IDENTIFICACIN DE TRIENO MENOR C18 E ISMEROS DE DIENO CONJUGADO EN ACEITE

DE SOJA HIDROGENADO Y MARGARINA POR GC-MI-FT-IR ESPECTROSCOPA

Abstracto

Los aceites vegetales se hidrogenan parcialmente para producir productos sabrosos de plasticidad adecuada. Los
componentes de estos nuevos productos dietticos son mezclas complejas de ismeros de cidos grasos con
diferentes propiedades nutricionales. Se describe un mtodo rpido para separar e identificar ismeros de ster
metlico de cidos grasos (FAME) de cido linolnico (octadecatrienoico, 18:3) y de cido octadecadienoico
conjugado (18:2), especies menores encontradas en aceite de soja hidrogenado y margarina, por capilaridad
Cromatografa de gases - aislamiento de matriz - espectroscopa infrarroja por transformada de Fourier (GC -
MI - FT - IR). Por este mtodo se identificaron FAMEs de ismeros cidos 18:3 en margarina, aceite de soja
hidrogenado en nuestro laboratorio y cido linolnico isomerizado, y se presentan por primera vez espectros
MI-FT-IR de ismeros geomtricos FAME de cidos octadecatrienoico y octadecadienoico conjugado. Cinco
grandes picos C18 trieno GC se encuentran en cromatogramas de isomerized metil linolenate, que representan
especies con configuraciones tri-cis y tri-trans y tres especies con configuraciones mixtas cis-trans. Los
ismeros FAME con estas configuraciones tambin se encuentran para un aceite de soja hidrogenado que tiene
un ndice de yodo de 111.
El linolenato de metilo (tri-cis) ya no se encuentra cuando el aceite de soja se hidrogena adicionalmente a un
valor de yodo de 96. Se obtienen espectros IR caractersticos de un ismero tri-trans para dos muestras de
ensayo con valores de yodo de 111 y 96. Adems del linolenato de metilo, Slo se encuentran ismeros con una
configuracin mono-trans di-cis para la margarina analizada. Tambin se encuentran ismeros FAME 18:2
conjugados cis-trans y trans-trans en todos los aceites de soja hidrogenados y margarina analizados.

Introduccin

El aceite de soja es la mayor fuente de aceite vegetal en el mundo de hoy. Tiene la ventaja de quedar lquido en
un intervalo de temperaturas relativamente amplio y se puede usar como una grasa plstica (semislida) despus
de la hidrogenacin parcial. Debido a que es sabroso, el aceite de soja procesado se utiliza en grasas, margarinas
y aceites de ensalada. Sin embargo, debido a su alto contenido de CH3CH2CH = CHCH2CH = CHCH2CH =
CH (CH2) 7COOH, cido linolnico (cido cis-9, cis-12, c-15-octadecatrienoico [c9, cl2, cl5-18: 3] - 8%), el
aceite de soja se hidrogen parcialmente para evitar la reversin del sabor (1).
Durante la hidrogenacin, los niveles de cidos linolnico y linoleico (cis-9, cis-12-octadecadienoico) se
reducen, mientras que los componentes de cis- y trans-monoeno de mayor punto de fusin se incrementan.
Adems de la saturacin parcial de enlaces dobles, tambin se producen reacciones de isomerizacin en cidos
grasos poliinsaturados. Tales reacciones conducen a la formacin de una serie de ismeros posicionales y
geomtricos (2). Se han encontrado ismeros de cido linolnico (18: 3), que es un cido graso esencial (3), en
aceite de ensalada comercial (4), margarina (5,6) y aceite de fritura (7), pero la naturaleza de su Metabolitos y
sus efectos fisiolgicos no son claros (8). Por otra parte, los ismeros conjugados del cido octadecadienoico
(18: 2) encontrados en la mantequilla y la margarina (9) son nuevos cidos grasos anticancergenos (10).
Perkins y Smick (4) estudiaron los cidos grasos octadecatrienicos de un aceite de soja parcialmente
hidrogenado, utilizando un protocolo de cristalizacin fraccionada volving, cromatografa lquida de alta
resolucin de fase inversa (RP-HPLC) y cromatografa de gases capilar. Tambin se utilizaron tcnicas de
separacin de mano de obra intensiva para el anlisis de margarina por Ratnayake y Beare-Rogers (5).
Recientemente se caracterizaron los ismeros de ster metlico de cido graso monoeno y dieno (FAME)
derivados de la margarina y el aceite de soja hidrogenado (11, 12) por espectroscopia de infrarrojo por
transformada de Fourier (GC-MI-FT-IR) 14). En el presente trabajo, estamos ampliando nuestro estudio para
incluir los ismeros trieno y dieno conjugado F A M E.
Este artculo describe un mtodo rpido para determinar las configuraciones de ismeros FAME 18: 3 obtenidos
a partir de aceite de soja hidrogenado, margarina y ster metlico de cido linolnico isomerizado, as como los
de FAMEs de dieno C18 conjugado.

Experimental

Materiales. El aceite de soja refinado fue comprado a un distribuidor local. Se obtuvo un catalizador de nquel
que contena azufre (1% de S, 20% de Ni) a partir de una fuente comercial. Slo se adquiri una margarina
comercial que contena aceite de soja de un distribuidor local de alimentos.
Preparacin y anlisis de muestras estndar y de prueba. Todas las soluciones se prepararon en isooctano.
Todos los estndares FAME fueron adquiridos de Alltech Associates. Las soluciones de ensayo se prepararon a
partir de margarina transesterificada, aceite de soja transesterificado o aceite de soja transesterificado
hidrogenado.
Hidrogenacin, esterificacin e isomerizacin. El aceite de soja se hidrogen en un reactor de vaso de presin
de 1 gal (Autoclave Engineers) a 1000 rpm y 138 kP de presin de H2. El catalizador de nquel que contiene
azufre se us a un nivel de 0,25% (2,5 g: 1000 g / catalizador: aceite) para la hidrogenacin, que se llev a cabo
a 200C ( 10C) durante 10 y 25 minutos (muestras de ensayo 24B Y 24 D, respectivamente) para obtener
valores de yodo de 123 y 111, respectivamente, segn se determina por el procedimiento oficial de la
Asociacin de Qumicos Analticos Oficiales (AOAC) (15: s 920.159). Se hidrogen otra muestra de ensayo
(7H) hasta un valor de yodo de 96 (0,1% de catalizador, 175 (+5) C, 4 h). Los FAMEs del aceite de soja y de
la grasa en una margarina comercial se prepararon por transesterificacin con trifluoruro de boro-metanol de
acuerdo con el mtodo AOAC oficial (15: s 969.33). El ster metlico de cido linolnico (Nuchek Prep) se
isomeriz con cido p-toluenosulfinico (PTSA) (Eastman Kodak) de acuerdo con el procedimiento descrito por
Mc Donald et al. (diecisis). Instrumentacin. Las separaciones por cromatografa de gases se realizaron en un
instrumento Hewlett-Packard Modelo 5890 equipado con un detector de ionizacin de llama (FID) y un
integrador HP Modelo 3392A. A50 - m50. Se utiliz una columna capilar CP-Sil-88 de 22 mm (i.d.)
(Chrompack) con una pelcula de fase estacionaria de 0,19 m. Se utiliz helio con un 1,5% de argn
(Matheson Gas Products) a aproximadamente 27 cm / s de velocidad lineal como gas portador y se utiliz helio
(99,995%) a 30 ml / min como gas de formacin para el detector. Las temperaturas del inyector y del detector
fueron 250 y 300C, respectivamente. La mezcla de gas portador se purific usando un filtro Hydro-Purge I I
(Alltech Associates) y un filtro purificador de gas calentado (Supelco). El modo de inyeccin fue splitless y se
utiliz una jeringa Hamilton 70 IN de 10 L. Inyecciones de aproximadamente 1 L se hicieron 6 s despus del
inicio de una carrera, y el tiempo de inyeccin total fue de 15 s. El inyector se purg 1 min despus del inicio de
una carrera. La temperatura inicial del horno en la columna era de 75 C con una retencin de 2 minutos,
seguido de un aumento de 20 / min a 185 C, y el horno se mantuvo a esta temperatura hasta que el anlisis se
complet.
Se calcul una relacin de separacin de efluente de columna de 4: 1, IR: GC, a partir de los factores de
respuesta FID (recuentos de rea / nanograma inyectado) encontrados con la columna conectada directamente al
detector y posteriormente a la interfase GC-MI.
A Mattson Instruments Modelo Se utiliz el espectrmetro Sirius 100 FT-IR equipado con una interfaz MI
Cryolect (Figura 1) que funcionaba a 12C bajo vaco. Este sistema se ha descrito en detalle (13, 14). El mtodo
M I implicaba la adicin de argn (1,5% Volumen) al gas portador G (helio) y atrapando el efluente sobre el
borde externo de un disco de oro de rotacin lenta (a aproximadamente 3 mm / min) mantenido a temperaturas
criognicas. Durante una operacin, el helio fue eliminado por las bombas de vaco, y las molculas de analito
rodeadas por un grupo de tomos de argn fueron congeladas en una matriz slida. Los analitos aislados en la
matriz de argn transparente de IR se analizaron posteriormente mediante espectroscopia IR. La posicin de
cada pico del analito en el disco de recoleccin de Cryolect se index por su tiempo de retencin de GC
observado. Los procedimientos se detallaron previamente (17) para localizar de forma reproducible un mximo
de pico en el disco de recogida y para optimizar el rendimiento del sistema.
Figura 2. Cromatogramas GC-FID truncados para FAME derivados de (a) ster metlico de cido linolnico isomerizado, (b)
aceite de soja parcialmente hidrogenado a valores de yodo de 123, (c) 111 y (d) 96. Tiempos de retencin y rea normalizada %
Se dan en la Tabla I. Configuracin de ismeros trienos: A, ttt, B, ttc; C, ttc y tcc; D, tcc; E, ccc. IS = estndar interno.
Asterisco (*) denota GC pico (rt 15,90 min) para dos FAMEs de celulizacin: 20: 0 y cis, cis 18: 2 especies. Los picos F, G y
son debidos a FAMEs conjugados. 22: 0 FAME dio lugar al pico I.

Estos ltimos procedimientos, que incluyen la alineacin ptica, pueden minimizar la extensin del
ensanchamiento del pico despus de la columna. Con la interfaz Cryolect, los lmites de deteccin para algunos
compuestos estn en el rango de picogramos (partes por trilln) (17). Son inferiores a los obtenidos con las
interfaces de tubo de luz de muestreo dinmico, ya que con la interfaz MI, los espectros IR se miden despus de
que la separacin del GC ha terminado (post-GC) y cada componente se atrapa en un punto compacto (0,5 mm
de dimetro ) En la matriz de argn slido.

GC-MI-FT-IR. Trescientos interferogramas de analito fueron coadded (2 min 43 s a 4 c m - 1 de resolucin), y

el fondo (300 scans) se recogi generalmente justo antes o despus del pico del analito.

Su tiempo de retencin de GC observado. Los procedimientos se detallaron previamente (17) para localizar
reproduciblemente un pico mximo en el disco de recoleccin y para optimizar el rendimiento del sistema.
Estos ltimos procedimientos, que incluyen la alineacin ptica, pueden minimizar la extensin del
ensanchamiento del pico despus de la columna. Con la interfaz Cryolect, los lmites de deteccin para algunos
compuestos estn en el rango de picogramos (partes por trilln) (17). Son inferiores a los obtenidos con
interfaces de tubo de luz de muestreo dinmico, ya que con la Interfaz MI, los espectros IR se miden despus de
que la separacin del GC ha terminado (post-GC) y cada componente est atrapado en un punto compacto (0,5
mm de dimetro ) En la matriz de argn slido.

GC-MI-FT-IR. Trescientos interferogramas de analito fueron coadded (2 min 43 s a 4 c m - 1 de resolucin), y

el fondo (300 scans) se recogi generalmente justo antes o despus del pico del analito.

RESULTADOS Y DISCUSIN

El cromatograma obtenido para el ster metlico del cido linolnico (c9, cl2, cl5-18: 3) y sus productos de
isomerizacin presentaron cinco picos marcados con A, B, C, D y E (Figura 2a), cuatro de los cuales Los
mismos tiempos de retencin que los encontrados para los diversos aceites de soja hidrogenados (Figuras 2b -
2d) y la margarina analizada. Los cromatogramas de la Figura 2 muestran que el pico D presenta un hombro, es
ms amplio que los otros picos de trieno y, por tanto, es probablemente el resultado de ms de un analito. Una
lista de los tiempos de retencin observados a 185 C para estos cinco picos F A M E se da en la Tabla I. El
tiempo de retencin observado para el pico coincide con el del estndar de linolenato de metilo. La
isomerizacin de cidos grasos cis con PTSA no altera la posicin de los dobles enlaces (18). Sin embargo, la
hidrogenacin cataltica de aceites convierte la configuracin de algunos de los dobles enlaces de cis a trans y
conduce a la formacin de ismeros de posicin en los que las posiciones de doble enlace ya no pueden ser las
mismas que en los materiales de partida. Por lo tanto, cada pico de CG para el aceite de soja hidrogenado
(Figura 2) o la margarina puede ser posiblemente debido a dos o ms ismeros posicionales de co-elucin con la
misma configuracin.

Tambin es posible que dos ismeros geomtricos puedan coeluir. Se obtuvieron hasta cuatro picos de trieno
FAME GC (marcados B, C, D y E) para los diferentes aceites de soja (Figura 2, Tabla I) y la margarina
analizada. Se obtuvo el linolenato de metilo (pico E) para aceites de soja que se hidrogenaron a valores de yodo
de 123 y 111 (Figuras 2b y 2c, respectivamente) y para margarina. Ya no se encontr (Figura 2d) en un aceite de
soja ms altamente hidrogenado (valor de yodo 96). El pico estuvo ausente del cromatograma de la
margarina. De los picos de trieno FAME, slo B, C y D eran comunes a los cromatogramas de las cuatro
muestras de prueba mostradas en la Figura 2.

Los espectros IR obtenidos para los picos GC A - E (Figura 3, Tabla II) eran consistentes con las estructuras
trieno - FAME. La inspeccin de estos espectros revel variaciones graduales en caractersticas espectrales entre
pares adyacentes. Especficamente, la intensidad relativa de las vibraciones de deformacin fuera del plano cis
= CH aument de los espectros A a E, donde como la deformacin trans = CH fuera del plano las vibraciones
disminuyeron. Estas tendencias son consistentes con un aumento progresivo en el carcter cis y disminucin en
el carcter trans, y sugieren que los picos A y se deben a ismeros FAME tri-trans (ttt) y tricis (ccc) 18, 3,
respectivamente. Los picos intermedios B, C y D son consistentes con especies de trieno que tienen
configuraciones cis y trans. El espectro de IR para el pico igual el del estndar de metil linolenato. Estos
resultados demuestran que GC-MI-FT-IR puede discriminar entre ismeros geomtricos.
GC picos y D fueron atribuidos a FAMEs con di-trans mono-cis (ttc) y mono-trans di-cis (tcc) FAME,
respectivamente, sobre la base de la intensidad de la = CH vibracin deformacin fuera del plano de un Trans,
relativo al de la banda carbonilo (Tabla II). Se observa que el ster metlico del cido eicosenoico (20: 1), un
constituyente menor del aceite de soja (19), se coilu con las especies de pico D bajo nuestras condiciones
experimentales. Esto se confirm mediante la coinyeccin del estndar 2 0: 1 con las muestras de ensayo.

Por lo tanto, para la margarina se obtuvo el espectro IR para el pico D substrayendo espectralmente la
contribucin (20%) del estndar FAME 20: 1 del espectro observado al tiempo de retencin del pico D. El
espectro de diferencias coincidi con el del pico D obtenido para Estndar de linolenato de metilo isomerizado.
El hecho de que la substraccin espectral no se requiriera para los aceites de soja hidrogenados investigados
implica que el nivel de 2 0: 1 era despreciable en estos materiales.
La intensidad de la banda trans a 971 cm ^ {- 1} para las especies de pico C del GC en el metil linolenato
isomerizado y en los aceites de soja hidrogenados caa dentro del intervalo de valores encontrados para las
especies y D, lo que sugiere la presencia de una mezcla de ismeros de trieno que tienen Ttc y tec. La
coelucin de estos dos ismeros geomtricos es consistente con los resultados de Grandgirard et al. (20) y
Ratnayake y Beare-Rogers (5), quienes isomerizaron el cido linolnico y caracterizaron los productos de
reaccin. Se observa que para la margarina analizada, la evidencia de I R observada para el pico C es
consistente con la presencia de slo especies de tcc.

Debido a que la reaccin de isomerizacin de c9, cl2, cl5-18: 3 produce ismeros de trieno con enlaces dobles
en las posiciones de carbono 9, 12 y 15 (18,20), el hecho de que los tiempos de retencin de trieno FAME
obtenidos para aceite de soja hidrogenado y margarina fueron Los mismos que los encontrados para el metil
linolenato isomerizado indican probablemente que los productos de hidrogenacin de trieno ms abundantes
encontrados en estos materiales son tambin insaturados en C9, C12 y C15.
Perkins y Smick (4) identificaron tentativamente tres triene FAME Ismeros de c9, cl2, cl5-18: 3 para un aceite
de soja parcialmente hidrogenado a partir de aceite de ensalada comercial como t9, t12, cl5-18: 3, c9, cl2, tl5-
18: 3 y t9, cl2, cl5 - 18: 3. Se informaron estructuras de trieno probables con configuraciones di-trans mono-cis
y mono-trans di-cis para algunos de los cuatro tipos de margarina analizados por Ratnayake y Beare-Rogers (5).
Estas configuraciones son consistentes con nuestros hallazgos.

Para los aceites de soja hidrogenados (Figuras 2b-2d) o la margarina analizada no se encontr el pico A del GC
(Figura 2a) para el linolenato de metilo isomerizado, que exhiba un espectro IR atribuido a una FAME de ttt-l8:
3. Bajo nuestras condiciones experimentales, el tiempo de retencin del pico A (15,95 min) difiri por 3 s de la
de otro pico (15,90 min, marcado con asterisco en la Figura 2) observado para todas las muestras de ensayo
analizadas. Este pico del GC se debi a dos especies de celulizacin: ster metlico de cido araqudico (20: 0),
que es un componente menor del aceite de soja (19), y una FAME insaturada c, c-18: 2. Una bsqueda IR de la
matriz de argn al tiempo de retencin conocido del pico A (15,95 min) revel la presencia de especies trans
 para dos de los aceites de soja hidrogenados (con valores de
yodo de 111 y 96). La substraccin espectral (factor 0,4) del
espectro obtenido a 15,90 min de la obtenida en el tiempo de
retencin del pico A produjo el espectro de diferencia
mostrado en la figura 4a. El espectro de diferencia era
caracterstico de una especie ttt-18: 3 (por ejemplo, banda
nica a 3035 cm ^ {- 1}). Los espectros presentados en la
Figura 5 son otra evidencia de que GC-MI-FT-IR puede
proporcionar especificidad estructural para ismeros
geomtricos en mezclas complejas.

Se observaron cuatro picos de GC adicionales (F - I) en

cromatogramas de aceite de soja hidrogenado (Figuras 2b -
2d) y margarina (Tabla I). Los compuestos que dieron origen
a los tres primeros de estos picos de GC presentaron
espectros de IR (Figuras 6 - 8) caractersticos

De estructuras conjugadas. En la Figura 7 se muestran

diferencias sutiles en las posiciones e intensidades relativas
de las bandas de vibracin de estirado dbil = CH en FAMEs
conjugadas. Las bandas a 986 y 950 cm -1 (trans) y 731 cm
-1 (cis) (Figura 8a) fueron Atribuido a cis-trans 18: 2
conjugado (picos GC y G) y la banda a 990 cm -1 (Figura 8b)
se debi a especies de cidos grasos trans, trans 18: 2 (GC
pico H) (21). Los cidos grasos conjugados en margarina y
mantequilla fueron determinados por espectroscopia
ultravioleta (9). Se determin que el compuesto que elua en
ltimo lugar (GC pico I) era 22: 0 FAME porque su espectro observado coincida exactamente con el de un
estndar.

La grasa de cerdo (22), la carne molida frita y los productos lcteos (23, 24) tambin contienen ismeros de
cido octadecadienoico conjugado. Estas especies se acumulan en las grasas depot y triglicridos cardacos de
humanos y otros primates (22), y se han aislado de suero humano, bilis y jugos duodenales (25). Otras fuentes
dietticas deben investigarse para los ismeros conjugados de cido octadecadienoico, ya que se ha informado
que estos compuestos son anticarcingenos y antioxidantes (10,26).

Conclusiones

El GC-MI-FT-IR capilar demostr ser una potente tcnica con hfenes para identificar rpidamente steres
metlicos de trieno de C1-8 y steres de cidos grasos de dieno conjugado menores en aceite de soja
hidrogenado y margarina. La sustraccin espectral computarizada, o preferiblemente el uso de GC
bidimensional, puede mejorar adicionalmente la capacidad de esta tcnica. Cuando se dispone de normas, GC-
MI-FT-IR puede utilizarse para cuantificar los niveles de FAME en mezclas complejas (11).

Los constituyentes trieno-feno C18 del aceite de soja parcialmente hidrogenado dependan de las condiciones de
hidrogenacin. Con un valor de yodo de 111, se identificaron metil linolenato y sus ismeros geomtricos tri-
trans, di-trans mono-cis y mono-trans di-cis. A un valor de yodo mayor de 123, no se observ el ismero tri-
trans, mientras que a un valor de yodo ms bajo de 96, no se encontr metil-linolenato de tri-cis. Se encontraron
configuraciones -cis y mono-trans di-cis para la margarina analizada. Las posiciones de doble enlace en
ismeros 18: 3 son probablemente las mismas que en c9, cl2, cl5 -18: 3. Se confirmaron las identidades de
FAMEs de cis-trans y trans, trans-C18 dinicos y FAME de 22: 0 en los aceites de margarina y de soja
hidrogenados analizados.

Reconocimiento
Los autores agradecen al Dr. D. Firestone para muchos comentarios tiles y K. Farren por asistencia tcnica.

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