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CULTIVOS LACTICOS

La percepcin con respecto a los microorganismos es que son causantes de daos, tanto para los alimentos como
para los humanos , pero as como hay bacterias que afectan a la salud humana, hay otras que adems de ser
inocuas, son necesarias. Dentro de este amplio grupo se encuentran las bacterias lcteas utilizadas en la
elaboracin de queso, yogurt y la mantequilla. Estos microorganismos influyen en el proceso de acidificacin
(disminucin de pH), imprescindible para otorgarle al queso sus caractersticas propias (textura, sabor y
aroma) e impedir el desarrollo de bacterias dainas, en otras palabras producen cambios benficos en los
alimentos, cambios que pueden ser fsicos o qumicos, en general esto hace que adems la vida til aumente. A
estos grupos se les ha denominado cultivos lcticos, cultivo starter o fermentos lcticos que a diferencia de los
potencialmente patgenos proveen caractersticas particulares deseadas en forma ms segura y predecible.

Las bacterias del cido lctico (BAL), o tambin bacterias cido lcticas y cultivos lcticos -por razn de sus
caractersticas al ser procesadas y multiplicadas para su utilizacin como grupo- comprenden un caldo de
bacterias fermentadoras y productoras de cido lctico, funcin por la que son usadas en la industria para darle
ciertas cualidades a los alimentos y protegerlos contra la accin de otros organismos dainos.

METABOLISMO DE LAS BACTERIAS LACTICAS.

Existen dos vas bsicas de fermentacin de hexosas


que son usados para la clasificacin de los gneros de
BAL. En condiciones de exceso de glucosa y un
limitado uso de oxgeno, las BAL homolcticos
transforman un mol de glucosa a travs de la va
glucoltica de Embden-Meyerhof-Parnas para formar
dos moles de piruvato. El balance redox intracelular
se mantiene por la oxidacin de NADH con la
concomitante reduccin del piruvato en cido lctico.
Este proceso genera dos moles de ATP por cada mol
de glucosa consumida. Los representantes de las BAL
homolcticas incluyen Lactococcus, Enterococcus,
Streptococcus, Pediococcus y el grupo I Lactobacilli.

Las BAL heterofermentativas utilizan la ruta de la


pentosa fosfato, en la que un mol de glucosa-6-fosfato
es inicialmente deshidrogenada a 6-fosfogluconato y
luego descarboxilada para producir un mol de CO2.
El resultante pentosa-5-fosfato es disociada en un
mol de fosfato de gliceraldehdo y un mol de
acetilfosfato. El fosfato de gliceraldehdo se
metaboliza luego en cidolctico, tal como en la reaccin de los homofermentadores, con el acetilfosfato
reduciendose a etanol va los intermediarios acetil-CoA y acetaldehido. Teorticamente, los productos finales
(incluyendo el ATP) son producidos en cantidades equimolares a partir del catabolismo de un mol de glucosa. Las
BAL obligatoriamente heterofermentativas incluyen: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, y el grupo III
Lactobacilli.
BAL HOMOFERMENTATIVAS.

Lactococcus:
Lactococcus es un gnero de bacterias del cido lctico formado por cinco
especies pertenecientes anteriormente al gnero Streptococcus y otras. Las
bacterias de este gnero son tpicamente esfricas u ovoides, de 0,5 a 1,2 m
por 0,5 a 1,5 m, y se agrupan en pares o en cadenas cortas. Son no
formadoras de esporas y no mtiles.
La especie tipo del gnero es L. lactis con dos subespecies lactis y cremoris.
Lactococcus difiere de otras bacterias cido lcticas por su tolearancia al pH,
sal y temperatura de crecimiento. Lactococcus se emplea en la industria lctea
en la manufactura de fermentados como quesos o yogures. Puede usarse en
cultivos de arranque de cepas nicas o en cultivos de distintas cepas o con
otras bacterias cido lcticas como Lactobacillus y Streptococcus.

Enterococcus.

Enterococcus es un gnero de bacterias del cido lctico del divisin


Firmicutes. Los miembros de este gnero eran clasificados como Streptococcus
Grupo D hasta 1984 cuando los anlisis de ADN genmicos indicaron que un
gnero separado era ms apropiado. Los enterococos son coco Grampositivos
que se presentan en parejas (diplococos), siendo difcil distinguirlos de
Streptococcus slo en base a sus caractersticas fsicas. Dos de las especies son
comensales en el intestino humano: E. faecalis y E. faecium. El enterococo es
un organismo facultativo anaerobio, esto es, prefiere usar oxgeno, aunque
sobrevive bien en su ausencia. Tpicamente exhiben gamma-hemolisis en agar
sangre de cordero.

Pediococcus.

Pediococcus es un gnero de bacterias del cido lctico Gram-positivas de la


familia Lactobacillaceae. Normalmente se presentan en pares o ttradas,
siendo las nicas bacterias del cido lctico con forma de coco que se dividen a
lo largo de dos planos de simetra. Son bacterias puramente
homofermentativas, usualmente consideradas contaminantes de la cerveza y
vino aunque en algunas cervezas tales como la de tipo Lambic es deseable su
presencia. Ciertos Pediococcus producen diacetil, lo que proporciona un aroma
a mantequilla o butterscotch a algunos vinos (tales como Chardonnay) y unos
pocos tipos de cerveza. Las especies de Pediococcus a menudo se utilizan en el
proceso de conservacin del forraje denominado ensilado.
Lactobacillus.

Lactobacilo, Lactobacillus o bacteria del cido lctico es un gnero de


bacterias Gram positivas anaerobias, denominadas as debido a que la
mayora de sus miembros convierte lactosa y otros monosacridos en
cido lctico. Normalmente son benignas e incluso necesarias, habitan en
el cuerpo humano y en el de otros animales, por ejemplo, estn presentes
en el tracto gastrointestinal y en la vagina. Muchas especies son
importantes en la descomposicin de material vegetal. La produccin de
cido lctico hace que su ambiente sea cido, lo cual inhibe el crecimiento
de bacterias dainas. Algunas especies de lactobacillus son usadas
industrialmente para la produccin de yogur y otros alimentos
fermentados.

BAL HETEROFERMENTATIVAS.

Leuconostoc.
Leuconostoc es un gnero de bacterias del cido lctico Gram-positivas de la
familia Leuconostocaceae. Las
especies de Leuconostoc tienen generalmente forma de cocoide ovoide y a
menudo forman cadenas. Son resistentes intrnsicamente a la vancomicina y
catalasa-negativos (lo cual los distingue de Staphylococcus). Son
heterofermentativos, capaces de producir dextrn a partir de la sacarosa.
Algunas especies son tambin capaces de producir infecciones a los seres
humanos. Debido a que estas enfermedades son raras, los kits de
indentificacin comerciales estndard a menudo no identifican estos
organismos. Leuconostoc, se utiliza para la fermentacin del repollo en la
elaboracin de chucrut. Durante este proceso, los azcares de las coles
frescas son transformadas en cidos lcticos que le dan un sabor agrio y
permiten que se conserven en buenas condiciones.

Oenococcus.

Oenococcus es un gnero de bacterias Gram-positivas de la familia


Leuconostocaceae. La primera especie conocida de este gnero fue
Oenococcus oeni (que era conocida como Leuconostoc oeni hasta 1995).
En 2006. Oenococcus se descubri unas segunda especie, Oenococcus
kitaharae.
Weissella es un gnero de bacterias Gram-positivas de la familia
Leuconostocaceae. La morfologa de weissellas vara de clulas esfricas o
lenticular a barras irregulares.
LEVADURAS
Las levaduras se han definido como hongos microscpicos, unicelulares, la mayora se multiplican por gemacin
y algunas por escisin. Este grupo de microorganismos comprende alrededor de 60 gneros y unas 500 especies.
Histricamente, los estudios sobre microbiologa enolgica se han centrado en las levaduras pertenecientes al
gnero Saccharomyces, que son las responsables de la fermentacin alcohlica. Anteriormente se crea que slo
ellas participaban en el proceso de produccin de alcohol, sin embargo, las diferentes levaduras no-
Saccharomyces, especialmente durante la fase inicial de la fermentacin, pueden influir en las propiedades
organolpticas de las bebidas alcohlicas. El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue
reconocido sino hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teoras cientficas de esa poca reconocan la presencia de stas
en la fermentacin alcohlica, pero eran consideradas como compuestos qumicos complejos, sin vida. Esta era la
teora mecanstica liderada por los qumicos alemanes von Liebig y Whler. Luis Pasteur, propuso la teora
vitalstica y demostr que las clulas viables de levaduras causan fermentacin en condiciones anaerobias;
durante la cual el azcar presente en el jugo es convertido principalmente en etanol y CO2.

Las levaduras son los agentes de la fermentacin y se encuentran naturalmente en la superficie de las plantas, el
suelo es su principal hbitat encontrndose en invierno en la capa superficial de la tierra. En verano, por medio de
los insectos, polvo y animales, son transportados hasta el fruto, por lo que su distribucin se produce al azar.
Existe un gran nmero de especies que se diferencan por su aspecto, sus propiedades, sus formas de reproduccin
y por la forma en la que transforman el azcar. Las levaduras del vino pertenecen a varios gneros, cada uno
dividido en especies. Las especies ms extendidas son Saccharomyces ellipsoideus, Kloeckera apiculata y
Hanseniaspora uvarum, las cuales representan por s solas el 90% de las levaduras utilizadas para la fermentacin
del vino. Como todos los seres vivos, tienen necesidades precisas en lo que se refiere a nutricin y al medio en
que viven. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan una alimentacin apropiada rica en azcares, elementos
minerales y sustancias nitrogenadas, tienen ciclos reproductivos cortos, lo que hace que el inicio de la
fermentacin sea tan rpido, pero as como se multiplican, pueden morir por la falta o el exceso de las variables
mencionadas.

CARACTERSTICAS GENERALES

Las levaduras se clasifican en base a sus caracteres morfolgicos, aunque para algunos microbilogos, sus
propiedades fisiolgicas tienen mayor importancia. La mayora de las levaduras son hongos unicelulares sencillos
microscpicos, la mayora se reproducen asexualmente por gemacin, y otras especies lo hacen por fisin
mltiple. Las levaduras que pueden reproducirse sexualmente se conocen como verdaderas, este proceso
implica la formacin de ascosporas, sirviendo la propia levadura como asca, de aqu que ellas se clasifican como
Ascomicetos; por el contrario las falsas que no producen ascosporas, pertenecen a los hongos imperfectos.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS

Los caracteres morfolgicos de las levaduras se determinan mediante su observacin microscpica. Adems, los
criterios morfolgicos se basan en el modo de reproduccin vegetativa de la morfologa celular, de la formacin
de pseudomicelio y de micelio.

La forma de la levadura puede ser desde esfrica a ovoide, en forma de limn, piriforme, cilndrica,
triangular, e incluso alargada formando un verdadero micelio o un falso micelio. Tambin se diferencan en
cuanto a su tamao, miden de 1-10 um ancho por 2-3 um de longitud.
Son partes observables de su estructura, la pared celular, el citoplasma, las vacuolas, los glbulos de grasa, y
los grnulos, los cuales pueden ser metacromticos, de albmina o de almidn. Para poder observar el ncleo
es preciso utilizar tinciones especiales.
La estructura celular es de tipo eucaritico, pero sin sistema fotosinttico. La pared rgida, se caracteriza por
la presencia, en su composicin, de dos polisacridos: manano y glucano. Algunas levaduras producen una
cpsula constituida por fosfomanos. El ncleo est rodeado de una membrana que persiste durante la divisin
celular. El nmero de cromosomas es variable de unas a otras. Las levaduras en ningn caso son mviles.

REPRODUCCIN

La mayora de las levaduras se reproducen por gemacin


multicelular o por gemacin polar, que es el mecanismo en el cual
una porcin del protoplasma sobresale de la pared de la clula y
forma una protuberancia, la cual aumenta de tamao y se
desprende como una nueva clula de levadura. En las levaduras
que forman pelcula, la yema crece a partir de una prolongacin
tubuliforme de la clula madre. El material nuclear replicado se
reparte entre la clula madre y la clula hija (Frazier y Weathoff,
1998).
La reproduccin sexual de las levaduras verdaderas
(Ascomycotina) da lugar a la produccin de ascosporas,
desempeando la funcin de asca, la propia clula de la levadura.
En la mayora de las especies de levaduras verdaderas, la formacin de ascosporas tiene lugar tras la conjugacin
de dos clulas, aunque algunas pueden producir ascosporas sin que exista conjugacin previa, teniendo lugar
despus la conjugacin de las ascosporas. Tanto el nmero y el aspecto de esporas por asca, son tpicos de cada
especie de levadura, y se pueden diferenciar por su color, rugosidad o lisura de su pared y por su forma
(redondeada, ovalada, arrionada, falciforme, forma de saturno o de sombrero, hemisfrica, angular). Las clulas
de algunas levaduras se transforman en clamidosporas mediante la formacin de una gruesa pared alrededor de la
clula, tal como ocurre, por ejemplo, en las especies de los gneros Candida, Rhodotorula y Cryptococcus

CARACTERSTICAS DE CULTIVO
En la mayora de los casos, el crecimiento en masa de las
levaduras no resulta apropiado para su identificacin. En
los cultivos con agar, es difcil diferenciar las colonias de
levaduras de las colonias bacterianas, por lo que la
observacin microscpica es la nica forma segura que
existe para poderlas diferenciar. La mayora de las colonias
jvenes de levaduras son hmedas y algo mucosas, y es
posible que tengan aspecto harinoso. La mayora de las
colonias son blanquecinas, algunas tienen un color crema o
rosado. Algunas colonias cambian poco de aspecto cuando
envejecen, otras se secan y se vuelven rugosas. Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad
metablica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un lquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en
forma de pelcula, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de pelcula. Las
levaduras fermentativas suelen crecer en toda la masa del lquido y producen dixido de carbono.

PROPIEDADES FISIOLGICAS

Las distintas especies de levaduras pueden ser muy diferentes en cuanto a su fisiologa, la mayora necesitan ms
humedad para crecer y desarrollarse. El intervalo de temperatura de crecimiento de las levaduras es en general,
parecido al de los hongos, con una temperatura ptima en torno a los 25 a 30C y una temperatura mxima en
torno a los 35 a 47C. Una reaccin cida del medio, prxima a un pH de 4 a 4.5, estimula el crecimiento de la
mayora de las levaduras, mientras que en medios bsicos, no crecen bien a no ser que se hayan adaptado a los
mismos, crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque
lentamente, en anaerobiosis. En general, los azcares son la fuente energtica ms apropiada para las levaduras,
aunque en las oxidativas, por ejemplo, las formadoras de pelcula oxidan los cidos orgnicos y el alcohol, y
tambin contribuyen en la produccin de los sabores o bouquet de los vinos

CLASIFICACIN E IDENTIFICACIN

La clasificacin de las levaduras es compleja, no obstante el


desarrollo de nuevas tcnicas basadas en Biologa
Molecular, ha permitido separar o reagrupar las especies.
Las levaduras pertenecen al Reino Fungi y dentro de l a la
divisin Eumicota que agrupa a los hongos verdaderos. En
esta divisin, las levaduras se incluyen en 2 de las 5
subdivisiones de los Eumicetos (Tabla 1), la Ascomycotina
representada por las levaduras capaces de producir
ascosporas, llamadas por ello esporgenas, y la
Deuteromycotina representadas por las levaduras incapaces
de formar esporas llamadas no esporgenas. Los gneros de
las levaduras esporgenas englobados todos ellos en la
familia Saccharomycetaceae, se distribuyen en 3
subfamilias. Los gneros de las levaduras no esporgenas constituyen la familia Cryptococcaceae. Adems las
levaduras pueden ser clasificadas por debajo de los taxones gnero y especie, en subespecies y variedades, que a
menudo adquieren rango de especie tras nuevas revisiones taxonmicas, o varias especies son unificadas en una
sola como subespecies de la misma, con lo que la clasificacin se complica an ms y se incrementa el nmero
de sinonimias. Los principales criterios utilizados para la clasificacin e identificacin de las levaduras son los
siguientes:

1. Produccin de ascosporas.
2. Aspecto de las clulas vegetativas: forma, tamao, color, inclusiones.
3. Forma de reproduccin asexual.
4. Produccin de micelio.
5. Forma de pelcula en medio liquido.
6. Color de la colonia.
7. Propiedades fisiolgicas: produccin de cido, actividad uresica.
8. Caracterizacin bioqumica (Frazier y Weathoff, 1998; Hayes, 1993):
- Fermentacin de glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y
rafinosa.
- Crecimiento en 18 sustratos carbonados:
Pentosas: D-xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, L-ramnosa.
Hexosas: D-glucosa.
Disacridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa.
Trisacridos: rafinosa.
Polisacridos: almidn.
- Asimilacin de nitratos.
- Crecimiento a 37C.
- Crecimiento en medio con vitaminas.
- Produccin de almidn.

SELECCIN DE LEVADURAS

El estudio de la dinmica, cuantificacin y composicin de la


microbiota responsable de las fermentaciones espontneas, ha
mostrado diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, en
las levaduras aisladas en una misma zona vitivincola e incluso
dentro de los depsitos de una misma bodega. Las causas de
esta variabilidad pueden ser: cambios en las tcnicas de
aislamiento, cambios en las condiciones climticas, etc. Por
tanto, la necesidad de asegurar la fermentacin alcohlica, as
como la tipicidad y reproducibilidad de los vinos, requiere cada
vez ms, el uso de cultivos iniciadores. Las levaduras
seleccionadas se han utilizado con excelentes resultados en muchos pases, obtenindose productos finales de
calidad ms uniforme que los que se producan con las fermentaciones espontneas. Este ltimo punto es el
que genera el debate acerca de la utilizacin o no de inculos, ya que garantizan repetitividad a expensas de
perder algo de complejidad en el producto. A pesar de que existen levaduras comerciales para realizar las
fermentaciones, es ms efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde se van a
utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que las levaduras que se
encuentran en una microzona son: especficas del rea, totalmente adaptadas a las condiciones climticas de la
zona y a la materia prima, es decir al mosto a fermentar, son responsables al menos parcialmente, de las
caractersticas nicas de los productos obtenidos.