PROCESO DE FERMENTACION

El proceso de fermentacin implica el crecimiento real del microorganismo y la formacin del

producto bajo agitacin y aireacin, para proporcionar un entorno uniforme y oxgeno adecuado
a la clula para el crecimiento, la supervivencia y la formacin del producto.

Modos de operacin

Un sistema de fermentacin se opera generalmente de uno de los siguientes modos: por lotes,
o continua, y alimentado por lotes. La eleccin del modo de fermentacin depende de la relacin
de consumo de sustrato a biomasa y productos.

Fermentacin por lotes

Este proceso implica una secuencia de operaciones, desde el desarrollo del inculo desde un
cultivo de reserva, hasta la siembra para un fermentador de produccin. Los fermentadores de
siembra y produccin son la principal preocupacin en el desarrollo del proceso de
fermentacin. Pueden estar implicadas varias etapas de siembra, pero la etapa de produccin
se realiza usualmente en un solo fermentador. El tiempo requerido para la fermentacin por
lotes vara de horas a semanas dependiendo de la conversin deseada y de las condiciones
utilizadas. La tasa de crecimiento en la fermentacin por lotes es normalmente no controlada y
es ms alta al inicio.

Productividad de la fermentacin por lotes: se calcula por la concentracin final de biomasa o

producto que se produce dividido por el tiempo completo del lote, que incluye el tiempo de
fermentacin y el tiempo de retorno (tiempo de vaciado, limpieza, esterilizacin y relleno).

Fermentacion continua

La fermentacin continua es un sistema abierto para mantener las clulas en un estado de

crecimiento equilibrado aadiendo continuamente medio fresco y retirando el medio de cultivo
a la misma velocidad. Esencialmente, los dos modos de operacin para la fermentacin continua
son quimiostatos y auxostatos. Los auxostatos utilizados comnmente incluyen turbidostatos,
el pHauxostato y el nutristato.

Quimiostato: Se trata de un proceso continuo de fermentacin realizado en un reactor

de tanque agitado continuo (CSTR). Un CSTR opera manteniendo una velocidad de
crecimiento a travs de la alimentacin continua de un nutriente limitador del
crecimiento y retirando parte del medio a la misma velocidad, logrando as un
crecimiento en estado estacionario.

Auxostato: Un auxostato es una tcnica de cultivo continuo en la que la tasa de dilucin

se regula en base a una indicacin de la actividad metablica del cultivo. Un auxostato
se utiliza a altas tasas de dilucin. Las presiones de seleccin de poblacin en un
auxostato conducen a cultivos que crecen rpidamente.

En un pHauxostato, la velocidad de alimentacin se regula mediante la medicin

y control del pH del medio de fermentacin. Esto slo se puede aplicar si hay un
cambio en el pH como consecuencia del crecimiento de microorganismos.
Turbidostato: El turbidostato controla la velocidad de alimentacin
dependiendo de la densidad ptica (turbidez) del caldo de fermentacin, que es
proporcional a la concentracin de biomasa. En este modo de operacin, el
 cultivo no puede lavarse como en un quimiostato. Este modo de operacin es
ideal slo cuando se opera cerca del mximo crecimiento.

Nutristato: El nutristato implica la regulacin de la velocidad de alimentacin para

mantener la concentracin de sustrato residual durante la fermentacin. Se emplea el
uso de sensores especficos para monitorizar el nivel de sustrato residual durante la
fermentacin

Productividad de la fermentacin continua: se calcula multiplicando la velocidad de dilucin (D)

por la concentracin de producto en la corriente de salida:

Las aplicaciones comerciales comnmente empleadas de cultivo continuo incluyen la levadura

de panadero, el vinagre, el cido glucnico, la acetona, el butanol y los sistemas de fermentacin
con etanol.

Fermentacin por lote alimentado

Utilizada para el desarrollo de productos no asociados al crecimiento, implica dos fases: fase de
crecimiento y fase de produccin. Su fundamento es igualar las demandas del organismo por
nutrientes alimentndolo con una cantidad apropiada de este nutriente.

La fermentacin por lote alimentado es una tcnica entre la fermentacin por lotes y continua,
es un desarrollo ms reciente en sistemas de fermentacin industrial. Ni la fermentacin por
lotes ni la fermentacin continua son adecuadas para productos no asociados al crecimiento.
Con el fin de producir tales productos, en primer lugar, es necesario construir una alta
concentracin de clulas en el crecimiento o la fase de lote, y luego cambiar el metabolismo de
la clula para detener el crecimiento celular mediante la alimentacin de precursores de
productos, el carbono y el oxgeno a una tasa Suficiente para cumplir con los requisitos de
mantenimiento y sntesis del producto. Esencialmente, la fermentacin por lote alimentado
implica dos fases: fase de crecimiento y fase de produccin. Despus de la fase de crecimiento
inicial, uno o ms de los nutrientes se suministran al fermentador mientras que las clulas y el
producto permanecen en el fermentador. La justificacin para la fermentacin por lotes
alimentados es que coincida con la demanda de nutrientes del organismo alimentando una
cantidad apropiada de ese nutriente. Esta demanda es una funcin de la masa celular y el
rendimiento celular sobre el nutriente.

La fermentacin por lote alimentado ofrece la conveniencia de un mejor control sobre las
variaciones de la concentracin del substrato y la diferenciacin del crecimiento, dando lugar a
una mejora de la productividad general con esencialmente el mismo equipo utilizado para la
fermentacin por lotes.

Es adecuada para producir productos o clulas cuando: 1) el sustrato es inhibidor y existe la

necesidad de mantener una baja concentracin de sustrato para evitar que las clulas sean
inhibidas (por ejemplo, cido ctrico, amilasa) y 2) Produccin de productos o de biomasa a bajas
concentraciones de sustrato son altas (por ejemplo, levadura de panadero, produccin de
antibiticos).
Existen dos metodologas en el enfoque de alimentado por lotes, llamadas, lote alimentado por
volumen fijo y lote alimentado con volumen variable (109). En la fermentacin por lote
alimentado de volumen fijo, se alimenta un nutriente alimentario muy concentrado al
fermentador para que no se produzca un aumento apreciable del volumen. La tasa de
crecimiento especfico disminuye con el tiempo y la biomasa aumenta directamente con el
tiempo. En la fermentacin por lote alimentado de volumen variable, hay un aumento en el
volumen debido a la entrada de nutrientes y ausencia de salida. La tasa de crecimiento especfico
depende nicamente de la concentracin del nutriente limitante.

Productividad de la fermentacin por lote alimentado: La productividad de un proceso de

fermentacin es mejor en el modo alimentado por lotes comparado con un modo de operacin
por lotes.

Agitacin

En los biorreactores de tanque agitado, la mezcla y dispersin de aire en el caldo de

fermentacin se consigue mediante agitacin mecnica. La presencia de impulsores en el eje
agitador produce una mezcla uniforme de microorganismos y nutrientes, y la dispersin de aire
en la solucin nutritiva, dando como resultado una masa eficiente y una transferencia de calor.

Los tipos de impulsores utilizados en los biorreactores se clasifican ampliamente basndose en

el patrn de flujo como flujo radial y flujo axial. Los biorreactores de multiples impulsores son
cada vez ms populares debido a la eficiente distribucin del gas, a un mayor tiempo de
residencia en la fase gaseosa, a un aumento de la retencin de gas, caractersticas superiores de
flujo de lquido (flujo de clavijas) y un menor consumo de energa por cada uno de los dos
reactores.

Aireacin

El sistema de aireacin comprende esencialmente un compresor de aire, un filtro de aire y un

rociador. El compresor de aire utilizado para la fermentacin puede ser una unidad de
desplazamiento positivo o una unidad de desplazamiento no positivo, siendo el primero un
compresor alternativo o rotatorio y el ltimo un compresor centrfugo.

En la mayora de las fermentaciones aerobias, el consumo mximo de oxgeno se produce

durante perodos muy cortos cerca del final de la fermentacin. Es posible aumentar la tasa de
absorcin de oxgeno proporcionando altos niveles de velocidad de transferencia de oxgeno
(OTR) que vara con la naturaleza y la escala de la fermentacin.

La tasa de absorcin de oxgeno es la clave para una fermentacin aerbica exitosa, requiriendo
un alto (coeficiente de transferencia de masa volumtrica, sin embargo, proporcionar
niveles ms altos de transferencia de oxgeno por lo general requiere unidades muy potentes,
lo que se suma a los problemas mecnicos y los costos, as como cargas de calor adicionales.

3.5.2.4 Monitoreo y control del proceso

Las variables de control del proceso en un proceso de fermentacin pueden clasificarse

ampliamente como fsicas, qumicas y biolgicas. Las variables fsicas incluyen temperatura,
velocidad del impulsor, velocidad de aireacin y presin. Las variables qumicas incluyen pH,
oxgeno disuelto, dixido de carbono disuelto y potencial redox. Las variables biolgicas incluyen
la biomasa, la tasa de absorcin de oxgeno, la tasa de produccin de dixido de carbono y el
cociente de respiracin.
Una tcnica moderna para el monitoreo y control de bioprocesos usa biosensores. Un biosensor
es un dispositivo que detecta, transmite y registra informacin relativa a un cambio fisiolgico
o bioqumico que da como resultado la generacin de seales electrnicas. La funcin principal
de un biosensor es la integracin de un componente biolgico con un transductor electrnico
para convertir los cambios bioqumicos en una respuesta elctrica cuantificable.

PH: La fermentacin al pH ptimo es esencial para el crecimiento celular y la formacin del

producto. Una sonda de pH esterilizable que funciona sobre la base de un principio
potenciomtrico consiste en un electrodo de vidrio y un electrodo de referencia. El sistema de
electrodos de referencia consiste en un electrodo Ag/AgCl y un electrolito KCl. Un voltaje
constante del sistema de electrodos de referencia es proporcionado por el electrolito.
Basndose en la respuesta de la sonda de pH al controlador de pH, se activa la bomba de cido
o de base para la correccin del pH.

Oxgeno disuelto: El monitoreo de la concentracin de oxgeno disuelto (DO) es esencial, porque

el oxgeno escasamente soluble es uno de los sustratos limitantes para la fermentacin.

Dos tipos de electrodos de DO utilizados en la fermentacin: polarogrfico y galvnico, siendo

el primero ms comnmente utilizado ya que es confiable y resistente a la esterilizacin,
mientras que el segundo no es ampliamente utilizado debido a la escasa estabilidad.

La concentracin de OD en un fermentador puede ser manipulada por dos variables fsicas: la

velocidad del impulsor y la tasa de aireacin. La saturacin de OD (% pO2) para una fermentacin
particular puede ser controlada individualmente, secuencialmente o simultneamente
manipulando las variables basndose en una retroalimentacin desde el controlador de DO. El
controlador compara la desviacin de la seal del electrodo de DO con el punto de ajuste y ajusta
el controlador de velocidad del impulsor o el controlador de flujo de aire para el mantenimiento
de la saturacin de DO.

Otra posibilidad de control de DO en fermentacin existe por la variacin de la concentracin

de oxgeno en el gas mediante la aplicacin de tres vlvulas proporcionales para controlar los
flujos de aire, oxgeno y nitrgeno (125). El electrodo de OD (126) esterilizable por vapor es
ampliamente utilizado para la monitorizacin en lnea de bioprocesos de la concentracin de
oxgeno disuelto durante la fermentacin. Recientemente se ha introducido una alternativa
basada en el apagado de la fluorescencia (127).

Dixido de carbono disuelto: El dixido de carbono disuelto (DCD) es otro indicador del estado
metablico de la clula respiratoria. Se utiliza comnmente para el cultivo de clulas animales
donde la concentracin de DCD ayuda a mantener la saturacin de dixido de carbono durante
el bioproceso. El electrodo DCD funciona segn el principio de cambio de pH de un tampn
electroltico.

Los sensores DCD con tampones de bicarbonato no son esterilizables y tienen las limitaciones
de deriva e interferencia de cambios en la composicin del medio. Se ha introducido un sensor
DCD esterilizable in situ con un colorante fluorescente radiomtrico HPTS (cido 8-
hidroxipireno-1,3,6-trisulfnico) (128).

Anlisis de gas: La composicin de gas de salida del fermentador, particularmente oxgeno y

dixido de carbono, se puede analizar mediante un analizador de gas usando detectores
paramagnticos e infrarrojos, respectivamente. La espectrometra de masas tambin se puede
usar para analizar todos los componentes gaseosos, incluyendo voltiles orgnicos y alcoholes
inferiores, de la corriente de gases de escape (129). Desde el oxgeno hasta el equilibrio del
dixido de carbono a travs del fermentador, se puede determinar la tasa de absorcin de
oxgeno (NUO) o la tasa de produccin de dixido de carbono (RCP).

Potencial redox: El potencial redox del caldo de fermentacin est relacionado con la
disponibilidad general de electrones libres en la solucin. El potencial se basa en el principio de
que cuando se sumerge un electrodo de metal noble (Pt, Au o Ag) en un sistema redox, se
desarrolla un potencial cuya magnitud depende de la relacin de concentracin de oxidacin-
reduccin.

El potencial formado en el electrodo de metal noble es aspirado por un electrodo de referencia,

que tambin est sumergido en la solucin. El valor del potencial es una medida de la
concentracin de agentes oxidantes o reductores. Los valores de redox se encuentran que varan
significativamente con el cambio de pH y se expresan en mV.

El potencial redox disminuye con el aumento del pH de la solucin medida.

La actividad metablica de los microorganismos est fuertemente influenciada por el potencial

redox del medio de cultivo. Supervisin y control del potencial redox antes de la inoculacin
facilita la adicin controlada de agentes reductores para asegurar el intervalo adecuado para el
inicio del crecimiento. El control del potencial redox es una herramienta vital para determinar
su influencia en las vas metablicas de los microorganismos, la utilizacin del sustrato o la
produccin de metabolitos especficos (130).

Concentracin de biomasa: La concentracin de biomasa es una variable biolgica importante,

que indica el progreso de la fermentacin. Los mtodos comunes de determinacin de masa de
clulas fuera de lnea se basan en el peso de clulas secas y el volumen de clulas empaquetadas.
La caracterizacin directa en lnea de poblaciones celulares en biorreactores en trminos de
cambios morfolgicos puede determinarse mediante microscopa in situ equipada con un
analizador de imgenes (131). Los mtodos indirectos en lnea para la determinacin de la
concentracin celular pueden basarse en aproximaciones elctricas o pticas. Elctricamente,
la capacitancia del medio mide la fraccin de fluido retenida por las membranas polarizables
(132).

Opticamente, la masa celular se mide a menudo por absorbancia luminosa (turbidez) o

dispersin (nefelometra) continuamente en los rangos visible e infrarrojo cercano (133).

Las ventajas de los sensores pticos para el monitoreo de bioprocesos son que son muy
sensibles, dan medidas especficas y reversibles, tienen una respuesta rpida y versatilidad, e
implican un fcil mantenimiento. La desventaja del mtodo ptico es que la dispersin y la
absorcin no son linealmente dependientes de la densidad celular y son vulnerables a la
interferencia de partculas y burbujas de gas. Un receptor biolgico, es decir, una enzima, un
microorganismo o un anticuerpo que produce una seal ptica tal como la fluorescencia de
NADH (NADH tras la radiacin UV a 366 nm emite fluorescencia a aproximadamente 460 nm) en
un biosensor ptico (134). La seal es convertida por un transductor electrnico en una seal
elctrica. Tambin se han desarrollado sensores bioluminiscentes, que consisten en una enzima
bioluminiscente y un transductor ptico. La masa celular en cultivos de clulas animales tambin
puede predecirse mediante sensores de software (135). La determinacin directa de biomasa
en lnea en los procesos de fermentacin est limitada por la presencia de slidos en suspensin.
La productividad de un proceso de fermentacin depende especficamente de la concentracin
de biomasa alcanzada. La maximizacin de la concentracin de biomasa a altas densidades de
clulas (136) depende del funcionamiento del fermentador en las condiciones de proceso
controladas ptimas.

Concentracin de sustrato y producto: La determinacin de la concentracin exacta de sustrato

y producto durante la fermentacin es crtica para el mantenimiento de las concentraciones
ptimas de alimento necesarias para una productividad mxima y una utilizacin eficiente del
sustrato. El Anlisis de Inyeccin de Flujo (FIA) es un mtodo para la deteccin en lnea de la
concentracin con un detector adecuado, que puede utilizar amperometra, potenciometra,
NADH-fluorescencia, quimioluminiscencia o espectrofotometra UV / Vis, e implica un tiempo
de anlisis de slo unos minutos. Los biosensores utilizados para la FIA no necesitan condiciones
estriles para el anlisis. Los sistemas FIA inyectan pequeas cantidades de muestras en la
corriente portadora y la probabilidad de crecimiento celular y precipitacin proteica es baja
debido a la alta dilucin (139). Se han utilizado biosensores basados en enzimas para monitorear
y controlar los sustratos y productos involucrados en los procesos de fermentacin con
glutamato y penicilina (140). Se han empleado tcnicas cromatogrficas como cromatografa de
gases, cromatografa lquida de alta resolucin, cromatografa lquida de protenas rpidas y
cromatografa de membrana para el control de proceso de procesos de fermentacin (141). El
producto proteico recombinante se puede determinar espectroscpicamente uniendo el gen
para la protena fluorescente verde (GFP) al gen del producto. La concentracin del producto
puede entonces determinarse analizando la intensidad de fluorescencia de la GFP en el cultivo
(142).

El anlisis espectromtrico de masas de gases como el oxgeno y el dixido de carbono en el gas

de salida abri el camino para la determinacin de gases disueltos como oxgeno, dixido de
carbono, metanol, etanol, butanol y acetona mediante el uso de sistemas de muestreo
adecuados. La precisin del anlisis es mayor que la observada con las sondas en lnea. El
muestreo para el anlisis sin conexin es crucial desde el punto de vista de la esterilidad y la
representacin adecuada del medio. Muchos dispositivos de muestreo basados en
microfiltracin, ultrafiltracin y dilisis se han utilizado en la industria de la fermentacin (144).

Una potente herramienta analtica para el anlisis no invasivo de los metabolitos intracelulares
es la resonancia magntica nuclear (RMN) espectroscopia. La determinacin in vivo de
metabolitos y procesos metablicos por espectroscopia de RMN sirve como herramienta vital
para el anlisis del flujo metablico y la ingeniera metablica (145).

La espectrometra infrarroja con transformadas de Fourier (FTNIR), una tcnica estndar

utilizada en la industria alimentaria, se utiliza ahora en biotecnologa para el monitoreo de
procesos en lnea (146). Las narices artificiales o electrnicas, con sus capacidades de deteccin
de banda ancha, resultan tiles para el monitoreo en lnea tanto de compuestos
aerotransportados como lquidos. Con la ayuda de la tecnologa de nariz artificial puede ser
posible disear dos sensores de agrupamiento para monitorizar las concentraciones de varios
componentes importantes tanto en las fases gaseosa como lquida en el fermentador,
eliminando la necesidad de utilizar un gran nmero de sensores para monitorizar mezclas
complejas ( 147).