Mtodes rpids per la detecci de

patgens alimentaris

Teresa Aymerich
IRTA.
IRTA Programa
P de
d Seguretat
S t t Alimentaria
Ali t i

Departament dAgricultura,
Ramaderia, Pesca, Alimentaci i Medi
Natural

Jornada tcnica, MTODES RPIDS EN MICROBIOLOGIA ALIMENTRIA

Monells, 28 de mar 2012

Seguridad Alimentaria

El consumidor aprecia un producto de calidad, La seguridad alimentaria es el objetivo

sabor, textura y un grado de frescura prioritario a nivel mundial (productores,
adecuados, nutritivos y convenientes. autoridades competentes y consumidores)

Uno de los objetivos fundamentales de la legislacin alimentaria es asegurar un nivel

elevado de proteccin de la salud pblica

Los productos alimenticios no deben contener microorganismos ni sus toxinas o

metabolitos en cantidades que supongan un riesgo inaceptable para la salud
humana.

El Reglamento EU 178/2002 estableci los principios bsicos de seguridad

alimentaria en virtud de los cuales no se comercializarn alimentos que no sean
seguros.
Se cre la EFSA como unidad independiente para la evaluacin del riesgo
con base cientfica

Se publicaron los reglamentos relacionados incluidos en el paquete de

higiene donde se constat:
9La responsabilidad del productor/productores de asegurar el producto
(EU 852/2004, EU 853/2004) hasta el final de su vida til.

9La obligacin de disponer de un sistema de autocontrol preventivo basado

en el anlisis de peligros y puntos crticos de control (APPCC) que asegure
la inocuidad del alimento desde su produccin hasta el consumidor. La
obligacin de retirar del mercado alimentario los alimentos que no sean
seguros.

9La responsabilidad de las autoridades sanitarias competentes de auditar,

verificar que los productores cumplan y dispongan de sistemas de
autocontrol efectivos que aseguren el objetivo propuesto (854/2004 y EU
882/2004)
 (A)
(carne fresca de pollo/pavo)
(B*) (huevos, carne pollo y cerdo)
ecreto 1940/2004 (Directiva
Report EFSA 2012, en base al Programa de vigilancia de las

(carne de cerdo y derivados)

(A) (carne vaca y ternera)

(productos RTE pescado y carne).

CE
zoonosis por aplicacin del Real De
2003/99/C

(animales salvajes)

(animales salvajes)

http://www.efsa.europa.eu/

EFSA (2012)

QUEDARIA MOLT BE ALGUN GRAFIC D?EVOLUCIO EN ELS ANYS???

EFSA (2012)
 eguretat Alimentaria

Fuet 17,6
29,4 Salmonella spp.
Mezcla crnica 41,2 L. monocytogenes
Tripa 17,6
5,9
Mesa 59
5,9
Resultados propios IRTA- Se

Embutidora N muestras evaluadas:

23,5
Mezcladora Fuet, 17
Mezcla crnica, 17
Picadora 10,0 Tripa, 17
Mesa, 17
Cuchillos 11,1 Embutidora, 17
Mezcladora, 10
Cmara fra 10,0 Picadora, 10
Cuchillos, 9
0 10 20 30 40 50 Cmara fra, 10
%

Listeria monocytogenes ubicua

en el ambiente fabril

relativo a Criterios microbiolgicos en los alimentos

1.Para contribuir a la proteccin de la salud pblica, es necesario establecer criterios

microbiolgicos armonizados y con base cientfica que eviten diferencias de interpretacin, y
que nos permitan asegurar que los alimentos no contienen microorganismos ni sus toxinas en
cantidades inaceptables que puedan daar su salud.

2.Los explotadores de las empresas alimentarias deben velar por que los productos alimenticios
cumplan los criterios microbiolgicos pertinentes establecidos en el anexo I en cada fase de
produccin, transformacin y distribucin de los alimentos, incluida la venta al por menor,

Los criterios de higiene, que indican el funcionamiento aceptable del proceso de

produccin; establece un valor de contaminacin indicativo por encima del cual se
requieren medidas correctoras del plan APPCC para mantener la higiene del proceso
conforme a la legislacin alimentaria.

Y los criterios de seguridad alimentaria que definen la aceptabilidad de un producto o

un lote de productos alimenticios y es aplicable a los productos comercializados; durante
toda la vida til de los productos y que puedan respetarse en condiciones razonablemente
previsibles de distribucin, almacenamiento y utilizacin.

Para ms informacin consultar en EUR-Lex

El acceso al Derecho de la Unin Europea
http://eur-lex.europa.eu/es/index.htm.

En general para todo tipo de

alimentos Ausencia
(n=5) 25 g/ml

Excepto usos mdicos especiales y

formulas infantiles ((n=30))

Carne fresca de aves de corral se especfica Salmonella

typhimurium (1,4,[5],12:i:-.) y Salmonella enteritidis

Carne separada mecnicamente (CSM) Ausencia

(n=5) 10 g
 Alimentos listos para el consumo destinados
a los lactantes y para usos mdicos
especiales (*)
Antes que el alimento haya dejado
el control inmediato del explotador
de la empresa o durante la vida til

(n=10 c=0) Ausencia

25 g/ml

Antes que el alimento haya dejado

Alimentos listos para el consumo que el control inmediato del explotador
pueden favorecer el desarrollo de L. de la empresa
monocytogenes que no sean los
monocytogenes,
(n=5 c=0)
destinados a los lactantes ni para usos
mdicos especiales En productos comercializados
durante su vida til

Alimentos listos para el consumo que no 100 CFU/g

pueden favorecer el desarrollo de
L.monocytogenes, que no sean los
destinados a los lactantes ni para usos En productos comercializados
mdicos especiales (*) durante su vida til

(n=5 c=0)

Formulas infantiles deshidratadas y

alimentos dietticos deshidratados para
Ausencia
usos mdicos especiales en menores de
6 meses 10 g
(n=30)

Enterotoxinas estafiloccicas
Quesos, leche en polvo y suero en polvo, tal
como se contempla en los criterios para los No detectadas en 25 g
estafilococos coagulasa positivos en los
criterios de higiene de estos productos
(n=5)

Histamina
1. Productos de la pesca procedentes de
Rango de aceptacin producto
especies de pescados asociados a un alto n=9 c=2
contenido de histidina (17)
n M
100 mg/kg 200 mg/kg
2. Productos de la pesca sometidos a
tratamiento de maduracin enzimtica en 200 mg/kg 400 mg/kg
salmuera, fabricados a partir de especies de
pescados asociados a un alto contenido de
histidina (17)

(17 ) Particularmente especies de pescados de las familias siguientes: Scombridae, Clupeidae, Engraulidae,
Coryfenidae, Pomatomidae y Scombresosidae.
 Mtodos analticos para la deteccin y cuantificacin de
microorganismos patgenos

CE 2073/2005 (art. 5)

Conforme a lo dispuesto en el artculo 4 del Reglamento (CE)

n852/2004, los explotadores de las empresas alimentarias deben
cumplir los criterios microbiolgicos. Ello implica efectuar pruebas para
comparar con los valores establecidos para los criterios, mediante la
toma de muestras, la realizacin de anlisis y la aplicacin de acciones
correctoras,
t de
d conformidad
f id d con la l legislacin
l i l i alimentaria
li t i y las
l
instrucciones de la autoridad competente

Los resultados de las pruebas dependen de los mtodos analticos

utilizados y, por lo tanto, cada criterio microbiolgico debe asociarse a un
mtodo de referencia determinado.

Mtodos de referencia para la deteccin y/o cuantificacin de

patgenos alimentarios.

Alimentos y productos para alimentacin animal:

ISO 6579:2002
1.Muestra
Heces de animales y muestras ambientales de la
Salmonella
produccin primaria : ISO 6579:2002/Amd1:2007
2.Pre-
enriquecimiento
(deteccin)
Leche y Productos lcteos : ISO 6785:2001
3.Enriquecimiento
selectivo Agua: ISO 19250:2010

4.Deteccin Deteccin de L. monocytogenes: ISO 11290-1:1996

L. monocytogenes (Amd 1:2004)

5.Confirmacin* Enumeracin de L. monocytogenes: ISO 11290-2:1998

(Amd 1:2004)

Total
5-7 das Deteccin de Cronobacter spp. En leche y productos
Cronobacter spp
lcteos ISO/TS 22964:2006

Mtodos analticos alternativos de aplicacin

segn CE 2073/2005

No obstante, conviene que los explotadores de empresas

alimentarias puedan usar mtodos analticos diferentes de los
mtodos de referencia, en particular mtodos ms rpidos, siempre
que estos mtodos alternativos produzcan resultados equivalentes.

Se autorizar el uso de mtodos analticos alternativos cuando los

mtodos estn validados con respecto al mtodo de referencia
establecido y si se utiliza un mtodo comercial patentado, deber estar
certificado por terceros conforme al protocolo de la norma EN/ISO
16140 u otros protocolos similares internacionalmente aceptados.

Si el explotador de la empresa alimentaria deseara utilizar mtodos

analticos distintos a los validados y certificados tal como se ha
descrito en el prrafo anterior, los mtodos debern validarse
conforme a protocolos internacionalmente aceptados y su uso deber
ser autorizado por la autoridad Competente.
 Adaptados a los requerimientos de la produccin industrial que
sean:

Analticamente equivalentes al mtodo tradicional de referencia

y validados. Algunos incluso aportan un valor analtico aadido
mejorando :

9 en especificidad, exactitud y sensibilidad (cualitativo)

9 en linealidad, exactitud y sesgo ( cuantitativo)

Ms rpidos en anlisis y/o respuesta

Ms simples en ejecucin y/o automatizacin
Miniaturizacin

Reduccin de coste en personal y/o tiempo

La rapidez del anlisis incide de forma importante en la

Los mtodos alternativos pueden aplicarse
tanto en laboratorios de autocontrol como en
laboratorios de control oficial de alimentos.
deteccin precoz de anomalas y facilita y acelera la
toma de decisiones en temas tan importantes como:
-Gestin de los ciclos de produccin.
-Gestin de estocs y reduccin del inmovilizado.
-Liberacin positiva del producto evitando
retiradas del producto en el mercado

Seguridad alimentaria y confianza de los

consumidores

Se han desarrollado diferentes tipos de mtodos alternativos que pueden aplicarse

para optimizar alguna de las fases de los mtodos de referencia:
9 de deteccin y/o cuantificacin.
9 y/o confirmacin de resultados .

Los mayores desarrollos:

Mdios cromognicos en cuantificacin.
Variedad de protocolos y principios bsicos en deteccin.

MEDIOS DE CULTIVO CROMOGNICOS ChromID, RAPID, Precis, COMPASS,

FA: 4/5 DETECCIN CHROM agar SMS, SESAME
FA: 2/3 RECUENTO
1.Muestra
TESTS BIOQUMICOS MINIATURIZADOS
FA: 5.
2.Pre-
enriquecimiento Manuales API, Microgen

Automticos Vitek
3.Enriquecimiento
selectivo INMUNOENSAYOS
Manuales Oxoid Rapid test, Transia, Reveal,
FA:4.5. Tecra, kit Locate, Bioline, Rapidyme.
4.Deteccin

Automticos
5.Confirmacin* VIDAS, Transia.
MTODOS MOLECULARES
FA:4.5
Hibridacin molecular LumiProbe, Accuprobe, GeneQuence

PCR a tiempo Real BAX System, GeneDisc, IQ-Check,

FA:fase de aplicacin
ADIAFOOD, Assurance GDS
 Casa comercial Colonia Salmonella OtrasEnterobacterias

Incoloras/ azul-verdoso
RAPID' Salmonella Agar Bio-Rad Laboratories malva

Salmonella Precis TM
(Inhibigen Technology) Oxoid malva Incoloras/ azul-verdoso

BBLTM CHROMagarTM Salmonella BD Diagnostics malva Incoloras/ azul-verdoso

COMPASS Salmonella agar

Biokar Diagnostics malva Incoloras/ azul-verdoso
(SESAME Salmonella Test)

RAPID Precis TM CHROMagarTM COMPASS

Actividad C8-esterasa: colonia malva/ -glucosidasa: colonia azul-verdosa

L.monocytogenes L.ivannovii L.innocua

Agar Listeria ALOA (AES Chemunex) Colonia azul+halo Colonia azul+halo Colonia azul+nohalo

Actividad - Estria azul+ amarillo+halo Estria azul+ amarillo

Agar Listeria ALOA confirmacin Estria azul+ halo
glucosidasa:
colonias azules
Actividad
Fosfolipasa C:
halo Chrom ID Ottaviani Agosti (Biomerieux) Coloniaazul+halo Coloniaazul+halo Coloniaazul+nohalo

Oxoid Cromognico OCLA Coloniaazul+halo Coloniaazul+halo Coloniaazul+nohalo

CHROMagar Listeria Coloniaazul+halo Coloniaazul+halo Coloniaazul+nohalo

CHROMagar identificacin Listeria Coloniamalva Coloniablanca N.A.

R&F L. monocytogenes (Biosynth) Coloniaazul Coloniaazul Coloniablanca

R&F cromognico L. monocytogenes Coloniafluorescente Colonianofluorescentesin

N.A.
Permiten confirmacin (Biosynth) (366nm)+haloamarillo halo
reducir el
tiempo de
deteccin RAPID L. monocytogenes (Bio-Rad) Coloniaazulsinhalo Coloniaazul+haloamarillo Colonia blanca
del mtodo
de referencia
ISO/TS 11133-1:2009 de preparacin de medios de cultivo

Manuales
1.Muestra

2.Pre- Rapidec L.mono (AFNOR, Biomerieux)

enriquecimiento
Galerias API:API Listeria/ API 20-E Enterobacterias,
Biomerieux
3.Enriquecimiento
selectivo
Microgen Listeria ID, con test para hemlisis (AOAC)

4.Deteccin

Automatizados

VITEK Sistema automtico de

identificacin microbiana. Automatiza
todas las etapas necesarias para la
VITEK realizacin de las pruebas de
identificacin y antibiograma con las
(Biomerieux) tarjetas VITEK. Est constituido por un
inoculador/sellador, un incubador/lector
ptico, un ordenador y una impresora.
 Caractersticas y ventajas
1.Muestra Tcnica Principio Contaminacin Lmite deteccin Tiempo
mnima inicial CFU/ml ejecucin
ensayo
2.Pre-
enriquecimiento LFD Inmunoensayo con flujo lateral 106 - 1-2 das
ELISA/ Inmunoensayoenzimatico con 105-106 CFU/ml
Deteccin colorimtrica
3.Enriquecimiento
3 Enriquecimiento
selectivo
ELFA Ensayo inmunoenzimtico tipo 2-3 cfu/muestra 104 CFU/ml 1-2 das
sandwich con deteccin
fluorescente
Hidridacin Deteccin molecular colorimtrica 1 cfu/muestra 104-105 CFU/ml 1-2 das
cidos luminomtrica a nivel de rRNA,
nucleicos mediante un sistema de doble
sonda

PCR Deteccin molecular fluorescente 1 cfu/muestra 102-104 CFU/ml 1-2 das

de ADN amplificado

Si automatizacin, permite procesado simultneo de un gran n de muestras despus del

enriquecimiento y/o para confirmacin de colonias con reactivos listos para el empleo.

1.Muestra
Inmunocromatografa

Membrana porosa (nitrocelulosa)

con protena de captura del analito
(anticuerpo) inmovilizadas

Se forma lnea visible en la ventana

de
d llectura
t : nanopartculas
t l d de oro o
ltex coloreado conjugadas al
anticuerpo

Lectura en varios minutos

tras el enriquecimiento de la muestra.
(10-25 min)

Mtodo Casa comercial Diana

LFD
Singlepath EMD Chemicals/Merck Salmonella spp./ L.monoyctogenes/ E.coliO157
1.Muestra
DuPont Lateral Flow Systems Qualicon Salmonella spp. / Listeria spp./ E.coli0157

RapidChek SELECT SDIX Salmonella spp. / Listeria spp. / E.coli0157

VIP (Gold) Biocontrol Salmonella spp. / Listeria spp/E.coli EHEC/
Campylobacter.
TRANSIA CARD Biocontrol Salmonella spp. / Listeria spp./ E.coli0157
Reveal Neogen Salmonella spp.
spp / Listeria spp.
spp

Kits asociados a medio

enriquecimiento muestra
Ej: 8,5 h E. coli EHEC, 18-48h
Salmonella, Listeria

VIP (Gold) REVEAL 2.0 Salmonella.

Visual Immuno Precipitate
 Se basa en la deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida
mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reaccin
enzimtica, cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido
espectrofotomtricamente

ELISA sndwich

Mtodo Casa comercial Diana

ELISA
Manuales

RAPIDYME ELISA BIO ART NV/SA Salmonella spp. / Listeria spp.

LOCATE R-Biopharm Salmonella spp. / Listeria spp.

RayAL Selecta /Optima RayAL Salmonella spp. / Listeria spp.

3M Tecra 3M Salmonella spp. / Listeria spp./E.coli
O157:H7/enterotoxinas estafiloccicas/
C
Campylobacter.
l b t

RIDASCREEN R-Biopharm Salmonella spp./Listeria/enterotoxinas

estafiloccicas

Transia Plataformas automticas

system
(Biocontrol) Assurance EIA/TRANSIA PLATE (Gold) Biocontrol Salmonella spp. /L.
monocytogenes/E.coli0157/Campylobacter/enteroto
xinas estafiloccicas.

ELFA
VIDAS Biomerieux Salmonella spp. /L. monocytogenes/E.coli O157/
enterotoxinas estafiloccicas

Vidas
(Biomerieux)

Deteccin inmunoenzimtica fluorescente (ELFA) automatizada

ELFA es una tcnica ELISA en "sandwich, ligada a la inmunoconcentracin en pipetas de

captura, de alta sensibilidad y especificidad para la deteccin de antgenos. Emplea
fluorescencia para la deteccin final.

Sistema VIDAS/miniVIDAS (Biomerieux): plataforma de inmunoanlisis (ELFA) automatizada

Un primer anticuerpo Un segundo anticuerpo Deteccin: La actividad

que recubre el cono del conjugado con un enzima se enzimtica genera una
tubo que acta como fija al antgeno capturado. sustancia fluorescente al
pipeta captura la diana catalizar el sustrato adecuado

370 nm 450 nm

Cartucho 10 pocilllos
 http://www.biomerieux-industry.com/servlet/srt/bio/industry-
microbiology/dynPage?node=VIDAS_2

25 g o ml de productos 1/10 superficies

12/60 tests
VIDASUP Salmonella VIDAS LMX
225 ml APT (supl v.)caldo 225 ml LMX (o,5 ml suple.)
18-24 h 41,5 C 26-30 h 37C
SSAYS

0.5 ml Aplicar 250 l

NEXT DAY AS

VIDAS Heat & Go / 5 1 min

10 min para enfriar

Resultados 48 min Resultados 80 min

Test < 0.25 Test 0.25 DLMO - < 0,05

Confirmar DLMO + >0,05

Ausencia de Confirmar LM
Salmonella
API 20 E or ID 32 E
API Listeria

El gran desarrollo de la genmica en esta ltima dcada, nos permite actualmente disponer de tcnicas
moleculares basadas en la hibridacin de los cidos nucleicos y/o PCR con diseos muy especficos, muy
sensibles para deteccin rpida de patgenos .
Plataforma/mtodo Casa comercial

HIBRIDACIN
LUMIprobe 24 Europrobe
Gene-Quence (Gene-Trak) Neogen
AccuProbe (GeneProbe Inc) Biomerieux

PCR

iQ-CHeck Bio-Rad
LightCycler Roche
BAX system Qualicon Oxoid

ADIAFOOD AES Chemunex

MicroSEQ Applied Biosystems
R.A.P.I.D. LT real-time PCR system Idahotech
Assurance GDS Biocontrol
GeneDisc Cycler Pall Technologies
 Los diferentes sistemas disponibles en el mercado y validados por AOAC y/o AFNOR
se basan en un sistema de hibridacin de cidos nucleicos de doble especificidad
mediante una sonda de captura para rRNA y una sonda detectora (conjugada con
una enzima) y con reactivos listos para el empleo.

Ensayo Deteccin Certificacin Aplicacin Tiempo N muestras

ensayo
GeneQuence Colorimtrica AOAC Despus 1h50 min 93 muestras.
(Neogen Corp.) (450nm) enriquecimiento Robotizado
(24-48h) 450m/8h y 2-4
patgenos
simultneos
LumiProbe Luminomtrica AFNOR Despus 2h Individual o placa
(EuroProbe) enriquecimiento 96.
especfico (20h) 1-200 tests/dia
AccuProbe Luminomtrica AFNOR A partir de 30 min Individual o
(GeneProbe Inc, (L. monocytogenes) colonias en agar microplaca
Biomerieux) Palcam y
despus
enriquecimiento
HF 24-48 h

La PCR es una tcnica de amplificacin exponencial de cidos nucleicos que permite una
multiplicacin muy rpida del nmero de dianas disponibles para la deteccin de patgenos
y una mayor sensibilidad del sistema.

4rt c ic le
Gen d iana
3r cic le Am plific ac i exponenc ial

2n cic le

1r c ic le 35 c ic le
DNA m ostra

1 2
2 = 2 = 35
2 c pies 4 c pies 8 c pies 16 c pies 2 = 34 bilions de c pies

(Andy Vi erstraete 2001)

Desnaturalizacin

Hibridacin

Extensin
 Combina amplificacin y deteccin en un solo paso
Desventajas PCR Convencional: PCR a tiempo real:

Pobre Precisin Mayor rapidez

Baja sensibilidad Doble especificidad (sonda)
Rango dinmico corto < 2 logs Formato tubo cerrado)
Baja resolucin Cuantificacin por Fluorescencia
No Automatizada
Discriminacin basada en el tamao
Resultados no cuantificables
Requiere procesado post-PCR (gel agarosa)

La PCR en tiempo real detecta la fluorescencia emitida en cada ciclo de amplicacin

de manera que el equipo monitoriza la amplificacin y detecta simultneamente.

La reaccin y la deteccin se realiza en tubo cerrado y en los sistemas comerciales

con reactivos listos al empleo, evitan contaminaciones cruzadas y agilizando la
obtencin de resultados.

Los sistemas comerciales generan un resultado de positivo /negativo que no requiere

personal especializado.

Gran precisin, exactitud y sensibilidad.

Reacciones en uniplex y multiplex (2-6 dianas) dependiendo del equipo.

Tiempo del ensayo: 40 min -3,30 h dependiendo del equipo y la tecnologa utilizada

Deteccin mediante SYBR Green I

1. INICIO REACCIN. Las molculas de
SYBR Green I fluorescen cuando se unen a la
doble cadena de ADN

2. DESNATURALIZACIN. Cuando el ADN se

desnaturaliza, SYBR Green I se libera y la
fluorescencia se reduce drsticamente

3. POLIMERIZACIN. Durante la extensin, la

ADN polimerasa aade nucletidos de forma
complementaria a partir de la unin de los
cebadores.

4. POLIMERIZACIN COMPLETA. Cuando se ha

completado la polimerizacin, SYBR Green se
une al producto de PCR de doble cadena
generado, resultando en un incremento de
fluorescencia que se detecta por el sistema de
PCR a tiempo real
 Deteccin mediante Sistema TaqMan (Applied Biosystems).

1. POLIMERIZACIN: La sonda tienen un

fluorforo reportero (REPORTER) y un
fotocromo extintor de fluorescencia
(QUENCHER) unidos al extremo 5 y 3,
respectivamente

2. DESNATURALIZACIN. Mientras la sonda

est intacta la fluorescencia del reporter est
mitigada por el quencher
quencher. NO emite
fluorescencia

3. ESCISIN (cleavage). Durante la extensin de

la cadena la ADN polimerasa escinde el reporter
de la sonda.

4. POLIMERIZACIN COMPLETA. Una vez

separado del quencher el reporter emite su
fluorescencia caracterstica.

Hidrolizados de casena e iones Ca2+

Compuestos grupo Hemo
Alimento
Inmunoglobulina G
Matriz compleja
Colgeno
ADN inespecfico

Inhibicin PCR.....falso negativo

Prevencin de la inhibicin: tratamiento pre-PCR de la muestra

Enriquecimiento y/o dilucin de la muestra

Centrifugacin y/o filtrado de la muestra
Adsorcin inmunomagntica del microorganismo a estudio
Tratamiento con resinas quelantes de iones (Chelex-100)
Extraccin y purificacin de ADN

Control interno de la reaccin

Actualmente disponemos de una variedad de equipos de diferentes casas

comerciales con un formato totalmente simplicado para su uso y de fcil
implantacin con mtodos validados por AOAC, AFNOR, Nordval

La introduccin de estas metodologas RTi-PCR en el Laboratorio depender

de si el coste del equipo compensa la agilizacin de los ensayos.

Qu plataforma seleccionar?

Ensayo validado
Rotor Gene Q Simplicidad
(Qiagen)
N de muestras
Smart cycler (Cepheid) Coste
Rapidez
Conveniente
Servicio Tcnico
Mtodo Casa comercial Dianas TiempoDeteccin

iQ-CHeck Bio-Rad Salmonella spp., L. monocytogenes, Listeria spp., E.coli O157:H7. 4h

LightCycler Roche Salmonella spp., L. monocytogenes 2h

Salmonella spp., L. monocytogenes,Listeria spp., Cronobacter spp,

4,55h
Campylobacter jejuni,coli y lari, S. aureus, V. cholerae, V.
BAX system Qualicon Oxoid 2h2,5h
parahaemolyticus, V. vulnificus
E.coli VTEC (O157:H7 y otros 6 serotipos VTEC )
1,5h

ADIAFOOD AES Chemunex Salmonella spp.,L. monocytogenes , Listeria spp.,E.coli O157:H7 2.5h
SSalmonella
l ll spp., L.
L monocytogenes,
t E li O157:H7
E.coli O157 H7
MicroSEQ/ 3h
Applied Biosystems *Cronobacter sakazaki/Campylobacter jejuni, S. aureus, E.coli
TaqMan/
0104:H4/VT1VT2.

IEH IEHInc. Salmonella spp., L. monocytogenes, E.coli O157, VTEC-producing ND

E.coli with Intimin & Salmonella

R.A.P.I.D. LT
real-time PCR Idahotech Salmonella spp., Listeria spp.,E.coli O157:H7 0,5h
system

Assurance GDS Biocontrol Salmonella spp., L. monocytogenes, Listeria spp., Cronobacter, 1,52h
E.coli VTEC (O157:H7) y otras VTEC

GeneDisc Cycler Pall Life Science Salmonella spp., L. monocytogenes y Listeria spp., E.coli VTEC
(O157:H7 y otros serotipos VTEC)

Ensayo multiplex Casa comercial Dianas

E.coli O157, Stx-producing E.coli(STEC)
IEH E.coli O157, Stx-producing E.coli (STEC) with Intimin & Salmonella
IEH lab
SalmonellaTest System

GeneDisc E.coli O157 y Salmonella spp Pall GeneDisc Tech E.coli O157 y Salmonella spp

E.coli VTEC/STEC y Salmonella spp

GeneDisc STEC y Salmonella spp.

E.coli VTEC (O26, O103, O111, O145 y

GeneDisc EHEC 5
O157:H7)

Microgen GNA ID Salmonella spp y E. coli

Campylobacter
Campylobacter coli, jejuni, coli, lari i

Vibrio
Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus Qualicon Oxoid

BAX System Real-Time PCR Assay: STEC Screening

E.coli VTEC
for stx and eae (96 tests)

BAX System Real-Time PCR Assay: STEC Panel 1 for E.

coli O26, O111, O121 (48 tests)

BAX System Real-Time PCR Assay: STEC Panel 2 for E.

coli O45, O103, O145 (48 tests)

Enriquecimiento caldo LEB24

37C 24 h

10:10 Se transfieren 50 l de los agentes

10:00 Se crea la plantilla de los ensayos
a realizar en el termociclador y se
calienta el equipo.
10:05 Se diluye el agente de lisis 1:8
lticos combinados a los tubos de lisis
ml en agua estril y se combina 4:1
donde se aade 0,5 ml de muestra
con el agente ltico 2
enriquecida y se incuba 30 m 37 C.

10:50 Se mezcla la proteasa con el tampn 10:55 Se transfieren 5 L del lisado

11:00 Se incuban 30 minutes at 55 C
de lisis y se transfieren 200 l de buffer de celular (muestra) a los tubos con
y 10 minutes a 95 C.
lisis a nuevos tubos de lisis proteasa.

11:45 Se hidratan las tabletas de 11:50 Se cierran los tubos de PCR y

Se enfria 5 m en el bloque frio. PCR en un segundo bloque fro con se posicionan en el termociclador y
30 L de lisado fro. se realiza la PCR

15:20 Se obtienen los resultados SYBR Green I

3,5 h
 Incubacin previa (si se considera)

42C Bolton en microaerofilia

24-48H

Ensayo
90 minutos con un lmite de deteccion: 104
cfu/ml

ADIAFOOD (AES Chemunex).

Protocolo simple de anlisis en tres pasos:
Enriquecimiento en 18 h
Extraccin ADN :< 30 minutos en el mismo termociclador
Amplicacin y deteccin: 2 h 30 min

Rti-PCR de doble especificidad con cebadores y sonda.

Formato microplaca (88 muestras ms controles) y tiras de 8.

Interpretacin de resultados automtico y redaccin de informe

IQ-Check. Bio-Rad
Enriquecimiento Salmonella: 16-22h APT / L.monocytogenes:
HF 25h + TSB 3-5 h LSB 25 h.
Lisis rpida
Rti- PCR doble especificidad con cebadores y sonda

Confirmacin de resultados mediante siembra 100l en agar cromognico

Deteccin de Salmonella, Listeria y L. monocytogenes 24h

E. coli VTEC, Cronobacter

Preenriquecimiento Inmnunoconcentracin Pipeta Pickpen, Extraccin parcial

de 1 ml de la muestra con 8 imanes protegidos en ADN a partir 5 l
mediante Ac asociados a puntas
t de
d silicona,
ili atrapa
t las
l muestra
partculas paramagnticas bolitas magnticas que contienen concentrada.
las bacterias a estudio.

Termociclador a tiempo real: Rotor-Gene

PCR de doble especificidad mediante cebadores y sonda especfica MGB.
Ensayo PCR 2 h
 Separa especies bacterianas de una mezcla de microorganismos en una suspensin de la
muestra, utilizando para ello partculas superparamagnticas cubiertas de anticuerpos
especficos.

Matrix Microscience Esquema del

(AOAC validated) area de captura

Unin anticuerpos al Recirculacin caldo

Lavado Liberacin
magneto enriquecimiento

Una vez realizada la separacin y concentracin inmunomagntica, la deteccin se

realiza mediante siembra en placa o por PCR o colorimetricamente.
os IRTA- Seguretat Alimentari

Salmonella L.monocytogenes
Tratamiento Jamn Jamn Jamn Jamn
Mortadela Fuet Mortadela Fuet
PrePCR cocido serrano cocido serrano
Prepman2ml 100 50 100 60 1.000 1.000 250 1.000
Prepman4ml 10 2 100 60 1.000 1.000 250 1.000
Prepman10ml 10 2 20 3 100 1.000 250 200
Resultados propio

Qi b 2 l
Qiacube2ml 10 100 200 60 15 15 35 20
Qiacube4ml 10 100 20 3 15 15 5 3
Qiacube 10ml 10 2 20 3 5 15 35 20
BAX 100 1.000 1.000 2.000 30.000 40.000 30.000 >30.000
Pathatrix+BAX 100.000 100.000 100.000 100.000
. Resultados propios IRTA- Seguretat Alimentaria
Valores en UFC/ml de homogeneizado

Agua Peptona (Salmonella)

LEB24 (L. monocytogenes)

ISO 22174:2005 para especificaciones generales.

ISO 20837:2006 para la preparacin de la muestra para deteccin cualitativa.

ISO 20838:2006 para la amplificacin y deteccin cualitativa

ISO/TS 20836:2005 para validar los termocicladores.

ISO 22118:2011 para la deteccin y cuantificacin de patgenos alimentarios Caractersticas de funcionamiento.

ISO 22119:2011 PCR a tiempo Real. Especificaciones generales y definiciones

ISO/PRF TS 13136 PCR a tiempo Real para la deteccin de Escherichia coli (STEC) pertenecientes a los
serotipos O157, O111, O26, O103 y O145 (en revisin)

ISO/WD TS 17919 (working draft) Microbiology of food and animal feed -- Polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens -- Detection of botulinum neurotoxin type A, B, E and F - producing clostridia
(borrador)
 OTRO ASPECTO MUY IMPORTANTE . LA tipificacin a nivel de cepas

En general el genotipado no es un requisito en los criterios microbiolgicos CE2073/2005

y por tanto no hay obligacin de realizar este tipo de anlisis por parte del explotador de la
empresa.

No obstante, estas herramientas pueden ser muy tiles para el explotador de la empresa
puesto que permiten

Localizar las posibles fuentes de contaminacin y observar problemas de contaminacin

cruzada.

Determinar la eficacia de los protocolos de limpieza y desinfeccin y ver la capacidad

de supervivencia en condiciones adversas ( bacterias psicrotrfas, formacin de biofilms
y contaminacin persistente como por ejemplo Listeria).

Implicaciones de los alimentos en determinados brotes alimentarios o infecciones

alimentarias

Mejora plan APPCC, mejora de la seguridad alimentaria de

los productos producidos en la empresa

Tipificacin fenotpica
Serotipado. Listeria 13 serotipos
Discriminacin limitada
Salmonella >2000 serotipos
E.coli 700 serotipos
Fagotipado. Coleccin limitada de fagos

Anlisis de ADN cromosmico basado en perfiles

de restriccin

PFGE (electroforesis en campo pulsado)

Ribotipado

Tipificacin molecular Anlisis de ADN cromosmico basado en

Alto poder de discriminacin amplificacin /secuenciacin

REP-PCR (anlisis de secuencias repetitivas)

MLVA (anlisis de varias secuencias repetitivas

en tandem)

MLST(anlisis de las secuencias allicas de 7

genes constitutivos)

Cheff Mapper BioRad

Ventajas: Protocolos estandarizados a nivel mundial. Reproducible y
discriminante. http://www.pulsenetinternational.org/Pages/default.aspx
L. monocytogenes/Salmonella/E.coli/Yersinia/Clostridium/Shigella/Campylobacter.

Desventajas: Protocolo manual y largo, Tratamiento datos exhaustivo.

Necesita equipo especfico y tcnicos especializados

Alimento Pacientes Otros brotes

M 1 2 3 M 3 3 4 5 M 6 7 8 M

Pulsenet Salmonella. PFGE Xba1. Pulsenet Listeria monocytogenes. M. Marcadores.

Carriles 1, 5, 9, 14 marcadores 1-8 diferentes pulsotipos
 Ribotipado de L.monocytogenes.
Estudio de prevalencia de aislados en industria alimentaria

Equipo comercial (Riboprinter , Dupont) que realiza automticamente todas las reacciones necesarias
para la obtencin del perfil de ribotipado. Agilizando y simplificando el proceso sin necesidad de tcnicos
altamente especializados.

Asla el ADN, realiza la restriccin y electroforesis, transfiere el gel a la membrana. Hibrida con la sonda de
ADN, documenta el perfil de forma quimioluminiscente y correlaciona el mismo en una base de datos propia
que actualmente dispone de 6900 perfiles diferentes.

Discriminacin limitada a ARN ribsomico

Microorganismo Aislados Ribogrupo Muestras(%) %Aislamiento

Listeria spp. 269 31 74391 0,36

L.monocytogenes 175 19 74391 0,24

Ribogrupo Nvecesaislado Lugar Espaciode Ambiente/Produ

aislamiento tiempo(meses) cto
102195S1 82 1,2,3,4 21 45/37
102231S7 24 1,2 15 15/9
102265S3 16 1,4 21 12/4
114997S7 15 1 8 15/0
102409S3 9 1 11 9/0
1141249S5 7 1 13 7/0
Fuente resultados: Campden BRI Science, technology and information for the food, drink and allied industries worldwide.

Diversilab

Tipificacin basada en las tcnicas de amplificacin/secuencia conocidas de cidos

nucleicos.
Ms rpidos y precisos. Mejor gestin de los datos.
REP-PCR (Amplificacin de secuencias cortas repetitivas, palindromes extragnicos
repetitivos. Actualmente en el mercado se dispone del equipo Diversilab (Biomerieux).
Bases de datos en desarrollo.

MLVA ( Amplificacin mltiple de diversas secuencias repetitivas en tanden).

Multilocus variable number tandem repeat. Activo en Pulsenet para Salmonella y E.coli
O157. E
O157 En d
desarrollo
ll para Listeria
Li t i monocytogenes.
t
http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlva/
http://pubmlst.org/databases.shtml

MLST (Amplificacin y secuenciacin de varios genes con variacin de secuencia

entre cepas). Discriminatorio, resultados precisos y de fcil interpretacin.
http://www.pasteur.fr/mlst/Lmono.html
http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica

Secuenciador
Applied Biosystems 3100

Secuencia de ADN
MLVA profile

Tipificacin molecular Listeria monocytogenes por MLVA

Prcticamente todos los microorganiismos tienen en sus genomas dispersadas pequeas secuencias
repetitivas en tandem. En cada locus el nmero de secuencias que se repite puede variar en nmero. Se
generan variantes allicas con distinto peso molecular (VNTRs) Variable number tandem repeat.. Si
realizamos screening de varios locus (MLVA)..

).

Resultados propios IRTA- Seguretat Alimentaria

PCR1+PCR2
MLVA PCR1 PCR2 MLVA
10

20

30

40

50

60

70

80

90

10

A6
A7
A1
A4
A5
A8
A9
A2

Identificacin molecular de cepas de L. monocytogenes aisladas de alimentos e industria alimentaria mediante generacin de perfil
molecular obtenido a partir de la amplificacin de diferentes secuencias repetitivas en tndem y en nmero variable (MLVA- 5 locus)

http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlva/
Tipificacin de cepas de L. monocytogenes aisladas de productos crnicos y de ambiente
mediante genotipado por MLST

PCR
94 for 4 min
35 ciclos
(94 for 30 s,
Cepa 52 for 30 s*/45 bglA , Secuenciacin
L.monocytogenes Extraccin ADN 72 for 2 min) (fragmentos variables de los 7 genes constitutivos)
72 for 10 min abcZ (ABC transporter) , bglA (beta glucosidase) ,
cat (catalase) ,dapE (succinyl diaminopimelate desuccinylase) ,
dat (D-amino acid aminotransferase) ,ldh (L-lactate
Base de datos centralizada dehydrogenase) ,lhkA (histidine kinase)
http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html

Numerical
Strain code Gene code Serotype
code

sequence
Industry Sample abcZ bglA cat dapE dat ldh lhkA
type (ST)

A 1 7 14 10 19 9 8 1 31 1/2a

A 2 6 5 6 4 1 4 1 9 1/2c

A 3 6 5 6 4 1 4 1 9 1/2c

Alineamiento de cada secuencia con las ya existentes en la base de datos centralizada. A 4 3 18 27 3 4 1 5 194 4b

Asignacin de alelo A 5 3 18 27 3 4 1 5 194 4b

gen abcZ bglA cat dapE dat Ldh LhkA A 6 7 6 8 8 6 37 1 121 1/2a

Var.allicas 87 78 94 105 63 232 78 A 7 6 5 6 4 1 4 1 9 1/2c

A 8 6 5 6 4 1 4 1 9 1/2c

ST (tipo de secuencia)
Genotipado (ST) de cepas de L.monocytogenes de productos crnicos
Cdigo numrico resultado de la combinacin de las diferentes
y ambiente.
variantes allicas
Este perfil de secuencias tiene un cdigo internacional comparable a
541 ST diferentes para L.monocytogenes y 2476 aislados
nivel internacional.

Resultados propios IRTA- Seguretat Alimentaria

Otras bacterias: http://pubmlst.org/databases.shtml

Departament dAgricultura, Ramaderia,

Pesca, Alimentaci i Medi Natural