Es necesaria la sntesis de ATP nuclear derivada de ADP por NUDIX5 para la remodelacin de la

cromatina

Los procesos nucleares clave en eucariotas, incluyendo la replicacin del ADN, la reparacin y
la regulacin de genes, requieren una remodelacin extensa de la cromatina catalizada por
enzimas que consumen energa. No est claro cmo se cumplen las demandas ATP de tales
procesos en respuesta a estmulos rpidos. Se analiz esta cuestin en el contexto de los
cambios de regulacin gentica masiva inducida por progestinas en clulas de cncer de mama
y encontr que la ATP se genera en el ncleo celular a travs de la hidrlisis de poli (ADP-
ribosa) a ADP-ribosa. En presencia de pirofosfato, la ADP-ribosa es utilizada por la
pirofosfatasa NUDIX5 para generar ATP nuclear. La fuente nuclear de ATP es esencial para la
remodelacin de la cromatina inducida por hormonas, la regulacin transcripcional y la
proliferacin celular.

Los procesos nucleares clave en eucariotas, incluyendo la replicacin del ADN, la reparacin y
la regulacin de genes, requieren una remodelacin extensa de la cromatina catalizada por
enzimas que consumen energa. No est claro cmo se cumplen las demandas ATP de tales
procesos en respuesta a estmulos rpidos. Se analiz esta cuestin en el contexto de los
cambios de regulacin gentica masiva inducida por progestinas en clulas de cncer de mama
y encontr que la ATP se genera en el ncleo celular a travs de la hidrlisis de poli (ADP-
ribosa) a ADP-ribosa. En presencia de pirofosfato, la ADP-ribosa es utilizada por la
pirofosfatasa NUDIX5 para generar ATP nuclear. La fuente nuclear de ATP es esencial para la
remodelacin de la cromatina inducida por hormonas, la regulacin transcripcional y la
proliferacin celular.

El ncleo de las clulas humanas requiere una cantidad sustancial de energa para replicar o
reparar el genoma y reprogramar la expresin gnica en respuesta a seales externas,
asegurando la accesibilidad del genoma para mediar los cambios extensos en la cromatina y la
organizacin de los nucleosomas. La suposicin es que las demandas energticas nucleares son
satisfechas por el trifosfato de adenosina (ATP) de las mitocondrias. Aunque esto puede ser el
caso en situaciones de estado estacionario, puede no ser suficiente para repentinos cambios
extensos en cromatina, y hace casi 60 aos se propuso que el ATP podra ser generado en
ncleos aislados (2, 3).

Para abordar este problema, se midieron los niveles de ATP en clulas vivas de cncer de
mama mediante detectores de la relacin ATP / ADP dirigidos al ncleo celular, mitocondrias o
citosol (4) (figs. S1, A aD). La exposicin a progestina (R5020) indujo un aumento de esta
relacin en algunos ncleos celulares (figura 1A y figura S1, E nd F), comportamiento que no se
observ en las clulas expuestas al disolvente (EtOH) (Figura 1B, panel derecho , Y la figura
S1G). Clulas que muestran un aumento de ATP nuclear tambin mostraron activado receptor
de progesterona (fosfo-PR), mientras que aquellos con niveles de ATP nuclear inalterado no
eran hormonas-sensible (Figura 1C).

El aumento de ATP nuclear se confirm en la poblacin de clulas mediante la construccin de

luciferasa (5) (figura S1, H a J) y se vio comprometida por la inhibicin de la produccin de ATP
mitocondrial (Fig. 1D y S1K), pero no mediante la inhibicin de la gluclisis con 2-desoxi-D-
glucosa (2DG) o 3- (3-piridinil) -1- (4-piridinil) -2-propen-1-ona (3PO) (figura S1, L a O). En
respuesta a la glucosa, la difusin del ATP mitocondrial condujo a un aumento de ATP nuclear
(figura S1P). Este aumento podra ser inhibido por la oligomicina (figura S1Q), lo que conduce
al rpido agotamiento de ATP nuclear; Tal resultado indica que el ncleo contiene una reserva
finita de ATP. Sin embargo, en las clulas expuestas a la hormona, el ATP nuclear continu
aumentando incluso cuando la produccin de ATP mitocondrial fue inhibida por la oligomicina
10 minutos despus de la adicin de hormonas (figura S1R). Por lo tanto, la ATP mitocondrial
se requiere slo durante los minutos iniciales de la respuesta hormonal.

La progestina conduce a cambios globales en la expresin gnica y la remodelacin de la

cromatina en clulas de cncer de mama T47D, un proceso que depende de un aumento
transitorio de poli (ADPribosa) mediada por PARP1 (PAR) (6-10) (Figura 2A). La inhibicin de
PARP1 impidi la acumulacin de PAR, mientras que la inhibicin de la PAR glicohidrolasa
(PARG) dio como resultado su persistencia (Fig. 2, A y B, y Fig. S2, A y B).

La disminucin transitoria concomitante en nicotinamida adenina dinucletido celular (NAD +)

podra ser bloqueada por la inhibicin de PARP (Figura 2C). Los niveles de PAR y NAD +
finalmente regresaron al estado basal en un proceso dependiente de PARG (Fig. 2, B y C). El
aumento de ATP nuclear inducido por hormona fue dependiente de PARP1 y PARG (Fig. 2, D y
E, y fig , S _ {2}, C a F); No se observaron cambios significativos en los niveles de ATP
mitocondrial o citoplasmtico (figura S2, C a E). ARNs especfico (ARN interferente pequeo)
knockdown mostr que este ATP nuclear es dependiente de PARP1 y no en otros miembros de
la familia PARP (figura S2G). Por lo tanto, tanto la formacin de PAR y su degradacin a ADP-
ribosa (ADPR) son necesarios para el aumento de los niveles de ATP nuclear.

PARP1 actividad depende de la NAD sintasa nuclear NMNAT1, que utiliza ATP de mitocondria
(11]. El agotamiento de NMNAT1 bloque el aumento de la ATP nuclear (Fig. 2, E y F, y Fig. S2,
H e I), explicando el efecto inhibidor de la oligomicina antes pero no despus de la exposicin
hormonal (Figura 1D y Figura S1N). La hiptesis de que despus de ~ 10 min de la exposicin
hormonal, suficiente NAD + se ha acumulado (Figura 2B) para mantener la generacin de ADPR
y ATP nuclear.

El anlisis protemico de un material inmunoprecipitado con un anticuerpo PAR en clulas de

control y clulas expuestas a hormonas (figura 3A y figura S3A) revel 1091 protenas poli-
ADP-ribosiladas o de unin a PAR (tabla S2). Nos centramos en las protenas inducidas por la
hormona que participan en el metabolismo de ADP y ADPR y se identific la ADP-azcar
pirofosfatasa NUDIX5 (tambin conocido como NUDT5) (12). Debido a que NUDIX5 interacta
con PAR y PARG (Figura S3B), est sobreexpresado en el cncer de mama (figura S3, C a F) y es
el miembro de la familia NUDIX ms abundante en clulas T47D (figura S3G), exploramos su
implicacin En la generacin nuclear de ATP. El agotamiento de NUDIX5 (Fig. 3B) no afect los
niveles de ARNm de otros miembros de la familia NUDIX (figura S3H), pero redujo
notablemente el aumento hormonal en la ATP nuclear sin afectar al ATP mitocondrial o
citoplasmtico (Fig. B y S3I).

Despus de la incubacin de NUDIX5 recombinante con ADPR y pirofosfato (PPi), se detect la

produccin de AMP y ATP tanto directamente por espectrometra de masas (Figura 3C) como
indirectamente (Figura S4, B y C). En ausencia de PPi, la generacin de ATP con NUDIX5 de tipo
salvaje y el mutante NUDIX5 catalticamente inactivo (EQ112) fue comparable (figura S4C). PPi
disminuy parcialmente la eficiencia de la reaccin hidroltica cannica generadora de AMP
(figura S4D). Se observ la generacin de ATP por NUDIX5 a partir de PAR marcado in vitro,
una reaccin dependiente de PARG y PPi (Fig. 3D y Fig. S4, E y F). La sntesis de ATP es
endergnica en condiciones estndar (DGm = 12,3 7,3 kJ / mol) (figura S4G), y prevalece la
sntesis de AMP (DGm = -22,2 7,3 kJ / mol). Por lo tanto, la hiptesis de que la sntesis de ATP
puede resultar de mayores concentraciones de ADPR y PPi y, posiblemente, a partir de
modificaciones postraduccionales de NUDIX5.

NUDIX5 es un homodmero (13). El anlisis fosfoprotemico mostr que NUDIX5 se fosforila en

Thr45 (T45) antes del tratamiento hormonal (figura S5A). Un NUDIX5 fosfo-T45-anticuerpo
especfico mostr una disminucin de phosphoNUDIX5 despus del tratamiento hormonal (Fig.
3E). La fosforilacin de T45 es importante para la estabilidad del homodmero, y la
desfosforilacin result en su desestabilizacin (Fig. 3, E y G, y pelculas S1 y S2), facilitando
eventualmente la sntesis de ATP.

Sobreexpresado NUDIX5 T45 mutante fosfomimtico (T45D) se comport como dominante

negativo para la hormona inducida por la proliferacin celular y la regulacin de genes (Fig. 3H
y S5B]. En relacin con el NUDIX5 de tipo salvaje y el mutante fosfo-nulo T45A-NUDIX5, el
T45D-NUDIX5 fosfoimtico resisti fuertemente a los cambios conformacionales (figuras S5, C
y D) .Adems, tanto el tipo salvaje como T45ANUDIX5 (figura S4A) generaron ATP en presencia
de PPi, mientras que T45D-NUDIX5 no lo hizo (figura S5E).

Por el contrario, la generacin de AMP por mutantes T45 slo fue afectada ligeramente por PPi
(valores de S5, F a J, Kd de tipo salvaje, 3,90 0,41 mM, T45A, 4,44 0,53 mM, T45D, 1,84
1,07 mM).

A continuacin exploramos el requisito de ATP nuclear para la regulacin de genes. La

inhibicin de PARG o el agotamiento de NUDIX5 comprometieron la regulacin del 50% de los
genes sensibles a las hormonas, con una superposicin clara (Figura 4A). La mayora (70%) de
los genes dependientes de NUDIX5 y PARG requeran ambas actividades, y la mayora de estos
genes tambin dependan de la poli-ADP-ribosilacin (Figura 4B). La proliferacin celular
inducida por progestina se anula por inhibicin de la formacin PAR (9) y por agotamiento de
PARG o NUDIX5 (figura 4C). Las clulas de cncer de mama MCF7 inducidas por estrgenos
mostraron incrementos en PAR y ATP nuclear que dependan de las actividades de PARP, PARG
y NUDIX5 (figura S5, A a D). Los cambios en la expresin gnica y la proliferacin celular en
respuesta al estrgeno tambin dependan de estas enzimas (Fig. 4, C y D).

En respuesta a la progestina, el desplazamiento inicial de la histona H1 o H2A depende de la

actividad de PARP1 (10), pero independientemente de PARG o NUDIX5, mientras que el
desplazamiento posterior depende de las tres actividades (figura S6, E y F). Por lo tanto, la
remodelacin inicial de nucleosomas utiliza un grupo ya existente de ATP nuclear (Fig. 1),
mientras que las etapas de remodelacin posteriores dependen de ATP nuclear derivado de
PAR. La extensin de la remodelacin global de la cromatina (H1, H2A) y el reclutamiento de
PARP1 y el factor de transcripcin de los dedos del PHD del bromodominio de ATPasa (BPTF)
se correlaciona bien con la necesidad de ATP nuclear (Figura 4, E a G) Dependiendo de la
remodelacin de la cromatina.
En las clulas de cncer de mama, PR interacta con PARP1 (10) y con el ADN-dependiente de
la protena quinasa Ku (14), lo que sugiere que PAR y ATP podra estar involucrado en la
reparacin del ADN (15-17). De hecho, la supervivencia de las clulas MCF7 despus del dao
del ADN depende de PARP1, PARG y NUDIX5 (figura S7, A y B). Hay evidencia de que la
expresin gnica inducida por hormonas cambia, y el estrs torsional soportado por la
cromatina es aliviado por la escisin de ADN local (18). Despus del dao, PAR podra servir
como una fuente local de ATP para la remodelacin extensa de la cromatina asociada con el
proceso de reparacin.

Recientemente se demostr que el PAR acta como una "semilla" durante la

compartimentacin nuclear mediante la disgregacin lquida (19); Tales tamices moleculares
transitorios mediados por protenas intrnsecamente desordenadas pueden tambin
proporcionar un entorno favorable local para la generacin de ATP por NUDIX5. Estos
organelos llamados "membranosos" pueden servir para concentrar no slo las enzimas, sino
tambin los sustratos requeridos para la generacin de ATP, dando lugar a un aumento local y
un entorno especfico para la remodelacin y / o reparacin de la cromatina.

Nuestro trabajo describe un mecanismo para la generacin de energa en los ncleos de las
clulas de cncer de mama expuestas a la hormona. El alto costo energtico de la modificacin
global de la cromatina se cubre mediante la conversin de ADPR a ATP y ribosa-5-fosfato
talyzed por la forma desfosforilada de NUDIX5.

La va se enciende mediante ATP mitocondrial requerido para la sntesis de NAD + mediada por
NMNAT1, que se convierte en PAR por PARP1 activado e hidroliza a ADPR por PARG (Figura S7,
C y D). Los niveles de ATP nuclear aumentan despus de la exposicin hormonal
independientemente de las fuentes mitocondriales y citoplasmticas de ATP, pero dependen
de la ADPR y PPi nucleares. Este ATP nuclear es necesario para la remodelacin de la
cromatina, la regulacin transcripcional y, en ltima instancia, la proliferacin celular.

NUDIX5 sobreexpresin en pacientes con cncer se correlaciona con un mal resultado en

varios tipos de cncer, incluyendo el cncer de mama (S8, A y B).

La correlacin con la alta expresin de PARP1 (figura S8C) puede sugerir que las clulas
cancerosas dependen de la generacin nuclear de ATP. Por lo tanto, NUDIX5 es un objetivo
prometedor para la terapia de frmacos combinatoria PARP1 (20).