UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

Escuela Acadmico Profesional de Tecnologa Mdica

MANUAL DE BACTERIOLOGA
Edgar Gonzales Escalante

2014
BACTERIOLOGA

INDICE GENERAL

ndice general 2

Normas de bioseguridad 3

Prctica N 1: Tcnicas de esterilizacin en bacteriologa 6

Prctica N 2: Tinciones bacteriolgicas 11

Prctica N 3: Preparacin de medios de cultivo 19

Prctica N 4: Tcnicas de siembra para bacterias 25

Prctica N 5: Morfologa bacteria y caractersticas de

Crecimiento en los cultivos 28

Prctica N 6: Estudio del metabolismo bacteriano 30

Prctica N 7: Identificacin del genero Staphycoccus 35

Prctica N 8: Identificacin del genero Streptococcus

Enterococcus 37

Prctica N 9: Identificacin del genero Neisseria Moraxella 39

Prctica N 10: Identificacin de bacilos gram positivos 41

Practica N 11: Identificacin de Enterobacteriaceae 43

Prctica N 12: Estudio de Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas 46

Practica N 13: Estudio de Bacilos Gram Negativos No

Fermentadores 49

Prctica N 14: Estudio de Bacterias Fastidiosas 52

Practica N 15: Estudio de Mycobacterias 54

Practica N 16: Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana 56

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BACTERIOLOGA

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

El trabajo en el laboratorio de bacteriologa debe ser considerado de alto riesgo

para todo el personal de laboratorio debido al manejo de muestras clnicas
potencialmente contaminadas con patgenos microbianos y de cultivos de
microorganismos obtenidos a partir de dichas muestras clnicas. La exposicin
del personal de laboratorio a este riesgo debe ser minimizada y controlada
mediante un plan de bioseguridad en el laboratorio clnico. Los riesgos
biolgicos infecciosos ms comunes en el laboratorio clnico incluyen cultivos
de microorganismos (bacterias, micobacterias, hongos, virus y parsitos) en
altas concentraciones, muestras clnicas de origen humano o animal
conteniendo agentes infecciosos y otros riesgos como toxinas, alergenos,
productos recombinantes, etc.

Es importante considerar que existen cuatro elementos necesarios para que se

inicie una infeccin; un hospedero susceptible, un agente infeccioso, la
concentracin de dicho agente infeccioso (dosis infectante), y una ruta de
transmisin. Esta ltima es la nica que puede ser controlada por medio de
normas de bioseguridad y por lo tanto es indispensable brindarle especial
atencin a las rutas ms comunes de transmisin; oral, respiratoria, percutnea
y contacto directo con la piel y/o las mucosas.

Toda muestra clnica; fluidos corporales, tejidos y cultivos microbianos deben

ser considerados como infecciosos para el personal de laboratorio y deben ser
manipulados bajo determinadas medidas de contencin, las cuales incluyen
adecuadas prcticas microbiolgicas, la utilizacin de barreras fsicas, un
adecuado diseo de laboratorio y cmaras de bioseguridad. El uso de vacunas
seguras y eficaces puede proporcionar un mecanismo adicional para la
reduccin de las infecciones ocupacionales.

El establecimiento de los programas de bioseguridad en el laboratorio de

bacteriologa mdica es responsabilidad de los administradores del mismo. Sin
embargo, es importante tener claro que no es posible crear un ambi ente de
laboratorio saludable y seguro sin que cada una de las personas que laboran
en l no asuma su cuota de responsabilidad hacia la seguridad en el
laboratorio.

2. Clasificacin de microorganismos por grupos de riesgo

El concepto de grupo de riesgo fue desarrollado como una manera de clasificar
los diferentes tipos de microorganismos (bacterias, virus, hongos, parsitos)
dependiendo del grado de virulencia para el ser humano, animales y plantas.
Se han definido cuatro grupos de riesgo de microorganismos, cuyas
caractersticas se indican a continuacin:

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BACTERIOLOGA

3. Niveles de bioseguridad

Nivel de bioseguridad 1
En el nivel de bioseguridad 1 los microorganismos que pueden ser
manipulados estn bien definidos y caracterizados por tener una muy baja o
ninguna virulencia para personas adultas saludables y pertenecen al grupo de
riesgo 1. El acceso a este laboratorio debe ser limitado o restringido y las
puertas y ventanas deben de permanecer cerradas, el mobiliario debe ser fcil
de lavar y desinfectar y tienen que estar disponibles lavamanos con jabn,
desinfectante y papel toalla. Todos los desechos generados que implican algn
riesgo biolgico deben ser autoclavados o incinerados.
Los procedimientos operativos deben estar incluidos en las guas de
bioseguridad en el laboratorio, deben estar claramente detalladas por escrito y
accesibles en todo momento para el personal de laboratorio. Se debe
proporcionar un entrenamiento inicial en prcticas microbiolgicas, en las guas
de bioseguridad y en los procedimientos para el control de las infecciones a
cada uno de los nuevos empleados, estudiantes y visitantes.

Nivel de bioseguridad 2
En laboratorios del nivel de bioseguridad 2 es donde se efecta la mayor parte
del trabajo rutinario del laboratorio de bacteriologa clnica, incluyendo el
manejo de muestras clnicas de diversa ndole y la manipulacin de cultivos de
microorganismos.

En este laboratorio debe estar disponible una autoclave para esterilizar todos
los desechos infecciosos y los procedimientos que involucren la generacin de
aerosoles deben ser efectuados en una cmara de bioseguridad clase II. Se
deben utilizar guantes, anteojos protectores y bozales cuando se manipulan
muestras clnicas, cultivos microbianos o material contaminado.

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BACTERIOLOGA

Se debe limitar al mximo el uso de agujas y jeringas y extremar los cuidados

para minimizar el riesgo de una autoinoculacin y de generacin de aerosoles.
Todos los derrames de material infecciosos y accidentes deben ser
inmediatamente reportados al responsable del laboratorio y al director del
laboratorio clnico.

El director del laboratorio clnico, con el apoyo de los responsables de los

diferentes laboratorios a su cargo, es el responsable directo de establecer y/o
aprobar todas las polticas y los procedimientos para la operacin segura del
laboratorio.

Nivel de bioseguridad 3
Los microorganismos que deben ser trabajados en el nivel de bioseguridad 3
son altamente infecciosos, pueden causar graves infecciones sistmicas en
seres humanos inmunocompetentes e incluyen a Mycobacterium tuberculosis,
Coxiella burnetii y las especies de Brucella.

Todas las actividades de laboratorio, incluyendo el manejo de muestras clnicas

y de cultivos microbianos, deben ser realizadas en cmaras de bioseguridad
clase II o utilizando combinaciones de proteccin personal y contencin fsica.
El laboratorio debe estar fsicamente separado de reas abiertas al trfico no
restringido de personal de las instalaciones. El laboratorio debe tener un
lavamanos colocado cerca de la salida y debe tener un dispositivo que permita
abrir el grifo del lavamanos con el pie, con el codo o automticamente.

Las ventanas deben ser selladas y las puertas deben tener un dispositivo para
que se cierren por s mismas. Debe tener un sistema de ventilacin diseado
de tal manera que sea unidireccional e ingrese al laboratorio por el rea de
entrada.

Nivel de bioseguridad 4
El nivel de bioseguridad 4 es el mximo nivel de contencin fsica para el
trabajo con microorganismos altamente infecciosos causantes de
enfermedades exticas, usualmente mortales, para las cuales no se tienen
vacunas y tratamientos eficaces. Presenta nicamente agentes virales, como
los virus Ebola y Hanta, pero no agentes bacterianos.

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BACTERIOLOGA

PRCTICA No. 1
TCNICAS DE ESTERILIZACIN EN BACTERIOLOGA

Desinfeccin y agentes desinfectantes

Desinfeccin, describe la destruccin de microorganismos presentes en la
superficie de implementos, equipos y manipuladores, utilizando sustancias
qumicas denominadas desinfectantes (o antispticos de acuerdo al uso). La
desinfeccin no implica esterilizacin, pues no siempre se eliminan todos los
microorganismos y sus estructuras de resistencia. Los desinfectantes son
sustancias qumicas aplicadas sobre objetos y superficies; los antispticos son
sustancias qumicas aplicadas sobre la piel y mucosas.

Todo buen mtodo de desinfeccin deber cumplir las siguientes condiciones:

Eliminar el mayor nmero de microorganismos (al menos todos los
patgenos).
Ser econmico.
No debe ser corrosivo, toxico o irritante para los tejidos.
Al menos soluble al agua.

Agentes desinfectantes usados en bacteriologa y su mecanismo de accin

Existen diversos mtodos fsicos de esterilizacin y de inhibicin del

crecimiento microbiano, como pueden ser el calor, la filtracin y la radiacin,
pero el ms ampliamente usado es el calor, ya sea hmedo o seco, los cuales
tienen diferente penetrabilidad.

El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal

bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y
substancias, con el propsito de matar a las bacterias que ellos contengan.
Este proceso se llama Esterilizacin y al material, cultivo o medio de cultivo
sometido a ste, se le denomina entonces Estril, es decir, desprovisto de
toda forma viviente.

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BACTERIOLOGA

Cuando se efecta experimentalmente la esterilizacin de una poblacin

microbiana, contenida en un medio de cultivo o en todo el material utilizado en
bacteriologa es de suma importancia conocer los diversos mtodos de
esterilizacin los cuales se dividen en:

1. Mtodos fsicos tales como: calor, rayos ultravioleta, filtracin, etc.

2. Mtodos qumicos, en donde se utilizan substancias bactericidas o
bacteriostticos como son alcoholes, fenoles, halgenos, detergentes,
entre otros.

La eleccin del mtodo de esterilizacin depende del tipo de material a

esterilizar, as como la finalidad que se persiga. La esterilizacin por calor es
uno de los mtodos ms comnmente utilizados en el laboratorio, es muy til
para la cristalera, los medios de cultivo y para la esterilizacin de los medios
despus de su utilizacin y este puede ser:

a) Calor Hmedo
Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilizacin se hace por el
vapor a presin en una autoclave (Chamberland) u olla de presin.

b) Calor Seco
La esterilizacin se hace por medio de un horno que permite alcanzar
temperaturas ms elevadas (150- 180C) que no pueden soportar los medios
de cultivo y el material de goma o plstico, se utiliza ms para la esterilizacin
del material de vidrio (matraces, pipetas, placa petri, etc.) y en los instrumentos.

c) Calor Directo
Se utiliza en asas bacteriolgicas y agujas de inoculacin. La esterilizacin se
efecta directamente en la flama del mechero.

Mtodos, fuentes y tipos de agentes usados en bacteriologa

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BACTERIOLOGA

METODOLOGA

A) TCNICA DE ESTERILIZACIN DE CALOR HMEDO:

AUTOCLAVE
1. Lavar el material de vidrio (matraces) hasta dejarlos perfectamente
limpios y libres de sales, para lo cual se lavan y despus se les da un
enjuague final con agua destilada.
2. Colocar el o los medios de cultivo ya preparados (de acuerdo a las
indicaciones del frasco) en los matraces o tubos de ensayo antes de su
esterilizacin.
3. Tapar el material de vidrio ya sea con sus tapa o fabricarlas con algodn
o gasa.
4. Depositar el material en la cubeta de la autoclave, cuidando de colocar
un capuchn de papel aluminio en el cuello del material.
5. Llenar con agua destilada en la autoclave hasta donde indica la marca
del nivel.
6. Cerrar la tapa cuidando de apretar los pernos.
7. Encender.
8. Cuando el agua contenida dentro de la autoclave hierve, el vapor elimina
el aire de la autoclave, el escape del vapor por la espitia (que estar
abierta) es irregular.
9. Un chorro continuo indica la eliminacin completa del aire, con lo que se
procede a cerrar la espitia, la temperatura y la presin suben enseguida.
10. Cuando se ha obtenido la temperatura deseada de 121C que
corresponde a 15 libras de presin (una atmosfera), conservar la
temperatura y la presin deseada por un tiempo por 15 minutos.
11. Trascurridos los 15 minutos se apagada, el manmetro indicar un
descenso en la presin.
12. Cuando la presin es nula, se abre la espitia de escape de vapor.
Solamente entonces puede abrirse la tapa y retirar los objetos
hmedos ya esterilizados.

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BACTERIOLOGA

B) TCNICA DE ESTERILIZACIN CON CALOR SECO

HORNO ESTERILIZADOR
1. El material de vidrio debe encontrarse limpio y libre de sales.
2. Se procede a tapar el material ya sea con sus tapas o fabricarlas con
algodn o gasa.
3. Envolver en papel y llevarlo al horno (evitando el contacto con las
paredes del horno), las extremidades de los objetos que llevan algodn
o papel deben colocarse hacia arriba.
4. Para tubos de vidrio, pipetas (por separado) y cristalera en general,
utilizar 180C por espacio de 1 hora.
5. Transcurrido el tiempo de esterilizacin se apaga el horno y se deja
enfriar para sacar el material.

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BACTERIOLOGA

C) TCNICA DE ESTERILIZACIN CON CALOR DIRECTO

MECHERO
Se utiliza para asas bacteriolgicas y agujas de inoculacin.
1. Estas se deben esterilizar antes y despus de llevar acabo la siembra de
cualquier tipo de bacteria.
2. Poner el asa o aguja directamente en la parte azul de la flama durante
algunos segundos.
3. Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfra en las
paredes inferiores del recipiente de cultivo.

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BACTERIOLOGA

PRACTICA N2

TINCIONES BACTERIOLGICAS
El presente trabajo practico tiene por objetivo brindar al alumno herramientas
bsicas en la confeccin y el manejo de extendidos y la tincin de los mismos
de acuerdo a la observacin que se desee realizar.

FUNDAMENTO TERICO
Tincin:
Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una
superficie.

El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los

microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico. Dado
que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el
cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algn
tratamiento previo.

De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:

a) Tincin simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa
celular. Ejemplo: Azul de metileno.

b) Tincin diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias

entre clulas bacterianas o entre partes de una misma clula. Estas tcnicas
utilizan ms de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la
tincin. Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen, etc.

Colorantes
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son
catinicos (bsicos) y se combinan fuertemente con componentes celulares
cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacaridos cidos
(las envueltas externas de los microorganismos estn por lo general cargadas
negativamente).

Preparacin del extendido previa a la coloracin

Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el
centro del mismo una gota del cultivo lquido, mediante asa
bacteriolgica.
Si el cultivo es slido, se coloca primero una gota de solucin fisiolgica
o agua destilada estril sobre el portaobjeto. Luego, con el asa se toma
una colonia del medio slido y se emulsiona con la solucin fisiolgica.
Se extiende con el asa en forma de capa delgada y uniforme.
Se procede a la fijacin del extendido. Para ello se pasa lentamente el
portaobjeto, en forma horizontal, sobre la llama del mechero
manteniendo el extendido hacia arriba.
La operacin se repite hasta sequedad total, cuidando evitar la
combustin del extendido.

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BACTERIOLOGA

Tincin de Gram:
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Hans Christian Gram,
quien la desarroll en 1884. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram,
las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas
(en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga
elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de
bacterias).

Descrita en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente:

1. El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal,
2. Se lava con agua,
3. Se cubre con Lugol (solucin Yodada) durante 1 - 2 min.
4. Se lava de nuevo con agua
5. Decolorar con mezcla alcohol/acetona.
6. Enjuagar y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min.
7. Lavar y secar.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a

las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared
de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como
para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que
confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es
gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como
algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-
positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est
rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos,
lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula
gram-negativa es peptidoglicano.

Descripcin de la tincin de GRAM:

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de Lugol (yodo-yoduro
potsico). El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el
I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con
el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las
gramnegativas se encuentran en la misma situacin.

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-

acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos
organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas,
la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de

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BACTERIOLOGA

peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la

clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes
celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son
permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las
clulas grampositivas son todava violetas, pero las gramnegativas son
incoloras.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de

contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas
gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen violeta.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo.
El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo
preciso del tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas.
Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de
retener el complejo cristal violeta - yodo.

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BACTERIOLOGA

Tincin diferencial: Mtodo cido resistente (ZIEHL-NEELSEN)

Las paredes celulares de ciertas bacterias y parsitos contienen cidos grasos
(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de
la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol
resistente.

1. El frotis se tie durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor
suave (3 vapores).
2. Lavar con agua.
3. Decolorar con alcohol-HCL al 3%.
4. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de
contraste).
5. Lavar y secar.

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BACTERIOLOGA

Fundamentos de la microscopia

El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto

pequeo. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede
hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden aumentar de
100 a cientos de miles de veces el tamao original.

Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico. En el

microscopio ptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de
lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El
microscopio electrnico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo
magntico.

Los microscopios pticos generalmente producen un aumento de 1000 veces el

tamao original. El lmite lo tienen en unas 2000 veces.

Las lentes de un microscopio ptico

son el colector, el objetivo y el
ocular. La luz que entra en el
sistema debe enfocarse sobre la
preparacin y para esto se utiliza el
condensador. Elevando o bajando
el condensador puede alterarse el
plano del foco de luz y elegirse una
posicin que consiga el foco
preciso. El objetivo es la lente
situada cerca del objeto que se
observa. El aumento primario del
objeto es producido por la lente
objetivo y la imagen se transmite al
ocular, donde se realiza el aumento
final.

Los microscopios que se usan

normalmente en microbiologa
estn equipados con tres objetivos:
bajo poder, alto poder y objetivo de
inmersin. Estos objetivos estn montados sobre una pieza que se llama
revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el
condensador.

La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El

aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su
objetivo y de su ocular. En general, los aumentos del objetivo son 10x, 40x y
100x (objetivo de inmersin) y los del ocular 5x, 10x y 15x. Por lo tanto, si se
trabaja con un ocular de 10x y un objetivo de 100x, el aumento total ser 10 x
100 = 1000 veces el tamao original. El microscopio compuesto es capaz de
conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido
con una sola lente. Este ltimo, llamado microscopio simple, se usa
principalmente como lupas y cristales de aumento.

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BACTERIOLOGA

Adems del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder

resolutivo; esto es, la distancia mnima a la que se pueden ver dos objetos
separados. Viene definido por una frmula en la que las principales variables
son la longitud de onda de la luz y la apertura numrica del objetivo, pero en la
prctica, y asumiendo la mxima calidad de las lentes, es aproximadamente la
mitad de la longitud de onda de la luz con la que se observa. En microscopa
de campo claro es 0,2 micras, el microscopio ptico de efecto tnel cuntico
permite superar esta barrera y aumentar la resolucin por debajo de 0,1 micras.

Apertura numrica. Es la capacidad de recoger luz de una lente. Para lentes

secas su valor mximo es de 1, pero por las limitaciones fsicas de la calidad
de las lentes, raras veces sobrepasan el valor de 0,95. Cuanto mayor sea la
apertura podremos conseguir mayor resolucin y brillo en la imagen. Si
queremos usar lentes con una apertura mayor de 1 (mximo 1,6) estas deben
ser de inmersin en aceite con el mismo ndice de refraccin que la lente.

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BACTERIOLOGA

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BACTERIOLOGA

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BACTERIOLOGA

PRCTICA No. 3

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y

otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de
las bacterias. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que
permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad
metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios
de cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado
para todos ellos.

Como ya se ha sealado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin

adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del
desarrollo en el hbitat natural.

La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona

directamente con el pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar
a los microorganismos.

En funcin de la consistencia se puede clasificar a los medio el lquidos y

slidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma
lquida, en cuyo caso se los denomina caldos, o en forma slida si se le agrega
agar al caldo.

En cuanto a la esterilizacin, este procedimiento garantiza la destruccin de

todos los microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante
la preparacin del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables
al calor se los lleva al autoclave (121 C, 15 minutos). Si se requiere sangre u
otros componentes inestables, como antibiticos y compuestos fcilmente
oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros procedimientos y se
lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 50 C.

En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como
inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

Constituyentes habituales de los medios de cultivo

Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en
la preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e
incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin.

Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.

Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los
medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido,
al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas
marinas. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se
desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %.

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BACTERIOLOGA

Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o

vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua
y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo.
Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la
confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura,
de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee
sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de
levaduras provee vitaminas del grupo B, nitgeno y carbono.

Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados

y sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen
por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja,
carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y
aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y
sales. Proveen proteosas, peptonas, polipptidos y aminocidos.

Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o

suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados
para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y
debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un
animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores
de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del
crecimiento de algunas bacterias.

Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al

medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del
crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos
(el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales
como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas,
previenen una desviacin del pH.

Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los

medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.

Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores

que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan
el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios.

Agentes selectivos. La adicin de determindas sustancias al medio de

cultivo puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los
medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica,
telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan
como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

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BACTERIOLOGA

Los medios de cultivo se clasifican de acuerdo a su estado fsico, composicin

y su propsito.

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BACTERIOLOGA

PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Dilucin del medio de cultivo deshidratado. Se emplea agua destilada o

desmineralizada y con pH cercano al neutro. Inicialmente se aada la mi tad de
agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensin homognea;
despus se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de
cultivo es sensible al calentamiento, pero debe calentarse ms del necesario.

Esterilizacin. La es esterilizacin, si as lo indica el fabricante, se lleva a cabo

en autoclave a 121C/15 libras de presin/15 minutos.

Vertido de placa. Verter el medio en las placas petri a una temperatura entre
45C 50C, evitando la formacin de humedad en la tapa de la placa. Las
burbujas de aire de la superficie de la palca se eliminan abanicando
brevemente con la llama de un mechero de bunsen. Recordar que este proceso
se hace en un ambiente estril frente al mechero o cabina de flujo laminar.

Tubos de agar inclinado (pico de flauta) y sin inclinacin. Los tubos se pueden
repartir antes del autoclavado y al retirarlo se colocan en posicin inclinada que
forme un fondo de 3 cm aprox. y una superficie inclinada de igual dimensin.
En los casos que se requiera el medio sin inclinar, dejarlo solidificar en posicin
vertical sobre una gradilla.

22
BACTERIOLOGA

Medios de cultivo ms utilizados

Columbia, Base de Agar

Se emplea para el cultivo y aislamiento de microorganismos en general y en
particular de aquellos que son especialmente exigentes a partir de una amplia
variedad de muestras. Permite la adicin de sangre, de componentes
selectivos o factores de crecimiento.

Fundamento
Las peptonas aportan la base nutritiva del medio, el almidn se constituye
como fuente de energa, el Sodio Cloruro mantiene el nivel salino necesario
para el buen desarrollo de los grmenes y la sangre desfibrinada, que se suele
aadir, permite la observacin de las reacciones hemolticas. A partir de esta
base se prepara el agar sangre y el agar chocolate; adems de otras muchas
variantes.

Frmula (por litro)

Composicin (g/l):
Almidn de Maz................................... 1,0 Digerido Pancretico de Corazn......... 3,0
Extracto de Levadura............................ 5,0 Sodio Cloruro........................................ 5,0
Digerido Pancretico de Casena..........10,0 Agar......................................................13,5
Digerido Pptico de Carne.....................5,0
pH: 7,30,2

Preparacin
Suspender 42,5 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y
hervir durante 1 minuto. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Se
enriquece con diversos materiales, segn la determinacin que se vaya a
realizar:

Agar Sangre:
A 950 ml de Base de Agar Columbia aadir 50 ml de sangre de carnero
desfibrinada y estril, a una temperatura de 45C a 50C.

Agar Chocolate:
A 950 ml de Base de Agar Columbia aadir 50 ml de sangre de carnero
desfibrinada y estril, a una temperatura no mayor de 80C.

Agar MacConkey
Medio de cultivo utilizado en la investigacin de organismos coliformes.

Fundamento
Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento
de las bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias
capaces de fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y
formando colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio
correspondiente al precipitado biliar. Las bacterias lactosa-negativas dan
colonias incoloras.

23
BACTERIOLOGA

Frmula (por litro)

Composicin (g/l):
Lactosa....................................... 10,0 g
Sales Biliares............................... 1,5 g
Rojo Neutro................................. 0,03 g
Violeta Cristal.............................. 0,001g
pH final: 7,10,2
Peptona (carne y casena)..................3,0 g
Peptona de Gelatina..........................17,0 g
Sodio Cloruro......................................5,0 g
Agar...............................................13,5 g

Preparacin
Suspender 50 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y
hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar
hasta 45 C y distribuir en placas de Petri estriles con 25 a 30 ml en cada una.

Agar Manitol salado

Se emplea para el aislamiento selectivo y recuento de Staphylococcus
patgenos en productos lcteos, crnicos, marinos y otros productos
alimenticios.

Fundamento
El efecto inhibidor se debe a la alta concentracin de Sodio Cloruro del medio.
Con la fermentacin de la D(-)-Manita se genera cido que ocasiona el viraje
del rojo de fenol al amarillo, permitiendo as una mayor claridad en el momento
de establecer el diagnstico, ya que la mayora de los Staphylococcus
patgenos fermentan este azcar.

Frmula (por litro)

Composicin (g/l):
Sodio Cloruro.......................................... 75,0 Manita..........................................10,0
Extracto de Carne......................................1,0 Digerido Pancretico de Casena.....5,0
Digerido Pptico de Tejido Animal..............5,0 Rojo de Fenol................................0,025
Agar..........................................................5,0
pH: 7,40,2

Preparacin
Suspender 111 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y
hervir durante 1 minuto. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos.

24
BACTERIOLOGA

PRACTICA N4

TECNICAS DE SIEMBRA PARA BACTERIAS

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones

mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se
llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los
microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas,
cultivadas en el laboratorio en cultivos puros (o axnicos). En ocasiones el
estudio molecular conduce a la caracterizacin de los microorganismos, an en
poblaciones mixtas.

Sin embargo la identificacin bacteriana y la caracterizacin completa solo son

posibles tras el aislamiento de la bacteria y la obtencin de cultivos puros. Por
ello el primer problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de
los microorganismos presentes (en una muestra patolgica, de agua, de suelo,
de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible
obtener la bacteria de inters en cultivo puro.

Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriolgico en el medio de cultivo

para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicacin. El
resultado de una siembra se llama: Cultivo

Las siembras pueden ser:

Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez
Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria

Mtodos Generales:
Siembra por estra por agotamiento: Con ste procedimiento se puede
conseguir una buena separacin de las colonias y aislarlas fcilmente. Para
ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar.
Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogneo
y se descarga sobre la superficie del medio formando estras. Esto puede
realizarse de varias formas:

1. Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando

se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres
placas de Petri, para lo cual se repite la operacin sin tomar con el asa
nuevo material.

2. Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado

el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se
hace una estra luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar
nuevamente el asa; en el ltimo cuadrante aparecern las colonias aisladas

3. El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al

borde, se esteriliza el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as
sucesivamente.

25
BACTERIOLOGA

Pasos para la siembra de bacterias por tcnica de agotamiento

Tcnicas de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estras

realizadas a continuacin de la otra sin cargar el asa nuevamente

Siembra por tcnica masiva, utilizando hisopos estriles

26
BACTERIOLOGA

Siembra por dilucin: Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el
caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del
asa cargada con el material bacteriolgico, se agita, con movimientos
moderados.

Siembra por estras en superficie: Se siembra el material en la superficie de

el agar inclinado en un tubo de ensayo, all se extiende por toda la superficie
con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada con el material a
sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se
inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra
en la parte ms cerca de la boca del tubo.

Por puncin: Con un asa en punta se toma el material que se quiere sembrar
y se lo introduce en el tubo, con medio semislido. Introducir el asa hasta el
fondo, formando un canal de puncin, trayecto por el cual la retiraremos luego.
Este mtodo se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias.

Se puede utilizar la puntura y estra combinados en los medios que tenga fondo
y superficie inclinada (pico de flauta)

A) Siembra por estra simple; B) Siembra mixta (puntura y estra);

C y D) siembra por puntura; E) siembra en medio lquido.

27
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 5

MORFOLOGIA BACTERIA Y CARACTERISTICAS DE

CRECIMIENTO EN LOS CULTIVOS

Las bacterias en condiciones normales se desarrollan con formas definidas, las

cuales son proporcionadas por la rigidez de la pared celular; estas son formas
esfricas, ovaladas, en forma de bastn o como espirales. De acuerdo a esto,
es importante realizar una correcta observacin de las caractersticas, dado
que, dicha forma se convierte en uno de los principales marcadores para la
identificacin de gneros bacterianos. Del mismo modo, los rasgos de las
colonias y la disposicin o agrupacin bacteriana, son criterios taxonmicos
que deben ser descritos correctamente para la identificacin.

De acuerdo a su agrupacin, forma y tamao, se pueden clasificar en:

Caractersticas de la colonia
Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin
de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque
vara de tamao generalmente es visible a simple vista.

Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de

microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que
tienen tendencia a permanecer unidas como los Staphylococcus o los
Streptococcus.

Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se

28
BACTERIOLOGA

encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la

especie bacteriana que la forme.

Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y

combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes,
sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados.

La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una

clula individual pero es la caracterstica de la masa celular. As pues, por
ejemplo, la pigmentacin es aparente en la colonia, pero no en la clula
individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se
deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cpsula muy grande.

Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las

especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios
milmetros.

Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En la figura se pueden

observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.

Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una

colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia
viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata
de separarla del agar.

Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas en

las que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los
microorganismos patgenos uno de los pigmentados ms importantes es
Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se
aprecia en las clulas individuales a que se debe a grnulos intracelulares muy
pequeos para verse con luz transmitida.

29
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 6

ESTUDIO DEL METABOLISMO BACTERIANO

La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin

de las caractersticas de las colonias y morfologa con la tincin de gram u
otras coloraciones. Sin embargo, la caracterizacin final de un aislamiento
bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel gnero y especie,
habitualmente se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que son
nicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificacin.

En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una

pequea cantidad de la colonia bacteriana aislada en una serie de medios de
cultivo que contienen substratos especficos e indicadores qumicos que
permiten detectar cambios de pH o la presencia de subproductos especficos.

Accin sobre los hidratos de carbono

Por definicin la fermentacin es un proceso metablico de oxidacin-reduccin
que ocurre en un medio ambiente anaerbico, y en lugar de oxigeno, un
substrato orgnico sirve como aceptor final de electrones. El termino
fermentacin es utilizado comnmente utilizado para referirse a la utilidad de
HC por las bacterias. Estas pueden utilizar desde polisacridos como el
almidn, la celulosa, hasta monosacridos como la glucosa los cuales servirn
como fuente de energa y carbono.

Principios bioqumicos de las reacciones en TSI (triple sugar iron)

Este medio fue diseado para la diferenciacin de bacilos gram negativos,
basndose en la capacidad de las bacterias de fermentar carbohidratos
(glucosa-sacarosa-latosa/1:10:10), produccin de sulfuro de hidrogeno (H2S) y
gas.

Utilizacin de lisina (LIA)

Este medio permite determinar la presencia de las enzimas lisina
descarboxilasa (LDC) y lisina desaminasa (LDA)

Pruebas de oxidacin-fermentacin (OF segn Hugh y Lefson)

El termino de no fermentacin se refiere a un grupo de bacterias gram
negativas aerbicas, no esporuladas, que son incapaces de fermentar hidratos
de carbono y los degradan por la va oxidativa. Estos cidos formados por la
degradacin son ms dbiles y para su deteccin requiere de medios ms
sensibles.

Produccin de indol
Las bacterias capaces de actuar sobre el triptfano, produciendo indol, acido
pirvico y amoniaco (NH3). El indol puede detectarse en un medio rico en
triptfano, observando la aparicin de un color rojo (en forma de anillo o
impregnado en papel), luego de agregar una solucin que contenga
dimetilaminobenzaldehido.

30
BACTERIOLOGA

Utilizacin de citrato
Esta se utiliza principalmente para identificar especies de enterobacterias, las
cuales pueden obtener energa por una va distinta a la de la fermentacin de
carbohidratos, utilizando citrato de sodio como nica fuente de carbono para su
metabolismos y desarrollo.

Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de bacterias aerobicas y
anaerobio facultativas. El perxido de hidrogeno (H2O2) es uno de los
productos finales del metabolismo oxidativo de los HC y si se acumula es letal
para la bacteria. La catalasa convierte el H2O2 en agua y oxigeno.

2 H2O2 2 H2O + O2

Citocromo oxidasa
Los citocromos son hemoproteinas que contiene hierro y actan como ultimo
eslabn en la cadena respiratoria, trasfiriendo electrones (H-) al oxigeno, con
formacin de agua.

Pruebas bioqumicas a sembrar, medios utilizados, reactivos necesarios y tcnica de siembra

31
BACTERIOLOGA

Resumen del fundamento y revelado de las principales pruebas bioqumicas

32
BACTERIOLOGA

33
BACTERIOLOGA

PROTOCOLO

MEDIO DE REACTIVO Y/O

PRUEBAS LECTURA
CULTIVO INDICADOR

34
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 7

IDENTIFICACIN DEL GENERO Staphycoccus

Los Staphycoccus constituyen un grupo de microorganismos esfricos (cocos),

gram positivos, agrupados tpicamente en forma de racimo, pero se les
encuentra tambin en forma de ttradas o aisladas, son inmviles y no
esporuladas.

Pertenecen a la familia Micrococcacceae. La especie patgena del genero es

Staphycoccus aureus. Este puede formar parte de la flora normal de fosas
nasales y perineo del ser humano; es causante de diversas enfermedades. La
produccin de una serie de enzimas y toxinas ayudan a su patogenia, una de
ellas es la enzima coagulasa, que nos ayuda a identificar la especie S. aureus
en el laboratorio.

Algunas especies de Staphycoccus coagulasa negativos tales como S.

saprophyticus y S. epidermidis, pueden ser considerados patgenos en
cuadros de bacteriemia e infecciones urinarias.

Procedimiento
Morfologa microscpica y colonial:
1. Inocular las tres cepas por dispersin y agotamiento en una placa de agar
sangre.
2. Incubar a 35C por 24 horas.
3. Realizar la lectura.

Crecimiento en agar Manitol Salado:

1. Inocular las tres cepas por dispersin y agotamiento en una placa de agar
Manitol Salado.
2. Incubar a 35C por 24 horas.
3. Realizar la lectura.

Prueba de coagulasa:
1. Inocular las tres cepas en tubos con plasma.
2. Incubar a 35C por 24 horas.
3. Realizar la lectura.

Prueba de catalasa:
1. Con ayuda del asa de siembra colocar una pequea parte de la colonia
sobre una lmina portaobjeto
2. Aadir una gota de reactivo de catalasa (H2O2)
3. Observar el resultado

Prueba de sensibilidad a la Novobiocina:

Dividir una placa de mueller hinton en tres e inocular las tres cepas con ayuda
de un hisopo a partir de una suspensin bacteriana.
Colocar un disco de Novobiocina de 5ug
Incubar a 35C por 24 horas.
Realizar la lectura.

35
BACTERIOLOGA

PROTOCOLO
AISLAMIENTO

MEDIO DE
COLONIAS
CULTIVO

Agar
Tamao Forma Pigmento Hemolisis Gram
Sangre

TIPIFICACIN

Cepa Manitol Coagulasa Catalasa novobiocina

36
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 8

IDENTIFICACIN DEL GENERO Streptococcus Enterococcus

El gnero Streptococcus incluye un gram numero de cocos gram positivos que

forman cadenas largas. Algunos causan enfermedades en humanos, otros
viven como comensales y adems se encuentran libres en el medio ambiente.

Estos microorganismos no respiran, obtienen su energa por la fermentacin de

azucares. Sin embargo, muchos Streptococcus pueden desarrollar en
presencia de oxigeno as como en su ausencia.

Los Enterococcus pertenecen a la flora microbiana intestinal normal del hombre

y los animales, siendo Enterococcus faecalis la especie predominante, seguida
de E faecium. Estas especies, hasta la dcada del 80, se encontraban
incluidas dentro del gnero Streptococcus del Grupo D de la clasificacin de
Lancefield. Por sus caractersticas antignicas. En 1984 Schleifer y Kilpper
Blz, las incorporaron al gnero Enterococcus por sus caractersticas
genticas. Este gnero cuenta en la actualidad con 12 especies.

Procedimiento:

1. Sembrar en agar sangre las 4 cepas.

2. Sembrar en agar sangre S. pyogenes y colocar disco de bacitracina 0.04U.
3. Sembrar en agar sangre S. pneumoniae y colocar disco de optochin 5ug.
4. Sembrar cada una de las cepas en caldo con ClNa 6,5%.
5. Sembrar cada una de las cepas en agar Bilis-esculina.
6. Incubar las palcas y los tubos a 37C por 24 horas.
7. Colocar una asada de cada colonia en una lamina y colorear con gram.

37
BACTERIOLOGA

PROTOCOLO

CEPAS
OBSERVACIONES

Coloracin de
gram
Hemolisis en agar
sangre
Sensibilidad a
bacitracina
Sensibilidad a
optochina
Desarrollo en
ClNa 6,5%
Solubilidad en
desoxicolato de
sodio

38
BACTERIOLOGA

Practica N 9

IDENTIFICACIN DEL GENERO Neisseria M oraxella

Las Neisseria son diplococos, que se asemejan a granos de caf al ser

observados con el microscopio. El gnero incluye las especies Neisseria
gonorrhoeae (llamada tambin gonococcus), causante de la gonorrea, y
Neisseria meningitidis (llamada tambin meningococcus), una de las ms
comunes causas de meningitis bacteriana y agente causal de sepsis
meningocccica.

Los miembros del gnero Neisseria son bacterias en forma de diplococos

(crecen en pares), Gramnegativos, no esporulados y solo N. meningitidis
presenta cpsula (de polisacaridos), inmviles, oxidasa positivos y la mayora
son tambin catalasa positivos. El tamao promedio de la bacteria es de 1 de
dimetro y son aerobios estrictos.

Moraxella son bacterias Gram negativas con forma de bacilo corto, cocobacilo
o, como en el caso de Moraxella catarrhalis, cocos asociados en parejas
(diplococos), o incluso en pequeas cadenas. La mayora de estos
microorganismos son inmviles, no esporulados, con caractersticas oxidasa-
positiva y catalasa-positiva. Unos son hemolticos y algunas especies son
capsuladas, aerobios aunque algunos puede ser anaerobios facultativos y no
son muy hbiles para fermentar los carbohidratos.

Moraxella catarrhalis usualmente reside en las vas respiratorias, pero puede

acceder al aparato respiratorio en pacientes con trastornos pulmonares
crnicos o inmunodeficientes, ocasionando traqueobronquitis neumona.

PROTOCOLO
Identificacin bioqumica de especies de Neisseria - Moraxella

Carbohidratos Oxidasa Catalasa

Especies
Glucosa Maltosa Sacarosa Lactosa

N. gonorrhoeae

N. meningitidis

Moraxella sp.

39
BACTERIOLOGA

40
BACTERIOLOGA

Practica N 10

IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM POSITIVOS

Gnero Bacillus:
Este es un gnero de bacterias en forma de bacilos Gram positivos. Son
aerobios estrictos o anaerobios facultativos. En condiciones estresantes forman
una endospora de situacin central, que no deforma la estructura de la clula a
diferencia de las endoesporas clostridiales. Dicha forma esporulada es
resistente a las altas temperaturas y a los desinfectantes qumicos corrientes.

La mayora de especies son positivas a la prueba de la catalasa y son

saprfitas. Viven en el suelo, agua del mar y ros, aparte de alimentos que
contaminan con su presencia. Aunque generalmente son mviles, con flagelos
peritricos, algunas especies de inters clnico (B. anthracis, causante del
carbunco) son inmviles. Hay especies productoras de antibiticos

Gnero Listeria:
Estos son bacilos gram positivos cortos, mviles al poseer flagelos peritricos,
pueden aparecer en grupos semejando letras L o Y. No forman endosporas,
no presentan capsula. El patgeno ms importante es la L. monocytogenes,
produce la listeriosis, ocasionando fiebre y monocitosis en sangre perifrica, de
ah su nombre.

Gnero Lactobacillus:
Lactobacillus o bacteria del cido lctico es un gnero de bacilos Gram
positivas rectos y largos, anaerobios aerotolerantes, denominadas as debido a
que la mayora de sus miembros convierte la lactosa y otros monosacridos en
cido lctico. Normalmente son benignas e incluso necesarias, habitan en el
cuerpo humano y en el de otros animales, por ejemplo, estn presentes en el
tracto gastrointestinal y en la vagina.

Gnero Corynebacterium:
Estos son bacilos Gram-positivas, catalasa positivas, no esporuladas, que
carecen de motilidad, bacilos rectos o ligeramente curvados, a menudo con la
tpica forma de V (lo que tambin se denomina forma de letras chinas),
aunque tambin aparecen formas elipsoidales, son aerobias o anaerobias
facultativas, la mayora no causa enfermedades, sino que son parte de la flora
saprfita de la piel humana.

Se considera a C. diphteriae, agente causal de la difteria o angina

pseudomembranosa en el hombre, lesin caractersticaa cuyo nivel produce
una toxina.

41
BACTERIOLOGA

PROTOCOLO

Bacteria Hemolisis Movilidad Morfologa Gelatina Catalasa

Bacillus

Listeria

Lactobacillus

Corynebacterium

42
BACTERIOLOGA

Practica N 11

IDENTIFICACIN DE Enterobacteriaceae

Las enterobactericeas (Enterobacteriaceae) son una familia de bacterias

Gram negativas que contiene ms de 30 gneros y ms de 100 especies que
pueden tener morfologa de bacilos o cocos. Los miembros de esta familia
forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros
rganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies
pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuticos

En las Enterobacteriaceae se usan siete criterios bsicos para incluir a ciertos

gneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman
parte de esta familia:

Son bacterias gram negativas, la mayora bacilos, otros cocobacilos y otros

pleomrficos.
No son exigentes, son de fcil cultivo.
Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es
decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.
Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
Son anaerbicos facultativos.
Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaerbicas con o sin
la produccin de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una
amplia gama de substratos en condiciones aerbicas.

Muchos gneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos
gneros no son mviles, no forman esporas, algunas producen toxinas y
pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son
quimiohetertrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de
carbono y nitrgeno, generalmente slo con glucosa, aunque algunas requieren
aminocidos y vitaminas. La temperatura ptima de crecimiento es de entre 22
C y 37 C.

Procedimiento
Hacer frotis de las diferentes cepas, luego colorear con gram y observar al
microscopio.
Realizar la prueba de citocromo-oxidasa.

Siembra en medios selectivos:

Sembrar las cepas en agar Mc Conkey por estra-agotamiento. Observar las
caractersticas de la colonia. La presencia de cristal violeta y sales biliares
inhibe las bacterias gram positivas y algunas bacterias gram negativas
exigentes. Las colonias que desarrollan y degradan lactosa acidifican el
medio virando las colonias al color rojo-rosado (lactosa positivo), por el
indicador de pH rojo neutro, mientras que las colonias que no viran y son
incoloras (lactosa negativo).

Sembrar las cepas en agar SS por estra-agotamiento. Observar las

caractersticas de la colonia. El alto contenido de sales biliares y de citrato

43
BACTERIOLOGA

de sodio inhibe los gram positivos, el vede brillante y el tiosulfato de sodio a

algunos coliformes. Contiene lactosa y rojo neutro como indicador de pH,
pudiendo observar colonias lactosa positivas (rojo-rosadas) o negativas
(incoloras). Adems de un precipitado negro en aquellas colonias de
bacterias que produzcan hidrogeno sulfurado (H2S).

Sembrar las cepas en agar XLD por estra-agotamiento. Observar las

caractersticas de la colonia. La degradacin de los azucares xilosa, lactosa
y sacarosa hasta el acido se manifiesta por el viraje del indicador de pH rojo
de fenol, observando las colonias de color amarillo, el tiosulfato y el citrato
nos indican la presencia del hidrogeno sulfurado (H2S -precipitado negro).
Cuando las bacterias descarboxilan lisina presentan un color rojo debido al
pH alcalino.

Siembra en medios bioqumicos diferenciales:

Agar TSI: siembra por puntura y estra.
Agar LIA: siembra por puntura y estra.
Agar SIM: siembra por puntura.
Agar Citrato de Simons: siembra por estra.
Incubar a 37C por 24 horas.

Diferenciacin bioqumica de las Enterobacterias ms frecuentemente

aisladas de muestras clnicas

TSI LIA
Enterobacterias LAC IND MOV CIT
Gas H2S LDC LDA
S P

44
BACTERIOLOGA

TABLA DE IDENTIFICACION DE
Enterobacteriaceae
LAC GAS H2S LDC LDA IND MOV URE CIT ORN
Citrobacter diversus V + V+ - - - + V+ + V+
Citrobacter freundii -V + - - - + + V+ + +
Enterobacter aerogenes + + - + - - + - + +
Enterobacter cloacae + + - - - - + V+ + +
Escherichia coli + + - + - + + - - V+
Escherichia coli inactiva -V - - -V - V+ - - - -V
Klebsiella oxytoca + + - + - + - + + -
Klebsiella pneumoneae + + - + - - - + + -
Morganella morganii - + - - + + + + - +
Proteus mirabilis - + + - + - + + V+ +
Proteus vulgaris - V+ + - + + + + -V -
Providencia alcalifaciens - V+ - - + + + - + -
Providencia rettgerii - - - - + + + + + -
Salmonella cholerasuis - + V + - - + - -V +
Salmonella spp. - + + + - - + - + +
Salmonella typhi - - + + - - + - - -
Serratia marcescens - V+ - + - - + -V + +
Shigella sonnei - - - - - - - - - +
Shigella subgrupo A,B,C - - - - - V - - - -
Yersinia enterocolitica - - - - - V - V+ - +

Farmer JJ, Davis BR, Hickman-Brener FW, et al: Biochemical identification of new species and biogroups of
Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J Clin Microbiol 21: 46, 1985

OBSERVACIONES:
+ : positivo - V : variable <50% V : variable 50%
- : negativo + V : variable >50%

LAC : Lactosa IND : Indol

GAS : Gas de glucosa MOV : Movilidad
H2S : Hidrogeno sulfurado URE : Urea
LDC : Lisina descarboxilasa CIT : Citrobacter
LDA : Lisina desanimasa ORN : Ornitina descarboxilasa

45
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 12

ESTUDIO DE Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas

Gnero Vibrio:
Las especies de gnero Vibrio son invariablemente bacilos Gram negativos, de
entre 2 y 3 m de largo, de forma algo curva, dotados de un nico flagelo polar
que les permite una elevada movilidad. Soportan bien los medios alcalinos, as
como las concentraciones salinas. No forman esporas, son oxidasa positiva, y
anaerobios facultativos.

Varias de las especies de Vibrio son patgenas, provocando enfermedades del

tracto digestivo, en especial V. cholerae, el agente que provoca el clera, V.
parahaemolyticus causante de diarrea inflamatoria autolimitada y V. vulnificus,
que se transmite a travs de la ingesta de marisco.

Para su aislamiento del ser humano se utiliza el medio de cultivo TCBS

(tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) y al medio de enriquecimiento de agua
peptonada alcalina.

Gnero Aeromonas:
Aeromonas es un bacilo Gram-negativo, anaerobia facultativa que
morfolgicamente se asemeja a los miembros de la familia Enterobacteriaceae,
pero estos son oxidasa positivos. Se han descrito catorce especies de
Aeromonas, la mayora de las cuales han sido asociadas con enfermedades
humanas. Los patgenos ms importantes son A. hydrophila, A. caviae y A.
veronii biovar sobria. Estos organismos son ubcuos en el agua dulce y salobre.

Las especies de Aeromonas causan: 1) enfermedades sistmicas oportunistas

en pacientes inmunodeprimidos, 2) enfermedades diarreicas en individuos por
lo dems sanos y 3) Infecciones en heridas.

Gnero Plesiomonas:
Plesiomonas shigelloides es un bacilo Gram-negativo, perteneciente a las
enterobacterias, mvil y oxidasa positivo; que se ha aislado de agua dulce,
peces de agua dulce y mariscos y otros muchos tipos de animales, como
vacas, cabras, cerdos, gatos, perros, monos, buitres, serpientes y sapos.

Las infecciones de este organismo causan gastroenteritis, seguida de una

septicemia en pacientes inmunodeprimidos. Se asocian estas infecciones sobre
todo con ingesta de marisco en viajeros de reas tropicales y subtropicales.

46
BACTERIOLOGA

PROTOCOLO

Cepas
Pruebas diferenciales
Vibrio Aeromonas Plesiomonas

Desarrollo en McConkey

Hemolisis
Catalasa
Oxidasa
TSI
LIA
SIM
Citrato
Gram
TCBS
Esculina

47
 Enteropatogeno LAC LDC GAS IND VP ESC GEL SOR HSH HSC
Aeromonas sobria 30 98 84 98 76 12 96 2 81 49
Aeromonas hydrophila 23 94 80 97 99 96 99 38 98 25
BACTERIOLOGA

Aeromonas caviae 55 5 7 76 1 79 93 5 6 7
Vibrio cholerae 1 99 1 99 93 1 99 1 1 85
Vibrio parahaemolyticus 1 99 1 99 1 4 99 1 8 8
Plesiomonas shigelloides 1 99 14 86 1 1 1 33 1 1

Oxidasa y Movilidad +
Aeromonas y V. cholerae ONPG +
O129 10ug/ml R: Aeromonas, Plesiomonas
O129 150 ug/ml R: Aeromonas

48
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 13

ESTUDIO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO

FERMENTADORES

Los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) constituye un grupo

heterogneo de microorganismos que se consideran generalmente patgenos
oportunistas. Son bacterias no esporuladas, aerobias estrictas que, o bien no
utilizan los carbohidratos como fuente de energa, o los degradan a travs de
vas metablicas diferentes a la fermentacin (generalmente oxidacin).

Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y dado su ubicuidad,

pueden sobrevivir en el ambiente hospitalario en: agua destilada, soluciones
salinas, tubuladuras, superficies hmedas, humidificadores, incubadoras,
nebulizadores, catteres, soluciones desinfectantes y en superficies inertes,
constituyendo reservorios de potenciales infecciones.

Pseudomonas es un gnero de bacilos rectos o ligeramente curvados, Gram

negativos, oxidasa positivos, aerbicos estrictos aunque en algunos casos
pueden utilizar el nitrato como aceptor de electrones. Los miembros de este
gnero generalmente son mviles gracias a uno o ms flagelos polares que
poseen, son catalasa positivos y no forman esporas.

Otras caractersticas que tienden a ser asociadas con las especies de

Pseudomonas -con algunas excepciones- incluye la secrecin de pioverdina
(fluoresceina), un siderforo fluorescente de color amarillo verdoso bajo
condiciones limitadas de hierro. Algunas especies pueden producir otros
siderforos, tales como la piocianina por la Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter es un gnero de bacterias Gram-negativas, presentan

predominantemente una morfologa de tipo cocobacilo, son estrictamente
aerobios no fermentadores, no mviles (no tiene flagelos; su nombre en griego
significa 'sin motilidad'), oxidasa-negativos que se presentan en pares al
microscopio. Se distribuyen ampliamente en la naturaleza, son importantes en
el suelo y contribuyen a su mineralizacin.

Stenotrophomonas es un bacilo aerobio gram negativo, ampliamente difundida

en el medio ambiente. Mviles y oxidasa negativos, En principio se denomin
Pseudomonas maltophilia, posteriormente Xantomonas maltophilia y, por
ltimo, Stenotrophomonas maltophilia.

49
BACTERIOLOGA

PROTOCOLO

Pruebas
P. aeruginosa S. maltophilia Acinetobacter
diferenciales

Crec. Mc Conkey
TSI

Citrato de Simons

Oxidasa

Movilidad

Crecimiento a 42C

Pigmento
Desarrollo en OF
Gram
Gelatina

50
BACTERIOLOGA

TABLA DE IDENTIFICACIN DE ALGUNOS BACILOS GRAM

NEGATIVOS NO FERMENTADORES

A. baumannii/calcoaceticus

C. meningosepticum
Gram negative

S. putrefaciens
P. fluorescens
P. aeruginosa

S. maltophilia
aerobic non-

B. cepacia
A. faecalis

P. putida
A. lwoffii
fermenters
J Gen Micro 1986,
132, 1827-1842.
Holmes et al

Movilidad 1 1 84 1 88 36 59 74 79 64
Pigmento N N N A A,M,V A N N M A
Fluorescencia 1 1 1 1 69 1 72 31 1 1
Crecimiento
99 96 99 99 99 99 99 99 99 99
MacConkey
Oxidasa 1 1 95 99 99 93 99 99 99 32
OF oxidativo 99 1 1 92 98 99 99 99 12 31
Nitrato reduccion 4 8 1 4 99 24 24 13 93 59
Citrato de Simmon's 84 36 83 18 99 99 94 94 9 2
Ureasa 42 17 1 33 75 54 38 26 32 6
Gelatina 15 8 5 98 72 51 48 1 86 89
H2S TSI 1 1 1 1 1 1 1 1 97 1
ONPG 1 1 1 98 11 39 1 1 1 13
Lysina decarboxylasa 1 1 1 1 1 63 1 1 1 82
Ornithina
1 1 1 1 1 46 1 1 82 1
decarboxylasa
DNAasa 4 1 5 98 21 1 2 1 98 98
Glucose 99 47 1 86 99 99 99 99 28 53
Lactose 70 1 1 55 1 99 1 1 1 1
Esculina 1 1 1 96 20 30 1 1 1 81
Crecimiento 5C 11 40 7 2 1 7 78 40 34 6
Crecimiento 42C 77 42 81 12 99 36 1 4 46 29
Indol 1 1 1 49 1 1 1 1 1 1
Pigmento: A: amarillo, M:marron, V: verde, N: negativo

51
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 14

ESTUDIO DE BACTERIAS FASTIDIOSAS

Gnero Campylobacter:
Campylobacter es un gnero perteneciente a la familia Campylobacteraceae.
Las especies de este gnero son bacilos gram negativo con forma de coma y
mviles por la presencia de uno o dos flagelos polares. Miden entre 0,5 y 5
micras de largo por 0,2 a 0,5 micras de ancho, tomando forma cocoide en
cultivos antiguos o expuestos de forma prolongada al aire.

No son esporulados, reaccionan positivamente a la oxidasa y la catalasa y su

temperatura ptima de crecimiento oscila entre los 25 y 42 C. Las colonias de
este gnero no suelen presentar pigmentacin y poseen metabolismo
respiratorio microaerfilo (5 % O2, 10% CO2 y 85% N2). Tienen una morfologa
caracterstica al observarlas al microscopio, en forma de "S", de "coma", o
tambin llamada "en caballito de mar.

En la actualidad las especies de Campylobacter se han incrementado, las ms

importantes en el hombre estn asociadas a cuadros diarreicos y son: C. jejuni,
C. coli, C lari y C. upsaliensis

Gnero Haemophilus:
Haemophilus es un gnero de bacterias Gram negativas con forma de
cocobacilos pero muy pleomrficas. Aunque la forma tpica es la cocobacilar,
se consideran pleomrficas porque realmente pueden variar drsticamente su
morfologa. El gnero incluye organismos comensales con un cierto grado de
patogenicidad: H. influenzae ocasiona septicemia y meningitis a nios
pequeos; H. ducreyi es un agente productor de chancros.

Estos organismos se cultivan en placas de agar chocolate, medio rico que les
proporciona toda clase de factores de crecimiento requeridos para su
desarrollo: hemina (factor X) y/o factor V o dinucletido de nicotinamida y
adenina (NAD). La presencia de CO2, una temperatura de 37 C y un pH
alcalino favorecen el crecimiento de Haemophilus.

Gnero Brucella:
Brucella es un gnero de bacterias Gram negativas conocido principalmente
por ser productor de la enfermedad brucelosis, una zoonosis. Las especies de
Brucella son cocobacilos de 0,5 a 0,7 m de dimetro por 0.6-1.5 m de largo,
intracelulares facultativos, que carecen de cpsula, flagelos y tampoco generan
esporas.

Se conocen diez especies de Brucella, algunas de ellas con distintos biotipos,

cada una de las cuales se diferencia en la especificidad del husped: Se
describen seis especies clsicas, las cuales se han diferenciado con base en
sus caractersticas antignicas y su hospedador animal preferente: B.
melitensis (oveja, cabra, camello); B. abortus (ternera, bfalo, camello, yak); B.
suis (cerdo, liebre, reno, roedor, carib); B. canis (perro); B. neotomae
(roedores) y B. ovis (ovejas).

52
BACTERIOLOGA

PROTOCOLO

Campylobacter Haemophilus Brucella

Gram

Agar sangre

Agar chocolate

Catalasa

Oxidasa

53
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 15

ESTUDIO DE M ycobacterias

Las micobacterias son bacterias aerobias y no mviles. Tienen cido-alcohol

resistencia, no producen endosporas ni cpsulas y suelen considerarse
grampositivas. En algunos casos, estos bacilos pueden formar filamentos
ramificados; sin embargo, estos pueden romperse con facilidad.

Aunque las micobacterias no parecen encajar en la categora Gram-positiva

desde un punto de vista emprico (es decir, que no retienen el tinte violeta), se
clasifican como bacterias cido-resistentes Gram-positivas. Todas las especies
de Mycobacterium comparten una caracterstica pared celular, ms gruesa que
la de muchas otras bacterias, hidrofbica, cerosa, y rica en cidos
miclicos/micolatos. La pared celular es rica en lpidos, lo que hace que su
superficie sea hidrfoba y confiere a las micobacterias resistencia frente a
muchos desinfectantes y las tinciones de laboratorio. Esta pared celular
proporciona una contribucin sustancial a la resistencia de este gnero de
bacterias. Los componentes lipdicos abarcan el 60% del peso de la pared.

Debido a que la pared celular de las micobacterias es compleja y a que este

grupo de microorganismos es exigente desde el punto de vista nutricional, la
mayora crecen lentamente, se dividen cada 12 a 24 horas y se necesitan hasta
8 semanas antes de poder detectar el crecimiento en los cultivos de laboratorio.
Adems, algunas especies tienen tambin ciclos de reproduccin muy largos.
M. leprae puede tardar ms de 20 das para completar un ciclo de divisin (por
comparacin, algunas cepas de E. coli toman slo 20 minutos). La temperatura
ptima de crecimiento vara ampliamente segn la especie desde 25 C a ms
de 40 C.2

Procedimiento:
Frotis y coloracin:
Hacer un extendido de la muestra sobre una lmina, procurando que sea
homognea, ni muy delgada ni muy gruesa, y que ocupe los dos tercios de
la lmina, quedando un tercio para la identificacin de la muestra.
Esperar que seque la lamina y realizar la coloracin de Ziehl Neelsen.
Observar al microscopio con objetivo de inmersin (100X) la presencia de
bacilos teidos de color rojo sobre un fondo azul.

Cultivo:
Hay muestras que son naturalmente estriles, como el LCR, pero hay otras
como el esputo contaminadas con grmenes de desarrollo rpido. Estos
contaminantes hay que eliminarlos antes de cultivar mediante sustancias
qumicas como el fosfato trisodic al 23% o el hidroxido de sodio al 4%.
Aadir en partes iguales el hidrxido de sodio al 4% sobre la muestra, dejar
reposar durante 20 minutos.
Sembrar sobre el medio Ogawa o Lowenstein-Jensen con una pipeta
pasteur.
Incubar a 37C durante 60 das.
Observar cada semana la aparicin de colonias tpicas de Mycobacterium.

54
BACTERIOLOGA

INFORME DE BACILOSCOPIA - BK

INFORME DE CULTIVO DE MYCOBACTERIUM

55
BACTERIOLOGA

PRACTICA N 16

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

El antibiograma es una prueba de laboratorio que nos permite apreciar la
sensibilidad o resistencia de las bacterias aisladas de infecciones clnicas.

Tiene como objetivo determinar la mnima concentracin inhibitoria (MIC). Su

finalidad es orientar la accin teraputica. El MIC se relaciona con la
concentracin del antibitico alcanzado en el suero o en el foco de infeccin.

El antibiograma se puede realizar por tcnicas de dilucin del antibitico, en

medio liquido o en medio solido, y por el mtodo de difusin en agar(disco-
difusin). Los mtodos de dilucin son ms exactos y se realizan tambin por
mtodos automatizados; sin embargo por su alto costo y la necesidad de
emplear mucho material, el mtodo de disco-difusin estandarizado es el que
est a nuestro alcance en la rutina del trabajo del laboratorio de microbiologa,
dejando los mtodos de dilucin para ciertos trabajos de investigacin.

Preparacin del estndar (0,5 Mc. Farland) para el inculo

Para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de

bario (0,5 de la escala de Mac Farland) como estndar.

Preparacin del estndar de turbidez.

Agregar 0,5 ml de una solucin de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al 1,175%

P/V) a 99,5 mL de una solucin de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V) en
constante movimiento para mantener la suspensin.

Verificar la densidad correcta del estndar usando un fotocolormetro

espectrofotmetro, cuya absorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el
estndar 0,5 de Mc. Farland.

Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa de rosca o tapn de jebe,

similares a los que se usarn para preparar el inculo.

Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a

temperatura ambiente y anotar la fecha de preparacin.

Antes de ser usado agitar vigorosamente dicho estndar de preferencia, en

un agitador mecnico.

Verificar mensualmente la densidad de los estndares de sulfato de bario, y

reemplazarlo cuando sea necesario.

56
BACTERIOLOGA

Preparacin del inculo

Mtodo de desarrollo previo:

a. Seleccionar cuatro a cinco colonias bien aisladas, del mismo tipo

morfolgico, de un cultivo en placa.

b. Tocar la superficie de cada colonia con un asa de siembra y transferirlo a

un tubo que contiene de 4 a 5 mL de caldo apropiado (Ej. Caldo Tripticasa
soya).

c. Incubar el caldo a una temperatura entre 35C a 37C, hasta que alcance o
exceda la turbidez del estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland (por lo
general de 2 a 6 horas).

d. Ajustar la turbidez del inculo con solucin salina o caldo apropiado hasta
el tubo 0.5 de la escala de Mc. Farland, por comparacin visual con el
estndar. Para realizar este paso correctamente usar una luz apropiada y
mirar los tubos contra un fondo blanco con lneas negras como contraste.

e. La suspensin preparada contendr aproximadamente 1 a 2 x 10 8 UFC/mL

para E. coli ATCC 25922.

Mtodo directo de inoculacin a partir de colonias aisladas:

a. De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 - 24 h,

seleccionar colonias aisladas y preparar una suspensin directa en
solucin salina caldo.

b. La suspensin debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0,5 de Mc.

Farland.

Procedimiento:

Mtodo de dilucin:

Colocar 0,5mL de Caldo Mueller Hinton desde el tubo N 2 al N 12.

Colocar 0,5mL de solucin del antibitico de trabajo al tubo N1 y N2.

Mezclar el tubo N2 y transferir 0,5mL del tubo N2 al tubo N3.

Mezclar el tubo N3 y transferir 0,5mL de este tubo al tubo N4. Continuar

con el mismo procedimiento hasta el tubo N10.

Descartar 0,5mL de la dilucin del tubo N10.

Colocar 0,5mL del inculo desde el tubo N1 al N11.

Incubar a 37C por 24 horas

57
BACTERIOLOGA

Lectura e Interpretacin de los Resultados:

El punto final se define a simple vista, por la falta de turbidez del caldo, para
ello comparar cada tubo con el tubo de control de crecimiento.

Mtodo de Disco-difusin estandarizado (Kirby Bauer):

Inoculacin de las Placas

Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inculo,

sumergir un hisopo estril en la suspensin, rotar el hisopo varias veces
presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del
nivel del lquido para remover el exceso de inculo.

Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el

hisopo en tres direcciones para asegurar una distribucin uniforme del
inculo (Figura 1). Antes de colocar los discos dejar secar la placa a
temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de
humedad superficial sea absorbido.

58
BACTERIOLOGA

Aplicacin de los discos

Colocar los discos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar

con la ayuda de una pinza estril o la punta de una aguja presionando
suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la
superficie del agar.

Distribuir los discos uniformemente, de modo que estn a una distancia

mnima de 25 mm uno del otro (el dimetro de los discos segn las normas
de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) debe ser de 6 mm). No
deben colocarse ms de 12 discos en una placa de 150 mm, ni ms de 6
en una placa de 100 mm de dimetro interno, para evitar la superposicin
de las zonas de inhibicin. Un disco no debe ser removido una vez que
tom contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibiticos
se difunden rpidamente.

Lectura e interpretacin:

Con ayuda de una regla milimetrada, medir el dimetro de los halos de

inhibicin y traducirlos en la tabla con los trminos: sensible, intermedio o
resistente, segn corresponda.

59