Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana

ISSN: 0325-2957
actabioq@fbpba.org.ar
Federacin Bioqumica de la Provincia de
Buenos Aires
Argentina

Verna, Juan Antonio; Ventimiglia, Fernando Daniel; Bruno, Jorge Jos; DAgostino, Liliana
Elena
Desempeo analtico de un mtodo cromatogrfico para la cuantificacin de hemoglobina
glicosilada
Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana, vol. 49, nm. 3, 2015, pp. 295-299
Federacin Bioqumica de la Provincia de Buenos Aires
Buenos Aires, Argentina

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=53542622002

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Bioqumica Clnica Comunicacin breve
Desempeo analtico de un mtodo
cromatogrfico para la cuantificacin de
hemoglobina glicosilada*
Analytical performance of a chromatographic method
for the quantitation of glycated hemoglobin
Desempenho analtico de um mtodo cromatogrfico
para a quantificao da hemoglobina glicosilada
`` Juan Antonio Verna1, Fernando Daniel Ventimiglia2, Jorge Jos Bruno3,
Liliana Elena DAgostino4
1 Especialista en Qumica Clnica.
2 Doctor en Bioqumica.
3 Bioqumico.
4 Especialista en Inmunologa.
* Laboratorio DAgostino-Bruno. Calle 14 n 280.
La Plata. C.P. 1900. La Plata. Buenos Aires.
Argentina.
Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana
Incorporada al Chemical Abstract Service.
Cdigo bibliogrfico: ABCLDL.
ISSN 0325-2957
ISSN 1851-6114 en lnea
ISSN 1852-396X (CD-ROM)
Resumen
La determinacin de la hemoglobina glicosilada (HbA1C) ha sido propuesta
en el ao 2010 por la American Diabetes Association (ADA) como criterio
diagnstico de diabetes mellitus, siendo fundamental para el control y se-
guimiento de la glucemia a largo plazo. En este contexto, el laboratorio debe
garantizar el cumplimento de los requisitos internacionales de calidad de
forma de asegurar que el cambio en el resultado de HbA1C entre dos deter-
minaciones sucesivas de un paciente sean el reflejo de una variacin clnica
y no de una variacin analtica. En este trabajo se evalu el desempeo
analtico de un mtodo cromatogrfico, procesando controles comerciales
provistos por el fabricante. Se calcularon el coeficiente de variacin total,
sesgo, error total, valor de referencia para el cambio y el cambio clnico
significativo para el punto crtico de 7,0%-NGSP. El mtodo evaluado cum-
pli con todos los requisitos internacionales de calidad establecidos, lo que
permitira asignar el cambio de la concentracin de HbA1C en dos determi-
naciones sucesivas de un paciente, como debido a una modificacin en la
condicin clnica del mismo y no a la variabilidad analtica.
Palabras clave: hemoglobina glicosilada * HbA1C * cromatografa * diagns-
tico de diabetes * mtodo * desempeo analtico * error total * valor de
referencia para el cambio * cambio clnicamente significativo
Summary
Measurement of glycated hemoglobin (HbA1C) was proposed in 2010 by
the American Diabetes Association (ADA) as diagnostic criteria for diabetes
mellitus, being essential for control and monitoring of blood glucose in the
follow-up. In this context, the laboratory must ensure compliance with in-
ternational quality requirements so as to guarantee that the change in the
result of HbA1C between two successive determinations of a patient shows
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a clinical variation and not an analytical variation. In this paper, the analytical performance of a chromato-
graphic method was evaluated by processing control samples provided by the manufacturer. The coefficient
of total variation, bias, total error, reference value for the change and significant clinical change to the criti-
cal point of 7.0% -NGSP were calculated. The method evaluated met all international quality requirements,
which would measure the change in HbA1C concentration in two successive determinations of a patient, due
to a change in clinical condition and not to the analytical variability.
Key words: glycated hemoglobin * HbA1C * chromatography * diabetes diagnosis * method * analytical per-
formance * total error * change reference value * clinically significant change

Resumo
A determinao da hemoglobina glicada (HbA1C) foi proposta em 2010 pela Associao Americana de
Diabetes (ADA) como critrio de diagnstico de diabetes mellitus, sendo essencial para o controle e segui-
mento de glicemia no longo prazo. Nesse contexto, o laboratrio deve garantir o cumprimento dos requisitos
internacionais de qualidade, de modo a garantir que a mudana no resultado de HbA1C entre dois testes
consecutivos para um paciente sejam o reflexo de uma variao clnica e no de uma variao analtica.
Nesse trabalho, o desempenho analtico de um mtodo cromatogrfico foi avaliado atravs de controles co-
merciais fornecidos pelo fabricante. Foram calculados o coeficiente de variao total, vis, erro total, valor
de referncia para a mudana e a alterao clnica significativa para o ponto crtico 7,0% -NGSP. O mto-
do avaliado cumpriu com todas as exigncias internacionais de qualidade estabelecidas, o que permitiria
atribuir a mudana da concentrao de HbA1C em duas determinaes consecutivas de um paciente, como
devido a uma alterao no estado clnico do mesmo e no variabilidade analtica.
Palavras-chave: hemoglobina glicada * HbA1C * cromatografia * diagnstico de diabetes * mtodo * desem-
penho analtico * erro total * valor de referncia para a mudana * alterao clnica significativa

Introduccin cfico de la determinacin de HbA1C es de relevancia

La prevalencia global de diabetes mellitus (DM) se ha
incrementado rpidamente en los ltimos aos, ms
an, actualmente la patologa es considerada una pan-
demia. En este contexto, la determinacin de hemoglo-
bina glicosilada (HbA1C) fue propuesta en el ao 2010
por la American Diabetes Association (ADA) como criterio
diagnstico (1) siendo fundamental para el control y
seguimiento de la glucemia a largo plazo (2-4). Se debe
remarcar que la determinacin debe ser efectuada por
mtodos certificados por el National Glycohemoglobin
Standarization Program (NGSP) y estandarizados en con-
cordancia con las especificaciones del Diabetes Control
and Complications Trial (1)(2).
El criterio diagnstico mencionado establece que los
valores de HbA1C deben ser superiores a 6,5%-NGSP y se
fundamenta en el progreso alcanzado en los ensayos de
cuantificacin de HbA1C por la implementacin del pro-
grama de estandarizacin llevado a cabo por el NGSP (5).
La diversidad de mtodos basados en distintos prin-
cipios fsico qumicos disponibles en el mercado nacio-
nal, con la consecuente variabilidad en los resultados,
ha determinado que este criterio no haya sido aceptado
an por la Sociedad Argentina de Diabetes (6).
El objetivo del laboratorio es garantizar resultados
confiables para la salud del paciente. En el caso espe-
asegurar exactitud y precisin en las mediciones para
lograr un control glucmico superior. Se ha evidencia-
do que los pacientes con valores de concentracin pro-
medio de HbA1C de 7,0%-NGSP consiguen una conside-
rable disminucin de las complicaciones micro y macro
vasculares (2)(3). Para evitar el agravamiento en estos
pacientes durante el seguimiento se intenta reducir la
concentracin de HbA1C en 0,5 puntos porcentuales o
ms (7), por lo que las mediciones realizadas en el la-
boratorio deben cumplir con los requisitos de calidad
establecidos de manera de asegurar que los cambios
de concentracin observados sean debidos exclusiva-
mente a una modificacin clnica en el estado de salud
del paciente y no causados por la variabilidad analtica.
El parmetro o estadstico que mejor describe el cam-
bio entre dos mediciones sucesivas del mismo pacien-
te se conoce como valor de referencia para el cambio
(VRC%). El VRC% contiene en su formulacin la varia-
bilidad biolgica intraindividual y la imprecisin anal-
tica, por lo que asegurando el buen desempeo anal-
tico las variaciones detectadas que superan dicho valor
indicaran un cambio clnicamente significativo (8)(9).
A lo largo del tiempo, con el progreso de los mtodos
de medicin, las especificaciones analticas para la deter-
minacin de HbA1C han aumentado su exigencia: en el
ao 2007, el error total aceptable (ETa%) fue 15%, en el

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ao 2012 fue de 7% y a partir del ao 2013 se estableci
en 6% (5)(7)(10). De la misma manera, las pautas para el
diagnstico y manejo de la diabetes desde el laboratorio,
indican que el coeficiente de variacin porcentual intrala-
boratorio (CV%) debe ser menor al 2,0% y entre labora-
torios, menor de 3,5% (11).
La International Federation of Clinical Chemistry and La-
boratory Medicine (IFCC) ha desarrollado un mtodo de
referencia primario, basado en el clivaje de un hexa-
pptido terminal y cuantificacin por espectrometra
de masa o electroforesis capilar (12). Los mtodos utili-
zados en el laboratorio clnico deben verificarse con el
mtodo de referencia; actualmente se dispone de dife-
rentes mtodos para medir la concentracin de HbA1C,
entre ellos la Cromatografa Lquida de Alta Performance
(HPLC). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el
cumplimiento de los estndares establecidos por los orga-
nismos internacionales (NGSP, GLAD Working Group) con
el fin de comprobar que los resultados obtenidos por este
mtodo son clnicamente confiables.
Materiales y Mtodos
Durante el mes de diciembre de 2014 se evaluaron
controles provistos por el fabricante utilizando el siste-
ma Variant II Hemoglobin A1c de Bio-Rad (EE.UU.) que
utiliza el principio de HPLC e intercambio catinico, y
se encuentra certificado por el NGSP. En este sistema,
las muestras son automticamente diluidas e inyecta-
das en la columna cromatogrfica la cual se encuentra
dentro de un horno termostatizado que garantiza la es-
tandarizacin de la temperatura de corrida. Mediante
un gradiente de elucin programado, la fuerza inica
creciente permite que las distintas fracciones de la he-
moglobina sean separadas en base a sus interacciones
inicas con el material de la columna. Posteriormente,
las fracciones separadas son cuantificadas mediante un
fotmetro de filtro a una longitud de onda de 415 nm.
Finalmente, un algoritmo gaussiano calcula el rea del
pico correspondiente a HbA1C y la transforma en unida-
des NGSP (%-NGSP).
Los controles y calibradores se conservaron y proce-
saron de acuerdo con las recomendaciones del fabrican-
te. Se procesaron dos niveles de control; normal y alto
(Lyphocheck Diabetes Control Levels 1 y 2, lote n 33870,
fecha de vencimiento 31/12/2015). Los valores asignados
para los materiales de control se presentan en la Tabla I.
Tabla I. Valores target asignados y rangos de HbA1C (%-NGSP) de
los controles utilizados.
Nivel de Valor target asignado y rango de HbA1C
control (%-NGSP)
Normal 5,3 (4,70 5,90)
Alto 9,6 (8,40 10,8)
Como controles externos se utilizaron los provis-
tos por el Programa de Evaluacin Externa de la Calidad
(PEEC) de la Fundacin Bioqumica Argentina. Los datos
fueron colectados y analizados mediante el software Stat-
graphics 4.1.
El desempeo analtico del mtodo se evalu en el
marco de la aplicacin del protocolo EP15-A2 del Clini-
cal and Laboratory Standards Institute (CLSI), mediante el
procesamiento por triplicado de cada control durante
cinco das. La linealidad del mtodo se evalu median-
te regresin lineal. Se calcularon el CV%, la veracidad
o sesgo % y el ET% para un nivel de confianza del 95%
segn a la expresin (13):
ET%= Sesgo% + (1,65 x CV% total)
A partir de la frmula anterior y considerando las
metas recomendadas de ETa% de 6% (ao 2013) y de
CV% de 2,0%, se calcul el sesgo% aceptable, siendo su
valor estimado de 2,7%.
Mediante el clculo de la imprecisin del mtodo
y el coeficiente de variacin biolgica intra-individuo
(CVi%) que, segn Rohlfing et al (14) para HbA1C es
de 1%, se calcul el valor de referencia para el cambio
(VRC%) segn la frmula (8)(9):
VRC% = 2 1/2 x 1,96 x [(CV%)2 + (CVi%)2]1/2
Finalmente se calcul el CCS que fue capaz de detec-
tar el mtodo en el punto crtico de 7,0%-NGSP, para
compararlo con la variacin considerada clnicamente
significativa, de 0,5%-NGSP.
Resultados
El estudio de la linealidad del mtodo para cuanti-
ficar HbA1C mediante regresin lineal, arroj un r2 de
0,999, permitiendo verificar una linealidad ptima. La
ecuacin de la recta obtenida fue la siguiente:
y=0,9736 x + 0,0664
En la Figura 1 se presenta el grfico de la linealidad.
En la Tabla II se presentan los resultados del desempe-
o analtico obtenidos en las muestras control evalua-
das.
Como se observa en la Tabla II se obtuvo un ptimo
desempeo ya que en ambos niveles el CV% fue menor
al 2%, el sesgo% fue menor al sesgo% aceptable espera-
do (2,7%), y el ET% fue menor al ETa del 6% conveni-
do para el ao 2013.
Discusin y Conclusiones
En el seguimiento y control de la glucemia, los m-
dicos sustentan sus decisiones teraputicas basados en
la concentracin de HbA1C y en los cambios que se ob-
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298 Verna JA et al.
Tabla II. Resultados obtenidos en el anlisis de los controles
Control Promedio %
Normal 5,23
Alto 9,41
DE: desvo estndar, CV: coeficiente de variacin, ET: error total, VRC; valor de referencia para el cambio, CCS: cambio clnicamente significativo.
servan entre mediciones consecutivas. De esta manera,
el laboratorio debe garantizar un desempeo analtico
conforme con las normativas internacionales estableci-
das, de forma que el cambio que se observa sea debido
a una variacin en el estado de salud del paciente.
El documento del ao 2009 de las Primeras Jorna-
das Conjuntas de Consenso del Laboratorio en Diabetes (6)
recomendaba como tcnica de eleccin para la cuan-
tificacin de HbA1C a los mtodos inmunoturbidim-
tricos, al mismo tiempo que desaconsejaba el uso los
mtodos basados en cromatografa de intercambio i-
nico, debido a los problemas de estandarizacin, par-
ticularmente la temperatura. El sistema cromatogrfi-
co evaluado en este trabajo facilita un estricto control
de la temperatura, ya que la columna se encuentra en
un horno termostatizado; el resto de las variables que
intervienen en un mtodo cromatogrfico se encuen-
tran adecuadamente estandarizadas por el software del
instrumento.
La metodologa analtica para la cuantificacin de
HbA1C evaluada en este trabajo demostr un desempe-
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Figura 1. Evaluacin de la linealidad
DE % CV % Sesgo % ET % VRC % CCS de HbA1C para 7,0%-NGSP
0,04 0,59 1,40 2,37 3,22 0,23
0,06 0,64 1,91 2,97 3,29 0,24
o analtico ptimo, cumpliendo los requerimientos
internacionales, lo que permitira no slo un monito-
reo adecuado de la glucemia, sino tambin el diagns-
tico de los pacientes diabticos. Debe destacarse que
los ET% hallados para ambos niveles de control en-
sayados fueron menores al 3%, permitiendo alcanzar
la meta del ETa% del 6% sugerido en el ao 2013 y
que la capacidad de deteccin del CCS, fue menor al
0,25% para el valor crtico de 7,0%-NGSP, en ambos
controles. Los resultados obtenidos fundamentan el
hecho que el cambio en la concentracin de HbA1C se
debera a una variacin de la condicin clnica del pa-
ciente y no a la variabilidad analtica del mtodo, refle-
jado por el VRC% como se expres ms arriba (8)(9).
El mtodo cromatogrfico evaluado en este trabajo
constituye una alternativa a otros mtodos que se en-
cuentran disponibles en el mercado y que no logran
alcanzar las metas analticas establecidas (15).
Los resultados reportados por Unger et al (15), quie-
nes evaluaron un mtodo cromatogrfico de intercam-
bio catinico manual, difieren de los encontrados en el
 Desempeo analtico de un mtodo cromatogrfico para hemoglobina glicosilada 299
presente trabajo al presentar valores de sesgo% y ET%
ms elevados, por lo que no cumplieron con el desem-
peo analtico considerado aceptable.
Finalmente, los autores consideran que este trabajo
puede ser un aporte a los laboratorios con el objetivo de
garantizar la emisin de resultados de HbA1C de exce-
lente calidad, en los cuales los mdicos puedan basarse
para la toma de decisiones de impacto clnico.
CORRESPONDENCIA
JUAN ANTONIO VERNA
Calle 14 n 280. La Plata
C.P.: 1900. LA PLATA. Buenos Aires. Argentina.
Telfono: 0221-4254900, int. 71.
E-mail: supervisin@dagostino-bruno.com.ar
Referencias bibliogrficas
1. American Diabetes Association. Diagnosis and Classifi-
cation of diabetes mellitus. Diab Care 2010; 33 Supl
1: S62-S69.
2. DCCT Research Group. The effect of intensive treat-
ment of diabetes on the development and progression of
long-term complications in insulin dependent-diabetes
mellitus. N Eng J Med 1993; 329: 977-86.
3. American Diabetes Association. Executive Summary.
Standards of Medical Care in Diabetes-2013. Diab Care
2013; 36 Supl 1: S4-S10.
4. American Diabetes Association. Standards of Medical
Care in Diabetes-2015. Diab Care 2015; 38 Supl 1.
Disponible en: www.diabetes.org/diabetescare. (Fecha
de acceso: 2 de enero de 2015).
5. National Glycohemoglobin Standarization Program. Dis-
ponible en: www.ngsp.org. (Fecha de acceso: 2 de enero
de 2015).
6. Sociedad Argentina de Diabetes. Documento de las Pri-
meras Jornadas Conjuntas de Consenso del Laboratorio
en Diabetes. Desarrolladas entre la Sociedad Argenti-
na de Diabetes Captulo Cuyo, la Asociacin Bioqumica
de Mendoza y la Facultad de Farmacia y Bioqumica de
la Universidad Juan Agustn Maza, 2009. Disponible
en: htttp:www.diabetes.org.ar/docs/Primeras_Jornadas_
Conjuntas_de_Concenso_del _Laboratorio_en_Diabe-
tes.pdf. (Fecha de acceso: mayo de 2014).
7. Little RR, Rohlfing CL. The long and winding road to
optimal HbA1C measurement. Clin Chim Acta 2013;
418: 63-71.
8. Omar F, van der Watt GF, Pillary TS. Reference change
values: how useful are they? J Clin Pathol 2008; 61:
426-7.
9. Ricos C, Cava F, Garcia-Lario JV, Hernandez A, Iglesias
N, Jimenez CV, et al. The reference change value: a
proposal to interpret laboratory reports in serial testing
based on biological variation. Scand J Clin Lab Invest
2004; 64: 175-84.
10. Mosca A, Branca MT, Carta M, Genna ML, Giorda CB,
Ghidelli R, et al. Recommendations for the implemen-
tation of glycated hemoglobin in Italy. GLAD Working
Group (HbA1C delegates WG). Clin Chem Lab Med
2010; 48: 623-6.
11. Sacks DB, Arnold M, Bakris GL, Bruns DE, Horvath AR,
Kirkman MS, et al. Guidelines and recommendations
for laboratory analysis in the diagnosis and management
of diabetes mellitus. Diabetes Care 2011; 34: e61-99.
12. International Federation of Clinical Chemistry and Lab-
oratory Medicine. Home Page. http://ifcchba1c.net. Fe-
cha de acceso: (2 de enero de 2015).
13. Mazziotta D, Correa JA . Control de calidad. En: Fernn-
dez Espina C, Mazziotta D, editores. Gestin de la Cali-
dad en el Laboratorio Clnico. Madrid: Editorial Mdica
Panamericana S.A.; 2005. p. 371-407.
14. Rohlfing CL, Wiedmeyer HM, Little RR, Grotz VL, Ten-
nill A, England J, et. al. Biological variation of glycohe-
moglobin. Clin Chem 2002; 48: 1116-8.
15. Unger G, Ruiz G, Milano P, Benozzi SF, Pennacchiotti,
GL. Evaluacin del desempeo analtico de tres mto-
dos de cuantificacin de hemoglobina A1c. Acta Bio-
qum Clin Latinoam 2014; 48(2): 183-9.
Recibido: 19 de febrero de 2015
Aceptado: 6 de julio de 2015
Acta Bioqum Cln Latinoam 2015; 49 (3): 295-9