)

Figura 4

4
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

Esta metodologa se usa en el diagnstico de virus de la familia herpetoviridae (CMV,

herpes simple I/II, EBV, HHV-6 y VZV), y enterovirus en LCR.

MULTIPLEX PCR: En esta TDM se amplifican simultneamente varias regiones del

DNA target utilizando distintos pares de primers. Esto permite la determinacin
simultnea de mas de un tipo de virus, como as tambin de varias familias de virus al
mismo tiempo. En la actualidad laboratorios de hospitales de alta complejidad o de
centros especializados como el Instituto Malbrn llevan adelante este tipo de
metodologa para la determinacin simultnea de herpes virus y enterovirus en LCR. No
estando disponibles estas tcnicas en un formato comercial.
Por su caracterstica este tipo de tcnica lleva mucho tiempo en su puesta a punto, ya
que resulta laborioso el diseo y la eleccin de los oligos a utilizar en cada paso: se debe
evitar la formacin de dimeros de primers (como consecuencia de su
complementariedad), como as tambin los apareamientos no especficos en zonas que
no sean la del target.
De todas maneras, existen programas informticos que disean secuencias de primers
en base a la secuencia blanco que queramos amplificar ingresando a la base de datos del
programa, que da una serie de alternativas que se podran utilizar. Este tipo de programa
sumado a que los bancos de genes son de fcil acceso en Internet (sitio oficial de la
NCBI), hacen ms fcil este trabajo.

RT-PCR: Esta variante de PCR se realiza cuando el cido nucleico blanco es el ARN ya
que la Taq polimerasa usa solamente ADN como templado. Debe hacerse un
tratamiento previo a la muestra con otra enzima, retrotranscriptasa o transcriptasa
reversa, que realiza lo que algunos virus ARN desarrollan in-vivo. La enzima se extrae
de dos fuentes: virus de la leucemia murina Moley (MMLV) o del virus de la
mieloblastosis aviar (AMV).
La RT-PCR es aplicada en la deteccin de numerosos RNA virus: incluyendo el HIV,
HCV, enterovirus, rotavirus, VSR, Parainfluenza, Influenza, Dengue y virus que causan
gastroenteritis.
Tambin puede ser aplicada en la deteccin de ARNm viral, esto es importante en el
diagnstico de virus que se encuentren en estado de latencia como es el caso del CMV.
El mayor inconveniente de esta tcnica radica en:
La conservacin: debido a que el ARN se degrada rpidamente, todas las
muestras deben refrigerarse, y de ser posible sometidas a la reaccin de
retrotranscripcin ya que el ADN es de mayor estabilidad y puede congelarse a
-20C sin que existan mayores problemas. En caso contrario la temperatura de
eleccin para conservar los extractos de ARN es a -70C, usando como solvente
etanol puro.
El tratamiento de la muestra: siempre debe ser manipulada con guantes, debe
evitarse siempre el contacto con la piel (que posee nucleasas) y de todos los
materiales con los que se vaya a trabajar, asegurndonos que estn libres de
RNAasa. En algunos protocolos de extraccin de ARN, se incluye el reactivo
RNAsin (inhibidor de RNAasa), intentando evitar que se produzca un falso
negativo.

REAL TIME PCR: En esta TDM los procesos de amplificacin y deteccin se

producen al mismo tiempo en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna reaccin
posterior. Adems, mediante deteccin por fluorescencia se puede medir durante la
amplificacin la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisin de
fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidad de ADN formado.
Esto permite conocer y registrar en todo momento la cintica de la reaccin de
amplificacin.
5
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de
fluorescencia y estn diseados para poder medir, en cualquier momento, la
fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificacin. Los
sistemas de deteccin por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser
de dos tipos: agentes intercalantes y sondas especficas marcadas con fluorocromos,
diseadas, como veremos ms tarde de manera especial.

Figura 5

Figura 6

Agentes intercalantes: son fluorocromos que aumentan notablemente la emisin de

fluorescencia cuando se unen al ADN de doble hlice. El ms empleado es el SYBR
Green I. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de
la fluorescencia emitida. Este sistema tiene la ventaja de ser menos costoso que las
sondas especficas y es mas fcil de optimizar. El principal inconveniente de su uso es
en su baja especificidad, ya que se une tanto a productos inespecficos como a dmeros
de primers. Los agentes intercalantes no permiten la identificacin de polimorfismos en
la secuencia diana.
Sondas de hibridacin especficas: son sondas marcadas con dos fluorocromos, un
donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energa fluorescente
mediante resonancia (FRET) entre las dos molculas. Las ms utilizadas son la sondas
de hidrlisis, denominadas tambin sondas Taman, las sondas molecular beacons y las
sondas FRET. En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se
corresponde con un aumento de hibridacin de las sondas, lo que conlleva a un aumento
en la misma proporcin de fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza la

6
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

especificidad de la deteccin y permite identificar polimorfismos o mutaciones

puntuales, pero la optimizacin es mas difcil y su costo mayor.

Figura 7

La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su rapidez, puesto que no se necesita
ningun proceso adicional de deteccin. Si el equipo empleado es el Light Cycler o
equivalente, esta ventaja es todava ms acusada, pudindose completar el proceso de
amplificacin y deteccin en 30-40 min. Adems, gracias a su rapidez, estos equipos se
pueden rentabilizar al mximo, permitiendo un flujo mucho mayor de muestras y de
ensayos. Otra ventaja es que al ser un sistema cerrado el riesgo de contaminacin
disminuye de forma importante.

3)AMPLIFICACIN ISOTRMICA

NASBA: El fundamento de esta TDM radica en el empleo consecutivo de tres

actividades enzimticas:
A- transcriptasa reversa
B - RNAsa H
C- T7 RNA polimerasa
El diagrama cclico de estas actividades se observa en la figura 8, la que imita en
cierta medida a la replicacin de los retrovirus. Al colocar el ARN blanco un
oligonucletido antisentido contiene en una parte de su secuencia un sitio de
reconocimiento para la enzima T7 RNA polimerasa, y en la remanente de su misma
secuencia las bases complementarias a la secuencia blanco del RNA. A partir de este
oligonucletido (primer que acta como iniciador) la transcriptasa reversa comienza la
copia del templado de RNA hasta concluir con la formacin del DNA complementario
(DNAc). El RNA del hbrido es degradado por la RNAsa H, y queda slo la copia de
DNAc que ser utilizada como molde nuevamente por la transcriptasa reversa, para
sintetizarse una DNA bicatenario a partir del otro oligonucletido cebador.

7
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

Figura 8
La T7 RNA polimerasa puede ahora reconocer la secuencia de su promotor, a partir de
la cual comienza la sntesis de transcriptos, y ello permite la consecucin de la
amplificacin cclica. El sistema NASBA (o Nuclisens) cuantitativo utiliza un sistema
de electroquimioluminiscencia basado en la deteccin de los transcriptos formados,
mediante una hibridacin sandwich, donde se emplean sondas marcadas en el extremo
5 con biotina que se pega a perlas magnticas recubiertas con estreptavidina. Mediante
una segunda hibridacin dirigida hacia regiones de los transcriptos no hibridados por la
sonda inicial de captura, un segundo primer conjugado con rutenio emite una seal
electroquimioluminiscente (fig. 9). Se utilizan tres controles internos de concentracin
conocida, con cuyos valores de emisin se elabora una curva de calibracin, que
permite ingresar con el valor de emisin de la muestra para obtener la cantidad de
copias/ml presentes en la misma. Este mtodo tiene buena correlacin con los otros
mtodos de cuantificacin usados en la actualidad.
Se utiliza para hallar la carga viral de HIV, HCV y CMV en muestras de pacientes que
estn recibiendo tratamiento.

Figura 9
Otras tcnicas: En el mundo se encuentran en desarrollo otras variables del NASBA
como son 3SR y TMA, que tienen el mismo fundamento que la misma. Entre otras
tcnicas que no describiremos en este apartado se encuentran:
8
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

Q replicasa
Molecular switch (RNAsa III)
Strand Displacement Amplification (HincII)

MICROARRAYS: Los microarreglos de DNA son una nueva herramienta de la biologa

molecular, este constituido por una matriz bidimensional de material gentico, que
permite realizar de manera simultnea y automatizada, miles de ensayos encaminados a
conocer en profundidad la estructura y funcionamiento de un conjunto de genes, en
situaciones normales o patolgicas.
No cabe duda que esta ser la tecnologa utilizada en un futuro no muy lejano para
identificar cualquier virus, en una superficie no mayor a 1 cm 2.
El fundamento de esta tecnologa se basa en: la hibridacin del DNA presente en una
muestra con oligos pegados en una superficie, luego se incuba con primers marcados
con distintos fluorocromos, al hacer incidir luz lser de distinta longitud de onda, las
sondas marcadas emiten un determinado color dependiendo de si hubo o no hibridacin.
La prueba se interpreta con un microscopio y se obtienen imgenes que se analizan con
un programa de computacin (fig. 10).

Figura 10

Las lecturas son concluyentes respecto de si existe o no una determinada secuencia en

el target, y adems nos brindan datos acerca de si hubo o no mutacin en la secuencia a
analizar, como as tambin la ausencia de determinados tipos de genes.

9
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

ANEXO I

ORGANIZACIN DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR

Debido a los requerimientos especiales asociados con las tcnicas de amplificacin, el

laboratorio debe estar dividido en cuatro reas de trabajo, separadas entre s. En cada
una de estas reas se deben realizar los distintos procedimientos sin intercambio de las
herramientas de trabajo, a modo de obtener mejores rendimientos en la reaccin de
amplificacin y disminuir los errores por contaminacin. Las reas de trabajo son:
1- rea de almacenamiento y preparacin de reactivos
2- rea de preparacin de la muestra
3- rea de reaccin
4- rea de anlisis de los productos

REA DE ALMACENAMIENTO Y PREPARACIN DE REACTIVOS

En este sector se realiza la preparacin de las soluciones que se utilizarn en la reaccin
de amplificacin, a partir de los reactivos concentrados (soluciones stock) y
almacenados. Estos reactivos deben ser controlar a fin de descartarlos si se detecta
contaminaciones o errores en su preparacin.
Se deben evitar los ciclos de descongelacin-congelacin y la manipulacin excesiva, lo
cual podran introducir contaminantes con el uso de las pipetas. Para evitar esto; se
realizan pequeas alcuotas de las soluciones stock las cuales se irn usando
progresivamente.

REA DE PREPARACIN DE LA MUESTRA

En este sector se realiza la extraccin, el almacenamiento y la separacin de los cidos
nucleicos.
Se requiere por parte del operador buenos procedimientos de pipeteo.
Para evitar contaminacin con otras muestras los tubos deben permanecer siempre
cerrados y ser centrifugados brevemente previamente a ser abiertos para evitar la
diseminacin de aerosoles. Adems, deben usarse tips con filtros durante todo el
procedimiento y decontaminar el rea de trabajo antes y despus de su uso, mediante el
uso de solucin de hipoclorito 10% y/o radiacin UV.

10
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

Cuando se est purificando RNA, es aconsejable realizar la sntesis del cADN

inmediatamente despus de la extraccin, debido a su inestabilidad.

REA DE REACCIN DE PCR

En ste sector se realiza la mezcla de los reactivos de amplificacin (preparacin de la
Mix PCR) y el agregado de los cidos nucleicos purificados al tubo de reaccin. La
amplificacin de los fragmentos de ADN o de cADN se realiza exclusivamente en esta
rea.
Para evitar la contaminacin por formacin de aerosoles, los tubos deben permanecer
siempre cerrados y ser centrifugados brevemente previamente a ser abiertos. Se deben
usar tips con filtro durante todo el proceso, as como micropipetas de uso exclusivo. Es
necesario que el operador presente un cuidadoso comportamiento, evitando errores en el
pipeteo. El movimiento o circulacin de personas dentro del rea debe ser mnimo. Es
imprescindible decontaminar el rea de trabajo antes y despus de su uso, mediante el
uso de solucin de hipoclorito 10% y radiacin UV

REA DE ANLISIS DE LOS PRODUCTOS

En este sector se realiza la identificacin y cuantificacin de los productos amplificados,
utilizando diversas estrategias (electroforesis, mtodos de hibridizacin, etc.).
El anlisis de los fragmentos amplificados inevitablemente conduce a la contaminacin
de este sector, por lo cual, est prohibido el transporte de pipetas y materiales de esta
rea a cualquiera de las otras reas del laboratorio utilizadas para el procedimiento.

ASPECTOS PREANALTICOS

MATERIALES BIOLGICOS
Los mtodos de amplificacin de cidos nucleicos pueden aplicarse a una alta variedad
de materiales, incluyendo sangre entera anticoagulada, mdula sea, plasma, suero,
aspirados nasofarngeos, lavados bronquiales, esputos, hisopados, biopsias, tejido
fresco, orina, materia fecal, lquido cefalorraqudeo, etc.

CONDICIONES DE RECOLECCIN Y CONSERVACIN DE LAS

MUESTRAS
1- Sangre entera: recolectar 3-5 ml de sangre entera en tubo plstico estril
conteniendo EDTA como anticoagulante (Tubo de hemograma). La muestra ser
remitida al laboratorio dentro de las 6 horas de extrada o conservada en heladera a 4 C
(NO CONGELAR) hasta su envo, el cual deber ser dentro de las 24 horas
preferentemente.
2- Suero o plasma: recolectar 0,5-1,0 ml de suero o plasma en tubo plstico estril. La
muestra ser remitida al laboratorio dentro de las 6 horas de separada del cogulo o
conservada en heladera a 4C hasta su envo si se realiza dentro de las 24 horas. Para
conservar por ms tiempo, la muestra se congelar en freezer a -20C hasta su
envo.

3- Lquido cefalorraqudeo: recolectar 0,5-1,0 ml de lquido cefalorraqudeo en tubo

estril. La muestra ser remitida al laboratorio lo ms rpido posible o conservada en
heladera a 4C hasta su envo, el cual no deber ser dentro de las 12 horas. Para
conservar por ms tiempo, la muestra ser congelada en freezer a -20C hasta su envo.
4- Orina: recolectar 10 ml de orina en envase plstico estril con tapa a rosca. La
muestra ser remitida al laboratorio dentro de las 6 horas de extrada o conservada en
heladera a 4C hasta su envo, el cual deber ser dentro de las 24 horas preferiblemente.

11
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

5- Lavados broncoalveolar o nasofarngeo: para obtener el material por lavado se

utilizarn 2-5 ml de solucin fisiolgica estril. La muestra obtenida por este mtodo
deber trasvasarse a un tubo plstico estril. La muestra ser remitida al laboratorio
dentro de las 6 horas de extrada o conservada en heladera a 4C (NO CONGELAR)
hasta su envo, el cual deber ser dentro de las 24 horas preferiblemente.
6- Hisopado de vescula: seleccionar una vescula conteniendo fluidos. Romper la
vescula y recoger los fluidos con el hisopo estril. Luego pasar el mismo hisopo por la
base de la lesin para poder recuperar una buena cantidad de clulas epiteliales
infectadas. Colocar el hisopo en un tubo estril. La muestra ser remitida al laboratorio
dentro de las 6 horas de extrada.
7- Lquido de vesculas: insertar la jeringa de tuberculina en la vescula, entrando de
ser posible desde abajo hacia arriba. Aspirar el lquido contenido en la misma. De existir
varias vesculas, repetir el procedimiento anterior. Recolectar el lquido obtenido en un
tubo plstico estril. (NO TRANSPORTAR JERINGAS CON O SIN AGUJAS). La
muestra ser remitida al laboratorio dentro de las 6 horas de extrada o conservada en
heladera a 4C (NO CONGELAR) hasta su envo, el cual deber ser dentro de las 24
horas preferiblemente.
8- Biopsias: colocar el tejido de la biopsia dentro de un tubo plstico estril. Las
muestras sern remitidas al laboratorio lo antes posible o conservada en freezer -
20C hasta su envo, el cual deber ser dentro de las 24 horas preferiblemente.
La presencia de restos de sangre en las muestras (presencia del grupo Hemo) o el uso de
heparina como anticoagulante son inhibidores de la reaccin de amplificacin, por lo
cual debe rechazarse las muestras que presenten ambos componentes.

ASPECTOS ANALTICOS

PREPARACIN DE LA MUESTRA .
Existen diversos mtodos de extraccin del material gnico. Los ms comnmente
utilizados son:
1- Mtodo de extraccin orgnica y precipitacin alcohlica. Consta de las
siguientes etapas:
- tratamiento de la muestra con un Buffer de lisis que contiene proteinasa K y SDS
- extraccin fenlica
- extraccin con cloroformo
- precipitacin de los cidos nucleicos con etanol absoluto en fro
- hidratacin del purificado con Buffer salino o agua
2- Mtodo de extraccin con partculas de slica. Consta de las siguientes etapas:
- tratamiento de la muestra con un Buffer de lisis que contiene tocianato de guanidina y
detergente no inico
- agregado de partculas activadas de slica a la solucin e incubacin
- separacin de la slica por centrifugacin
- lavados de la slica con Buffer, etanol y acetona
- liberacin de los cido nucleicos de las partculas de slica

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA PCR:

1- Enzimas: se utiliza comnmente la Taq polimerasa la cual se activa luego de una
incubacin a altas temperaturas (durante el proceso de desnaturalizacin del ADN). La
temperatura ptima es de 75-80C con una tasa de elongacin de 150 nt/seg/molec. En
un volumen final de 100 l generalmente se usan 1.5-2.5 unidades aunque se puede
variar segn las necesidades del procedimiento. Un exceso de enzima puede producir
productos inespecficos y una cantidad escasa provoca una amplificacin insuficiente.

12
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

No tiene actividad 3-5exonucleasa, solo 5-3, y no puede polimerizar largos

fragmentos de ADN. Altas concentraciones de magnesio inhiben su actividad
polimerizante.
La velocidad de polimerizacin disminuye si es alta la concentracin de dNTPs
(inhibicin por sustrato).
Entre otras enzimas disponibles tenemos la Vent, con actividad 3-5exonucleasa y tiene
mayor estabilidad trmica que la Taq, y la Hot tub que puede sintetizar fragmentos
mayores de 15 Kb.
2- Primers: son oligonucletidos de ADN simple hebra, de 18-28 nucletidos con un
contenido G+C del 40-45%, complementario a la hebra a amplificar. La temperatura de
apareamiento varia de 60-65C (Ta= tm 5C=2(A+T) + 4(G+C) 5C).
No deben formar estructuras secundarias ni contener secuencias complementarias
principalmente en la regin 3 ya que podran formar dmeros resultando una
amplificacin inespecfica. Las concentraciones pueden variar entre 0.05-0.5l.
3- dNTPs: se los utiliza en una concentracin final de 20-200M, aunque en la prctica
rutinaria se usa hasta 40 M ya que si es muy alta, aumenta la frecuencia de errores.
Unen magnesio, por lo que hay que tener en cuenta su concentracin, ya que este catin
es requerido en forma libre durante las reacciones.
4- Buffer de Reaccin: Tris-HCl 10 mM (pH = 8.3 a 20C), 50mM de KCl, 1.5 mM de
MgCl2 y 0.01 % de gelatina a 20 C. El KCl facilita el alineamiento de los primers pero
en altas concentraciones, inhibe la Taq. Estabilizadores enzimticos como BSA,
glicerol, DMSO, detergentes no inicos, en ocasiones pueden ser perjudiciales para la
enzima.
5- Magnesio: acta en el reconocimiento y en la disociacin de los primers con el target
de DNA, especificidad de los productos, fidelidad y actividad enzimtica, etc.
Un exceso podra resultar en la acumulacin de productos no especficos y una baja
concentracin disminuye el rendimiento del proceso. Se aconseja utilizar una
concentracin entre 1.5 - 4mM.
6- Tiempos: el tiempo de desnaturalizacin es de aproximadamente 95C durante 30-40
segundos, varia segn el % de C+G. Temperaturas elevadas y tiempos prolongados
pueden disminuir la actividad de la Taq
7- Nmero de ciclos: El nmero de ciclos depender de las concentraciones iniciales
del target, que luego de la amplificacin generalmente aumenta 3 log. Un exceso de
ciclos puede resultar en productos de amplificacin inespecficos.
8- Secuencia del target a amplificar: no debe ser superior a los 200 - 250 pares de
bases y depender del objetivo del mtodo para su seleccin.

SISTEMAS DE DETECCIN DE PRODUCTOS AMPLIFICADOS

1- Electroforesis en gel de agarosa con tincin de Bromuro de Etidio: es el mtodo
mas simple y mas rpido para detectar los productos amplificados. Se realiza un gel de
agarosa (1,5 - 3%) con bromuro de etidio sumergido en solucin buffer. Una alcuota de
la solucin de reaccin, junto a controles y marcadores de peso molecular, se siembran
en el gel el cual se somete a un campo elctrico. Luego, se observa al UV.
La utilizacin de ste sistema depender de la concentracin final de los productos, ya
que si se pretende observar un patrn de bandas, deber ser mayor que para la
aplicacin de otro sistema, como ser el colorimtrico; porque la sensibilidad de ste
ltimo es superior.
2- Deteccin colorimtrica en microplacas: para esta estrategia de deteccin, se debe
utilizar el primer 3 modificado, es decir, con la insercin de Biotina en su secuencia.
De esta forma todos los amplicones estarn conjugados con Biotina al finalizar la
amplificacin. Una alcuota de la reaccin se agrega a una mezcla de hibridizacin la
cual contendr una Sonda fluoresceinada (secuencia de oligonucletidos
complementaria a una secuencia interna del amplicn) especfica del amplicn que se
13
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

quiere detectar. Posteriormente, una alcuota de la Reaccin de Hibridizacin se agrega

a un micropocillo sensibilizado con estreptavidina, de forma tal que los amplicones
biotinilados quedarn adheridos al soporte slido. Luego, un anticuerpo de ratn anti-
fluorescena conjugado con peroxidasa se unirn a los amplicones fijados al soporte,
mediante su unin a la Sonda especfica fluoresceinada. Finalmente, el sistema se revela
con TMB/H2O2 obteniendo desarrollo de color azul para las muestras positivas que
cambia a color amarillo luego del agregado de H 2SO4.
B

PCR

B
Desnaturalizacin e hibridacin
con sonda genrica
F

Captura y deteccin B
colorimtrica
H2O2
TMBre
O2
TMBox

Amplificacin Deteccin
de -globina viral

3- Southern Blot: El Southern Blot es una tcnica que permite la identificacin de

secuencias especficas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de
hibridacin utilizando sondas especificas.
Luego de la reaccin de PCR, los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor
tamao mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la
electroforesis y sin teir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de
nitrocelulosa a una membrana de nylon.
A continuacin, el filtro se incuba con una sonda marcada, especfica para la
secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de cido nucleico,
DNAds RNAm, que reconocer a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a
travs del reconocimiento de secuencias complementarias de cidos nucleicos.
El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el
reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es
muy ineficiente. Cabe sealar que el nombre de la tcnica Southern Blot deriva en
parte del apellido Southern del investigador que la desarroll y de la palabra en ingls
Blot que significa traspasar.

14
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

INTERFERENCIAS EN LOS PROCEDIMIENTOS ANALTICOS

PREPARACIN DE LAS MUESTRA

1- Interferencias relacionadas a la preparacin de ADN: las preparaciones de ADN
de calidad inferior se caracterizan comnmente por una remocin incompleta de los
inhibidores, de la muestra en s misma (grupo hemo, sus precursores o sus productos
degradados) o su introduccin durante el muestreo (heparina). Cuando el fenol no es
completamente removido se inhiben los pasos de amplificacin enzimtica. En este
caso, el ADN debera ser suspendido en un volumen suficiente de buffer antes de los
procesos de extraccin fenol/cloroformo. Cuando se comienza con pequeas cantidades
de muestras, la prdida de los cidos nucleicos puede ocurrir durante la preparacin.
Tales prdidas pueden ser minimizadas por adicin de un acarreador tARN o glicogen
durante los pasos de preparacin.
El almacenamiento por largo tiempo debe hacerse exclusivamente en soluciones
buffereadas. En agua, los procesos autocatalticos a travs de la depurinacin pueden
resultar en una degradacin completa del ADN despus de unas pocas semanas. El
ADN apropiadamente preparado puede ser almacenado a -20C por aos sin que existan
prdidas considerables en calidad o cantidad.
2- Interferencias relacionadas a la preparacin de ARN: la sensibilidad en la
deteccin de ARN es frecuentemente comprometida por inhibidores que no han sido
eliminados completamente de la muestra. La degradacin de ARN presenta el mayor
inconveniente.
El ARN puede perderse durante la precipitacin alcohlica o durante el almacenamiento
por tiempos prolongados. La prdida, especialmente de polyA-mARN, puede prevenirse
por coprecipitacin con glicogen. Por ser el ARN inestable en agua, el almacenamiento
se realiza en etanol a -20C, siendo recomendable a -70C.

AMPLIFICACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS

15
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

1- Interferencias con la sntesis de cADN: existe diversos factores que afectan la

eficiencia de la sntesis del cADN por la transcriptasa reversa (TR):
- reduccin o ausencia de actividad TR causada por baja calidad de la enzima,
descomposicin de los reactivos o errores en el pipeteo.
- inhibidores de la TR o de la Taq polimerasa
- degradacin del ARN
- contaminacin de ARN con ADN genmico
- actividad ADNasa residual
2- Factores que afectan la PCR: si bien existen muchos factores que pueden conducir
a falsos positivos o negativos, es de particular importancia la seleccin de los pares de
primers. Hay diversos programas de computacin que pueden ayudar a la seleccin de
los primers adecuados, mostrando estructuras secundarias desfavorables, predecir la
formacin de dmeros y aproximar la temperatura de hibridizacin necesaria. Una vez
que los primers son identificados, el laboratorista debera chequear la presencia de
hibridacin cruzada por medio del uso de la base de datos gnica, lo cual se puede
realizar convenientemente usando los programas BLAST disponibles por el National
Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nhi.nlm.gov) . De todas
maneras, los primers seleccionados por medio del softward requieren evaluacin con
respecto a la especificidad y eficiencia de amplificacin en el ensayo.
La temperatura de hibridizacin (annealing) es dependiente de la secuencia, es decir de
la longitud y composicin de bases de los primers. La concentracin de los iones
magnesio se debe determinar por experimentos de titulacin, la cual influye en la
eficiencia de la amplificacin.
3- Contaminaciones:
- Contaminaciones de la fase analtica: como regla general, la contaminacin de la
muestra puede ocurrir en cualquier momento de los distintos pasos de la fase
preanaltica (contaminacin de reactivos, de consumibles y de equipos de laboratorio).
Un origen de contaminacin es la contaminacin cruzada con ADN no amplificado
durante la preparacin simultnea de muchas muestras. La principal contaminacin
consiste en los fragmentos especficos de PCR generados durante las amplificaciones
previas.
Debe considerarse que una contaminacin no detectada por revelado en gel de agarosa
teido con bromuro de etidio puede aparecer si el mtodo utilizado es el de
hibridizacin el cual es ms sensible.
- Eliminacin de la contaminacin: existen diversos mtodos para destruir los
amplicones generados en ensayos previos despus que se detect la contaminacin.
Como alternativa, las reacciones de amplificacin puede ser llevadas a cabo con
mezclas de reacciones en donde dTTP es parcialmente reemplazado por dUTP,
generndose amplicones que contienen uracilos en sus secuencias. Una digestin y
preamplificacin de las mezclas de reaccin con uracil-N-glicosilasa destruira los
contaminantes producidos en ensayos previos.

CONTROLES DE CALIDAD EN LAS TCNICAS MOLECULARES

CONTROL POSITIVO
El control positivo (CP) consiste en un extracto de ADN de un cultivo viral o de una
muestra previamente analizada. Puede utilizarse un plsmido el cual contiene el genoma
completo o parte del mismo del virus target, el cual puede ser amplificado por el mismo
par de primers usado para la muestra. El CP aporta informacin sobre el lmite de
deteccin y especificidad de la PCR realizada.

CONTROL NEGATIVO

16
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

El control negativo (CN) debe realizarse en cada test de PCR que se realice. Incluye
todos los reactivos excepto la muestra procesada y sirve como control de
contaminacin.

CONTROL DE INHIBICIN
El control de inhibicin (CI) se realiza colocando partes iguales de la muestra y del
control positivo en el tubo de reaccin. Aporta informacin en caso de que la muestra de
un resultado No Detectable. En este caso, el CI debe dar un resultado Detectable
descartando as la presencia de inhibidores en la muestra.

CONTROL INTERNO DE AMPLIFICACIN

El control interno de amplificacin (CIA): es una secuencia de ADN no target, presente
en el mismo tubo de reaccin, que se coamplifica junto a la secuencia de ADN target.
Su empleo permite si un resultado No Detectable de la muestra se debe a inhibidores,
fallas en la enzima, fallas en el termociclador, incorrecta preparacin de la muestra; o
simplemente a la ausencia de material a amplificar. El CIA nos permitir conocer si la
secuencia target est presente o no, descartando todas las posibles fallas que puedan
ocurrir.
El CIA consiste en secuencias conocidas de ADN genmico o plasmdico, o de algn
segmento gnico no target que est presente en el material a amplificar. Su deteccin
depender del formato utilizado, debindose utilizar estrategias que generen seales
diferentes, a modo de diferenciar los amplicones del target y del CIA. As, cuando se
detecta por electroforesis en gel de agarosa, el tamao de ambos amplicones deber ser
distintos de modo de ver 2 bandas. En cambio, en sistemas de hibridizacin y posterior
deteccin colorimtrica, se debe disponer de sondas de hibridizacin marcadas con
especificidades para cada amplicn.

Existen 2 formatos de CIA:

1- Competitivos: la secuencia target y el CIA se amplifican con un mismo set de
primers, en el mismo tubo de reaccin y en las mismas condiciones. Algunas veces
puede haber competencia entre ambas secuencia y la cantidad de CIA es critica para el
lmite de deteccin. Hay que considerar que la amplificacin simultnea de dos
secuencias de ADN con los mismos primers puede dar inhibicin o aumento de uno o
ambos productos dependiendo de las concentraciones, tamao, secuencia y estructuras
secundarias de los fragmentos de ADN. Tambin es muy importante el tamao de los
amplicones, los cuales deben ser similares
2- No competitivo: la secuencia target y el CIA se amplifican con diferentes pares de
primers. Son dos reacciones diferentes, con cinticas distintas que deben producirse en
las mismas condiciones. Controlando las concentraciones de los primers y del CIA,
podemos limitar la competencia por los oligonucletidos, y por la Taq polimerasa que
pudiera producirse. Entre las desventajas que posee este formato, podemos mencionar
que la amplificacin del CIA no refleja la amplificacin del target ya que se utilizan
primers distintos; al ser dos reacciones distintas, se deben optimizar bajo las mismas
condiciones. La principal ventaja es que se puede utilizar para diferentes ensayos en el
mismo laboratorio.

Los resultados posibles cuando se emplea el CIA son:

17
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
 Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

Target DNA + - - +
CIA - - + +
Interpretacin Reaccin vlida, la Reaccin no vlida, Reaccin vlida, Reaccin vlida,
concentracin del problemas de muestra no muestra
target es superior a extraccin o detectable detectable
la del CIA. amplificacin

Las recomendaciones generales para el uso ptimo del CIA en el diagnostico por PCR
comprenden:
1- si hay competencia de los primers, se puede utilizar un modelo de PCR multiplex
usando pares de primers diferentes.
2- Los amplicones deben ser fcilmente distinguibles.
3- No es estrictamente necesario que la eficiencia de ambas amplificaciones sean
idnticas.
4- Se deben utilizar como CIA secuencias altamente purificadas y en cantidades
exactamente conocidas, ya que se lo debe utilizar en la misma concentracin que la
secuencia target.

18
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE
Ctedra de Virologa Clnica Ao 2009

BIBLIOGRAFA:
VIROLOGIA MEDICA. Tercera Edicin.Guadalupe Carballal-
Jos Oubia. LIBRERIA EL ATENEO. Buenos Aires. 1998
FIELDS VIROLOGY. Knipe DM et al. 4 Edition
AMPLIFICACIN Y DETECCIN DE CIDOS
NUCLICOS. rea de Virologa-Departamento de Microbiologa.
Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas. UNR. Santa Fe.
Argentina. Ao 2008
Southern, E.M. 1975. J.Mol.Biol. 98:503-517
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) A
TIEMPO REAL. Joseph Costa. Enfermedades Infecciosas en
Microbiologa Clnica. Captulo 12. Ao 2004

19
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE