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TD 4b: PCR

Le principe de la PCR (rappel)

pcrwin.zip
Choix des squences damorces
Amplification de 5 vers 3

Exercice n6
Dtermination de la taille
optimale des amorces
Spcificit de lhybridation assure par
T hybridation
longueur de lamorce
Longueur optimale de lamorce fonction de
la complexit du gnome

Exercice n7
Hybridation amorce-matrice
Choix de la temprature

Tm: t o 50% de lADN est double brin


Zone daccrochage: de 13 25 nuclotides
formule empirique Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Temprature dhybridation: Tm - 4C
Un msappariement est possible, mais pas nimporte o
Tm baisse de 1 1,5C par % de non homologie

Exercices n8, 21
Exercice n9
Amplifier lARN: la RT-PCR

A
Reverse transcriptase

A
B ADN polymerase

A
Amplification cyclique
Quantifier lADN:
la PCR quantitative
96 Replicates
1.40E+00 Analyse point Final

9.00E-01

Analyse temps rel


4.00E-01
1

11

16

21

26

31

36
-1.00E-01
Cycle Number
Detection de fluorescence au cours dune PCR
Les chimies fluorescentes

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Molecular_Biology/PCR/Product_Lines/Quantitative_PCR.html
La chimie Taqman

Quenching

Sonde TaqMan

FRET

Amorce sens R Q
5 p
3 5

5 3
5
Amorce anti-sens
Lactivit exonuclasique de la polymrase dcroche
le reporter qui mettra de la fluorescence aprs
excitation par un laser 500 nm
Polymerisation R = Reporter
Forward
Q Q = Quencher
5'
Primer R Probe
p 3'
3' 5'

5' 3'
5'
Reverse
Primer

Dplacement de la sonde R
Q
5' p 3'
3' 5'

5' 3'
5'

Clivage R
Q
5' p 3'
3' 5'

5' 3'
5'

Polymerisation termine R Q
p 3'
5'
3' 5'

5' 3'
5'
Systme de dtection

ABI Prism 7700

Intgr dans un seul instrument

Analyse
Preparation PCR Detection de la
de L'chantillon spcifique
fluorescence
l'application

Dtection en temps rel des produits de PCR


Plusieurs types de fluorophores
possibles
Ct: cycle au cours duquel dmarre la
phase exponentielle de la PCR

Phase exponentielle

96 replicats
1.00E-01
Cycles

8.00E-02

6.00E-02

Seuil de Dtection
4.00E-02
(Threshold)
2.00E-02

0.00E+00
20 22 24 26 28 30

-2.00E-02 CYCLE SEUIL


(Ct)
Equation de lamplification de la PCR

Xn = Xo x (1 + Ex)n

Xn = nombre de cibles au cycle n


Xo = nombre initial de molcules cibles
Ex = efficacit de la PCR
n = nombre de cycles de PCR
Ct est proportionnel au nombre de cibles
amplifier
Ct est reproductible dune amplification
lautre

Dilutions au 1/5
Conditions pour une PCR quantitative
multiplex sur ABI Prism 7700 (Mas)
Tampon denzyme
Nuclotides: dATP, dCTP, dGTP, dUTP
Uracile N-Glycosylase (UNG)
Chlorure de magnsium
Oligonuclotides: LTP1 et LTP2
Sonde TaqMan LTP: VIC 5-----------------3 TAMRA
Oligonuclotides: 35S1 et 35S2
Sonde TaqMan 35S: FAM 5-----------------3 TAMRA
ADN polymrase
ADN gnomique (100 ng)
Eau distille strile (qsp 25 l)
Conditions damplification

2 Tempratures : Chimie TaqMan


Activation de
Tm des amorces : 60C
l'UNG
Tm de la sonde : + 7 12 C
UNG: uracyle N-
glycosylase:vite une
contamination par le Activation de Collection des donnes
produit pr-amplifi l'AmpliTaq Gold
Dtermination dune courbe standard
Ct = a x log (Qt ADN cible) + b
Ex = [10(1/a) - 1] x 100

Pente efficacit de la PCR (p=3,32 -> E=100%)


Efficacit identique pour deux
chantillons: dosage comparatif possible

Pente : -3,44
E = 95%
Gne 1
Ct gne 1

Ech 2
Rference Gne 2

Ct gne ref

Qt gne 1 Qt gne ref


Application: dosage de transgnes
Prparation dune gamme talon Exercice n35

dtermination de la quantit dADN total


dtermination de la quantit dADN transgnique
quantit ADN total (ng) 200 100 50 25 5 2,5
quantit ADN transgnique (ng) 4 2 1 0,5 0,1 0,05

Amplification dun gne de rfrence Amplification dune squence du transgne


Ct Ct
Ct = a x log (Qt ADN total) + b

Ct = a x log (Qt ADN transgnique) + b

log (Qt ADN total (ng)) log (Qt ADN transgnique (ng))

% dOGM contenu dans lchantillon = Qt dADN transgnique/Qt totale dADN x 100


Utilisation: dtection de SNP
(single nucleotide polymorphism)

Allele 2
VIC TAMRA FAM TAMRA

VIC FAM

Allele 1
VIC TAMRA FAM TAMRA

2 sondes allle spcifiques


Clivage inefficace en cas de mismatch