Manual de Prcticas de Microbiologa

Blgo. Luis Cartagena S.

Prctica:
Vas de Inoculacin
Las rutas ms comnmente empleadas para la inyeccin de productos biolgicos en
animales de experimentacin son la intravenosa, subcutnea, intradrmica,
intraperitoneal e intracerebral.

VA VENOSA
En el conejo se practica la inoculacin en la vena marginal de la oreja. Para realizarlo, un
asistente debe inmovilizar al animal o bien ser colocado en una caja que presente una
abertura por la cual se hace salir nicamente la cabeza.

La cabeza se desinfecta con alcohol yodado presionando en su base sobre la vena, con el
fin de lograr el abultamiento o dilatacin de sta, procedindose a introducir la aguja
calibre 26, en la direccin de la corriente sangunea, inyectndole lentamente el material
biolgico. Invariablemente todas las inoculaciones deben ser hechas en la misma oreja,
dejando la otra para la sangra.

En el ratn esta inoculacin se realiza en la vena del rabo o en la vena dorsal del pene, y
en los cuyes se realiza en las venas de las patas posteriores, introducindole la aguja entre
los dedos.

VA INTRAPERITONEAL
Para realizar esta inoculacin, sea en conejo, cuy o ratn, se depila y desinfecta la zona
del abdomen escogida, un asistente sujeta al animal y lo mantiene con la cabeza
ligeramente inclinada hacia abajo.

Se introduce la aguja perforando la piel en sentido oblicuo y luego con un movimiento

rpido se atraviesa la capa muscular y el peritoneo, y se inocula.

VA SUBCUTNEA
En los animales pequeos las inyecciones subcutneas, generalmente se realizan bajo la
piel del vientre o cara interna del muslo. En animales de gran porte como el caballo se
acostumbra hacerlo en el cuello o en cualquier otro sitio de fcil acceso.

VA INTRADRMICA
Se hace en el vientre o en el dorso, despus de haber depilado y desinfectado el rea se
introduce la aguja en direccin casi paralela a la piel y con el bisel hacia arriba, luego se
rota la jeringa a fin que el bisel de la aguja quede hacia abajo y se procede a inocular el
material. La formacin de una ampolla indica que la inoculacin se ha hecho
correctamente.

VA INTRACEREBRAL
Esta ruta es de gran aplicacin en el trabajo con virus. El animal debe ser anestesiado
para lograr una perfecta inmovilizacin. Con animales grandes es necesario trepanar la
cabeza craneana previo a la introduccin de la aguja hipodrmica; para cuyes y ratones se
hace uso de agujas resistentes, inoculndose en una sutura entre el ojo y la oreja.
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Objetivo: Entrenar al investigador en las diferentes vas de inoculacin en animales de

experimentacin ya sea para investigar las propiedades patognicas de un
microorganismo o sus productos, o para la obtencin de sueros inmunes.

Sustancia Biolgica:
Solucin Salina Fisiolgica (SSF) estril.

Material:
Guantes, mascarilla, gorro, protector visual
Mechero con ron de quemar y fsforo
Jeringas descartables de 20 mL, 10 mL, 5 mL y de tuberculina
Alcohol de 70 con 1% de tintura de yodo
Algodn
Navaja nueva
Animales de laboratorio: Conejos, Cuyes, Ratas, Ratones

Cantidad de inoculo a inyectar:

VA CONEJO COBAYO RATA RATN

Subcutnea 20,0 mL 10,0 mL 5,0 mL 1,5 mL
Intramuscular 8,0 mL 5,0 mL 2,0 mL 0,5 mL
Endovenosa 10,0 mL 5,0 mL 3,0 mL 0,5 mL
Intraperitoneal 10,0 mL 5,0 mL 3,0 mL 2,0 mL

Tipos de agujas hipodrmicas para diferentes propsitos:

CALIBRE LONGITUD
Inyeccin Intravenosa (conejo) 25 - 27
Inyeccin Intraperitoneal (conejo) 20 - 24 1
Inyeccin Subcutnea (conejo) 20 - 24 1
Inyeccin Intradrmica (cuyes) 27 - 28
Inyeccin Subcutnea e intrabdominal de material
18 1,5
viscoso o sangra de conejo del corazn
Puncin cardiaca (cuyes) 22 1 1,5

Procedimiento:
Cualquiera que sea la va de inoculacin, debe tener en cuenta lo siguiente:
Depilar y desinfectar la zona elegida
Elegir la aguja apropiada y acoplarla adecuadamente a la jeringa a utilizar cerca de un
mechero
Cargar la jeringa cerca de un mechero teniendo en cuenta las medidas de asepsia
Bajo la supervisin del instructor se procede a inocular en las diversas vas
mencionadas
Esquematice los diversos mtodos de inoculacin practicados por usted en el
laboratorio.
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Esquemas o dibujos:

Cuestionario:
1. Para qu pueden ser usados los gallos en inmunologa?
2. En que vaso se realiza la sangra en las aves?
3. Qu es un esquema de inmunizacin?
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4. Cul es el mecanismo por la cual una inyeccin subcutnea o intraperitoneal
desensibiliza un animal que se encuentra en estado de anafilaxia?
Prctica:
Shock anafilctico
El shock anafilctico es una de las ms dramticas manifestaciones de interaccin
antgeno anticuerpo in vivo. Es una reaccin sistmica que depende de la liberacin
de histamina y otras sustancias biolgicamente activas. El shock anafilctico es
producido en numerosos animales pero el cobayo responde ms dramticamente. En el
hombre se observar en casos de sensibilizacin a la penicilina, vacunas tficas etc.

En la produccin de la reaccin anafilctica existen 2 periodos marcados. El primero

llamado sensibilizante es producido por la inyeccin de un antgeno generalmente
inyectado por va intraperitoneal o subcutnea seguido de un periodo de latencia que
permitir al anticuerpo formado, fijarse en los tejidos.

En el segundo periodo o desencadenante es producido 2 a 3 semanas despus de la

sensibilizacin con una dosis de antgeno mayor e inyectado en el torrente circulatorio
(por va endovenosa o va intracardiaca).

Objetivo: Entrenar al estudiante en el reconocimiento de manifestaciones de la reaccin

de Shock anafilctica.

Muestra Biolgica:
Muestra de albmina de huevo al 1% o seroalbmina bovina al 0,1%.

Material y Medio de cultivo:

Guantes, mascarilla, gorro.
Mechero con ron de quemar y fsforo
Jeringas y agujas hipodrmicas (tuberculina)
Alcohol yodado.
Navaja.
Antihistamnico.

Procedimiento:
Inocular por va intraperitoneal 1 mL de solucin de albmina de huevo al 1% 0,5
mL de seroalbmina bovina al 0,5% a dos cobayos.
Despus de un periodo de 15 das o 3 semanas de la primera inyeccin, inocular por
va intracardiaca 1 mL de solucin de albmina de huevo al 5% 0,5 mL de
seroalbmina bovina a 0,5% a un cobayo (cobayo N 1)
Al otro cobayo (N 2) aplicarle por va endovenosa 10 mg. De antihistamnico y
luego 1 mL de la solucin de albmina 0,5 mL de la seroalbmina bovina.
Observar los sntomas caractersticos de la anafilaxia en el cobayo N 1; erizamiento
del pelo, se rasca la nariz, expande las fosas nasales, se presentan convulsiones, la
respiracin se va haciendo cada vez ms lenta, abriendo la boca en cada uno de los
esfuerzos inspiratorios, hay relajamiento de esfnteres y el animal puede llegar a
morir. Observar tambin el segundo cobayo y anotar las diferencias entre ambos.
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Resultados:
Anote las manifestaciones presentadas en el animal N 1 y en el N 2.

MANIFESTACIONES
ANIMAL Relajacin
Erizamiento Rascado de Convulsion
de Otros
del pelo la nariz es
esfnteres

COBAYO N 1

COBAYO N 2

Haga la representacin grfica de lo observado.

Cuestionario:
1. Tiene el shock anafilctico alguna aplicacin prctica?
2. Cul es el mecanismo del shock anafilctico?
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3. Cules son los casos ms frecuentes de shock anafilctico en el hombre?
4. Qu papel cumplen las clulas cebadas y las basfilas en la reaccin anafilctica?
Prctica:
Fagocitosis
La fagocitosis es el principal mecanismo de defensa por el cual el cuerpo se protege
de partculas extraas, incluyendo bacterias que entran en l. En este proceso, hay dos
formas de agentes de trabajo, la celular y la humoral. El elemento celular consiste en
la fagocitosis celular, los cuales son comnmente clasificados como micrfagos y
macrfagos.

La demostracin de la accin de los macrfagos es ms dificultoso en los ejercicios de

laboratorio, pero el polimorfismo, una de las clulas tipo, incluyendo los micrfagos si es
fcilmente observable.

Objetivo: Demostrar la habilidad fagocitaria de los leucocitos polimorfonucleares frente

a microorganismo.

Muestra Biolgica:
Cultivos de 24 horas de Staphylococcus aureus y Bacillus cereus (vivos y calentados)
ajustado al tubo N 3 del nefelmetro de Mc Farland.

Material:
Guantes, mascarilla, gorro, protector visual
Mechero con ron de quemar y fsforo
Cuy o ratones previamente inoculados con S. aureus o B. cereus
Cuy sin previa inoculacin
ter
Torundas estriles
Tijeras y pinzas de diseccin
Lminas portaobjetos
Solucin de colorante de Leishman
Pipetas o goteros

Procedimiento:
2 a 4 horas antes de iniciar la prctica inocule un cuy o ratn con el cultivo muerto
(calentado) de S. aureus o B. cereus
Inicie la prctica inoculando intraperitonealmente 0,5 mL de cultivo vivo de
S. aureus o B. cereus al cuy o ratn anterior (al previamente inoculado)
Inocule cultivo vivo de S. aureus o B. cereus similarmente a otro cuy o ratn no
preparado previamente
A un tercer cuy o ratn no inocular (servir como testigo)
A las 2 horas del paso anterior, sacrifique ambos cuyes o ratones inoculados y al
tercer cuy o ratn testigo, ponindolo en una cmara de ter
Abra la cavidad abdominal y humedezca una torunda en el lquido peritoneal
Rote cuidadosamente la torunda sobre una lmina portaobjeto, seque al aire o
ambiente y coloree con Leishman
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Observe la presencia de bacterias libres y la existencia de clulas mostrando bacterias
englobadas.
Resultados:
Registre los resultados utilizando el siguiente cuadro:

OBSERVACIN BACTERIAS BACTERIAS

ANIMAL LIBRES FAGOCITADAS
Cuy o Ratn preinoculado S. aureus
+ cultivo vivo de: B. cereus
Cuy o Ratn S. aureus
+ cultivo vivo de: B. cereus
Cuy o Ratn testigo

Esquematice las observaciones microscpicas.

Cuestionario:
1. Defina: a) Inmunidad Celular, b) Opsonizacin
2. Se realizar fagocitosis si inocula a un ratn con toxina tetnica?
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3. Qu papel cumple el complemento en la fagocitosis?

Prctica:
Reacciones Serolgicas
Las dos principales reacciones serolgicas (Ag-Ac) que se estudiaran son la
aglutinacin y la precipitacin.

Ambos resultan de la unin fisicoqumica del antgeno y el anticuerpo. Si el antgeno esta

en forma soluble la reaccin se llama precipitacin y si es particulado como bacterias,
glbulos rojos o antgenos observados en bentonita, ltex, etc., se llama aglutinacin.

Reacciones de Aglutinacin
Se realizar la aglutinacin bacteriana y la hemaglutinacin directa.

Aglutinacin Bacteriana
Constituye uno de los mtodos de diagnstico de mayor importancia en enfermedades
tales como la tifoidea, fiebres paratficas, brucelosis, etc., entre todas ellas tienen
importancia fundamental para nosotros la Reaccin de Widal, para el diagnstico de la
fiebre tifoidea y fiebres paratficas; la de Huddleson, para el diagnstico de la brucelosis.

Objetivo: Adiestrar en la aplicacin de un mtodo diagnstico para la deteccin de

anticuerpos febriles.

Muestra Biolgica:
Suero de un paciente que padece un proceso febril, sospechoso de tifoidea.

Material y Reactivos:
Guantes
Suspensiones comerciales con antgeno: Tfico O, Tfico H, Paratfico A,
Paratfico B y Brucella abortus
Lmina escavadas para aglutinacin con varios espacios marcados
Pipetas Pasteur
Pipetas de 0,2 mL
Mondadientes
Marcador indeleble

Procedimiento:
TECNICA CUALITATIVA
Rotule la lmina escavada en los cinco espacios con las letras: O, H, A, B, Br
Con la pipeta de 0,2 mL coloque una gota de 0,08 mL de suero problema en cada uno
de los cinco espacios marcados en la lmina
Agregar una gota de cada uno de los reactivos (antgenos) correspondientemente a
cada gota de suero problema
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Mezcle uniformemente con palito mondadiente (distinto palito para cada lugar).
Rotar la lmina por unos 5 minutos
La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable, que
tienden a agruparse en la periferie de la gota
Anote los resultados y contine con la cuantificacin del ttulo del anticuerpo

TECNICA SEMICUANTITATIVA
Con la pipeta de 0,2 mL coloque 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 y 0, 005 del suero problema y
del suero control sobre los espacios de la lmina de aglutinacin
Seleccione el antgeno cuya prueba cualitativa haya resultado positiva y agregue una
gota del antgeno seleccionado a cada alcuota del suero previamente dispuesto
Mezcle con un mondadiente empezando por la dilucin mayor y continuando con las
diluciones menores. Mezcle con movimientos rotatorios la placa por 5 minutos
La presencia de grumos indica una reaccin positiva
La lectura se efectuar de acuerdo a la equivalencia siguiente:
0,08 mL = 1 : 20 de ttulo
0,04 mL = 1 : 40 de ttulo
0,02 mL = 1 : 80 de ttulo
0,01 mL = 1 : 160 de ttulo
0,005 mL = 1 : 320 de ttulo

INTERPRETACIN
Ttulos mayores de 1:80 tienen significacin diagnstica. Pruebas ms exactas de
aglutinacin se realizan en tubo.

Resultados:
TTULO
SUERO DEL PACIENTE
SUERO CONTROL

Realice la representacin grfica de lo observado.

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Hemaglutinacin directa (grupo sanguneo)

El empleo ms evidente de la reaccin de antgeno anticuerpo por este procedimiento,
es la determinacin de grupos sanguneos. Los glbulos rojos humanos tienen en la
superficie antgenos que determinan el tipo sanguneo: A, B, AB, y los que no poseen
estos antgenos se les llama grupo O

El mayor porcentaje de la poblacin posee el antgeno D (factor Rh).

Objetivo: Adiestrar en la determinacin de grupos sanguneos e interpretar

correctamente el resultado.

Muestra Biolgica:
Sangre

Material y Reactivos:
Guantes
Sueros comerciales anti A, anti B, anti D (Rh)
Alcohol yodado
Algodn
Lancetas estriles
Lminas portaobjetos
Palitos mondadientes
Marcador indeleble

Procedimiento:
Rotule la lmina portaobjeto con las letras: A, B y D (o Rh)
Limpiar cuidadosamente la yema del dedo medio con algodn humedecido en alcohol
yodado. Deje que seque la regin desinfectada
Coloque una gota de cada reactivo (anticuerpos) segn lo marcado
Punzar (pinchar) con la lanceta la yema del dedo preparado y deje caer
separadamente tres gotas de sangre en una lmina portaobjetos
Mezcle con palito mondadiente (distinto palito para cada lugar) y luego rote la lmina
portaobjeto durante uno o dos minutos y observar la presencia de grumos que indica
aglutinacin

Resultados:
1. Tipo sanguneo:
2. Factor Rh:

Realice la representacin grfica de lo observado.

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Cuestionario:
1. Defina: a) Ttulo, b) Hemlisis
2. Qu colorante vital puede ser empleado para tener antgenos para aglutinacin y
cules son sus ventajas frente a los colorantes comunes?
3. Puede una reaccin de aglutinacin dar resultados positivos cuando n hay infeccin
aparente?
4. Dnde estn localizados los isoantgenos hemticos?
5. Puede cambiar durante su vida el grupo sanguneo de una persona?
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6. Qu factores pueden explicar las reacciones falsas positivas o negativas en la
clasificacin de los grupos sanguneos?
Reaccin de Precipitacin
Reaccin de V. D. R. L. (Cualitativa)
Innumerables tcnicas diferentes han sido propuestas y descritas para el diagnstico
sexolgico de sfilis; tales como, la reaccin de Waserman, Hinton, Kolmer, Tagle,
Meinicki, Kabin etc., todas basadas en el mismo principio; sin embargo, una de ellas
tiene especial inters para nosotros debido a ser, dentro de todas la que proporciona
resultados con un menor nmero de falsos positivos; es la reaccin de V. D. R. L.
(Veneral Disease Research Laboratory), razn por la cual nicamente nos ocuparemos de
ella.

Objetivo: Adiestrar en la Prueba de Reaccin de V.D.R.L. e interpretar correctamente el

resultado.

Muestra Biolgica:
Suero de paciente sifiltico

Material y Reactivos:
Guantes
Reactivo comercial V. D. R. L. (antgeno)
Solucin Salina Bufferada (forma comercial)
Lmina de vidrio escavada
Rotador de Manzini (no indispensable)
Frasco vaco de ms o menos 20 mL de capacidad con tapa
Jeringa con aguja N 22

Procedimiento:
A. Preparacin del Suero
Proceder en forma igual que para la reaccin Kahn (inactivar a 56 C por 30 minutos)
B. Preparacin del Antgeno
Colocar en el fondo del frasco: 0,4 mL de la solucin salina bufferada
Aadir 0,5 mL de antgeno sobre la solucin salina ya medida, mientras
simultneamente se da al frasco un movimiento de rotacin sobre una superficie lisa
La mezcla debe efectuarse en 6
Soplar la ltima gota de antgeno y continuar rotando durante 10
Agregar 4,1 mL de solucin salina con una pipeta de 5 mL
Tapar el frasco y agitar vigorosamente durante 10. La emulsin de antgeno as
preparada se puede usar durante un da
C. Verificacin de la Prueba
Colocar en la lmina excavada 0,05 mL de suero problema ya inactiva
Aadir una gota de la emulsin de antgeno usando para este fin la jeringa que lleva
la aguja N 22 con el bisel dirigido hacia abajo y en posicin horizontal
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Llevar las lminas al rotador de Manzini durante 4
Hacer la lectura de la prueba inmediatamente
D. Lectura e informe de los resultados
Se realiza microscpicamente a 100X

Resultados e interpretacin:
NO REACTIVO: Ausencia de grumos
REACTIVO: Grumos grandes, medianos o pequeos.

REACCIN CUANTITATIVA
De todas aquellas pruebas cualitativas cuyo resultado haya sido positivo, se preparan
diluciones dobles del suero en cuestin que abarquen desde 1/2 hasta 1/1024 en solucin
salina al 9,0%, se prueba cada una como si fuera una reaccin cualitativa y se observa al
microscopio. El resultado ser la mayor dilucin del suero que de una reaccin positiva,
debindose desechar aquellos positivos dbiles ejemplo:
1/2 (P); 1/4 (P); 1/8 (PD); 1/16 (N);
P : positivo
PD : positivo dbil
N : negativo
Resultado = Positivo 4 dilucin o positivo 1/4
Cuando la reaccin cuantitativa da un resultado negativo en todas las diluciones se
informar: POSITIVO EN SUERO SIN DILUIR

Realice la representacin grfica de lo realizado.

Cuestionario:
1. Cul es la composicin qumica de la cardiolipina?
2. A qu cree Ud. que se debe el que la emulsin final del antgeno sea turbio, mientras
que la solucin madre es totalmente transparente?
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3. Puede presentarse en el V.D.R.L. una reaccin de zona y como podra ser evitada?
4. Por qu razn cuando un suero precipitante se diluye pierde rpidamente su ttulo?