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Salud Uninorte

ISSN: 0120-5552
saluduninorte@uninorte.edu.co
Universidad del Norte
Colombia

Rodrguez Martnez, Ral; Suescn Otero, Gina


Aplicaciones e inconvenientes de la tcnica Hibridacin in situ Fluorescente (FISH) en la identificacin
de microorganismos
Salud Uninorte, vol. 29, nm. 2, julio-diciembre, 2013, pp. 327-340
Universidad del Norte
Barranquilla, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=81730430017

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artculo de revisin / review article

Aplicaciones e inconvenientes de la tcnica


Hibridacin in situ Fluorescente (FISH) en
la identificacin de microorganismos

Applications and inconvenient of Fluorescence


in situ hybridization technique (FISH) in the
identification of microorganism

Ral Rodrguez Martnez1, Gina Suescn Otero2

Resumen

Durante el transcurso de los ltimos aos se ha reportado un gran nmero de aplicaciones


de la tcnica FISH, la cual es utilizada en la deteccin de microorganismos en su propio
hbitat sin que requieran de su previo aislamiento y purificacin. La importancia de FISH
radica en la capacidad que tiene la sonda de ADN de detectar una regin especfica del ci-
do nucleico de la clula microbiana y ser visualizada por microscopa de epifluorescencia.
En esta revisin se describe los diversos usos que tiene FISH, que van desde la identifica-
cin de la microbiota en ambientes acuticos y su empleo en la biorremediacin hasta la
deteccin de patgenos en el diagnstico clnico. Asimismo, se presentan algunas limita-
ciones, y los posibles correctivos que se deben tener encuenta cuando se aplica esta tcnica.

Fecha de recepcin: 24 de mayo de 2013


Fecha de aceptacin: 11 de julio de 2013
Palabras clave: Hibridacin, fluorescencia, sonda, FISH, fluorocromos, aplicaciones.

Abstract

During these recent years, a large number of FISH technique applications have been re-
ported. These techniques have been used in the detection of microorganisms in their own
habitat without requiring their previous isolation and purification. The importance of
FISH lies in the ability of the DNA probe to detect a specific region of the nucleic acid of
microbial cells and to be visualized by epifluorescence microscopy. This review describes
the various FISH uses ranging from the identification of the microbiota in aquatic environ-

1
Bacterilogo y Laboratorista Clnico MSc, Ph.D. Docente de la Facultad de Salud, Universidad de
Pamplona (Colombia). rrodriguez@unipamplona.edu.co
2
Investigadora Ondas Colciencias. Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Quimica, Bo-
got, D.C. (Colombia). ginas200331@hotmail.com
Correspondencia: Ral Rodrguez Martnez. Universidad de Pamplona, Facultad de Salud, Pamplona
(Norte de Santander). Ciudadela Universitaria, km 1, va a Bucaramanga (Colombia). rrodriguez@ Vol. 29, N 2, 2013
unipamplona.edu.co ISSN 0120-5552

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ments and their use in bioremediation, to the detection of pathogens in clinical diagnosis.
It also presents some limitations as well as the potential solutions to be applied when the
FISH technique is used.
Key words: Hybridization, Fluorescence, Probe, FISH, Fluorochromes, Applica-
tion.

INTRODUCCIN Desde sus primeras aplicaciones la tnica


de FISH se ha empleado en una gran canti-
FISH o Hibridacin in situ Fluorescente es dad de estudios tendientes a identificar mi-
una tcnica que detecta secuencias de ci- croorganismos presentes en muestras tanto
dos nucleicos en clulas o tejidos preserva- ambientales como clnicas. Se estima que
dos mediante el empleo de una sonda mar- nicamente el 0,3 % de bacterias del suelo
cada con un fluorocromo, la cual va dirigi- y < 0,1 % de agua marina son cultivables;
da hacia un lugar especfico del cromosoma por eso, uno de los usos de FISH es el re-
y que emite fluorescencia que puede ser ob- cuento microscpico de clulas totales, el
servada por medio de un microscopio. La cual supera al nmero de bacterias que lo-
tcnica de hibridacin in situ se fundamen- gran crecer en un medio de cultivo; adems
ta en la capacidad que poseen los cidos permite apreciar la variacin filogentica y
nucleicos para hibridarse entre s, es decir, geogrfica de las bacterias presentes en una
la existencia de determinada secuencia de comunidad microbiana (5).
ADN o ARN, que resulta complementaria
con otra secuencia a travs de puentes de Debido a la importancia que adquiere da
hidrgeno formados entre las bases adeni- a da la tcnica de FISH en el campo de la
na- timina (DNA) o uracilo (RNA) y citosina- identificacin molecular de los microorga-
guanina (DNA y RNA). nismos, este trabajo hace una revisin de
las aplicaciones en reas del conocimiento
Los mtodos tradicionales de identificacin como la clnica, medio ambiente, simbiosis
microbiana basados en medios de cultivo entre planta - microorganismo y biorre-
en muchos casos requieren de tiempos lar- mediacin; de igual manera, describe los
gos de incubacin y en ocasiones se deben inconvenientes que se presentan al aplicar
emplear medios selectivos complejos, espe- esta tcnica. Esta informacin servir de
cialmente cuando se pretende aislar bacte- base para los trabajos que se realicen y que
rias de difcil crecimiento (1); adems, estos estn orientados a reconocer la microbiota
mtodos no reflejan la poblacin exacta o la asociada a los diferentes ecosistemas.
mezcla de las comunidades bacterianas pre-
sentes en el microhbitat (2). Por su parte, la Metodologa de FISH
identificacin empleando la tcnica de FISH
combina la precisin de la gentica molecu- Un protocolo de la tcnica de FISH incluye
lar con la informacin visual de la microsco- 4 pasos (figura 1): (i) fijacin y permeabili-
pa, lo cual permite la identificacin y visua- zacin de la muestra, (ii) hibridacin, (iii)
lizacin de la clula microbiana individual lavado y (iv) la deteccin de las clulas
dentro de su microhbitat natural o tejido marcadas a travs del microscopio de epi-
en el que se encuentre presente (3-4). fluorescencia o confocal (6). Antes de la hi-

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bridacin, el cultivo, la muestra o tejido que de medios de cultivos con caractersticas


contiene microorganismos deben ser fijados nutricionales bastante exigentes, y otras
y permeabilizados para facilitar la penetra- necesitan periodos largos de incubacin, lo
cin de la sonda fluorescente dentro de la cual dificulta el suministro de un tratamien-
clula y para proteger al ARN de la degra- to antimicrobiano efectivo en corto tiempo.
dacin por ribonucleasas endgenas. La hi- Afortunadamente, en los ltimos aos se ha
bridacin es el proceso en el que a la muestra incursionado el empleo de diversas tcni-
desnaturalizada se le aade la sonda de in- cas de diagnstico molecular, y en conjunto
ters que se unir a la secuencia escogida del con FISH han sido tiles para identificar o
ARNr. Pasado el tiempo de hibridacin, las caracterizar rpidamente los microorganis-
lminas son lavadas con agua destilada para mos de importancia mdica (7, 8, 9), desde
remover la sonda que no se uni. Finalmen- aquellos asociados a enfermedades de la
te, se realiza la visualizacin de la muestra, boca hasta los que generan infecciones in-
la cual requiere de un microscopio de epi- ternas en rganos, y de esta manera dar un
fluorescencia equipado con diversos filtros manejo adecuado del paciente cuando se
para los diversos espectros de color. trata de establecer la terapia antimicrobiana
especfica (10).

Fijacin Respecto a la microbiota que ataca los dien-


tes, las fases de la infeccin del tejido pul-
preparacin de
par por microorganismos de la dentina si-
la muestra guen siendo un misterio; por esto diversos
estudios se han enfocado a dilucidar estos
Hibridacin agentes microbianos mediante la hibrida-
cin fluorescente in situ, empleando seccio-
nes del tejido, el cual es embebido en resina.
Lavado De esta manera, se ha logrado identificar
los consorcios bacterianos asociados con ca-
ries avanzada de la dentina. Los principales
Visualizacin
grupos microbianos aislados estn domina-
dos por las bacterias de las familias Lacto-
Fuente: propia de los autores. bacillaceae, Streptococcaceae, Veillonellaceae,
Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Coriobacteria-
Figura 1. Diagrama de flujo de un tpico proce- ceae, Bifidobacteriaceae, Propionibacteriaceae y
dimiento de FISH Prevotellaceae, as como fusobacterias. Las
sondas de ARNr 16S correspondientes a los
Aplicaciones de FISH taxones principales de las bacterias en la
dentina cariosa se han utilizado para pro-
a. Identificacin de microorganismos de porcionar informacin sobre las caracters-
inters clnico ticas de la infeccin de la pulpa dental (11).

Para su crecimiento y posterior identifica- La relacin entre las bacterias periodonto-


cin, muchas bacterias patgenas requieren patognicas y el desarrollo de la ateroscle-

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rosis ha estado bajo investigacin durante no, y aunque la mayora de los portadores
muchos aos, y ha proporcionando eviden- son asintomticos, la colonizacin puede
cia creciente de que la inflamacin crnica conducir al desarrollo de varias enfermeda-
de la enfermedad periodontal podra actuar des gstricas, como la enfermedad de lcera
como un factor adicional para la aterog- pptica, la mucosa gstrica asociada a tejido
nesis. El uso de la tcnica de FISH apoya la linfoide (MALT) y el carcinoma gstrico. La
hiptesis de que patgenos periodontales infeccin puede ser diagnosticada median-
metablicamente activos, como Treponema te sondas fluorescentes de oligonucletidos
denticola y Porphyromonas gingivalis aisla- que van dirigidas a regiones especficas del
dos a partir de biopsias de pacientes pe- H. pylori. Adems, mediante la hibridacin
riodontopticos o desdentados que sufren se puede detectar la resistencia de la bacte-
de arteriosclerosis, pueden estar ubicados ria al antibitico claritromicina cuando la
dentro de la pared de la arteria en la capa sonda se une al gen ribosmico 23S (ARNr
ntima a la lesin aterosclertica (12). 23S), lo cual permite obtener resultados al
cabo de tres horas, garantizando de esta
Otra de las enfermedades muy comunes en manera un tratamiento efectivo (14).
nuestro medio es la faringitis, la cual es una
infeccin causada por diversos virus o bac- La infeccin de las vas digestivas tambin
terias, siendo el estreptococo betahemolti- es causada por espiroquetas y se asocia con
co del grupo A (EBHGA) el principal agente el crecimiento excesivo de bacterias del g-
causal. Sin embargo, el cuadro clnico de la nero Brachyspira en el intestino grueso. El
faringoamigdalitis es inespecfico, debido diagnstico microbiolgico mediante cul-
a que los casos de infeccin estreptoccica tivo se ve obstaculizado por el lento creci-
moderada son indistinguibles de una infec- miento y, a su vez, por la naturaleza exigen-
cin vrica. Dado que no es posible realizar te de Brachyspira spp., por lo que en la prc-
un estudio microbiolgico completo de los tica clnica la infeccn intestinal es diagnos-
potenciales microorganismos responsables, ticada histopatolgicamente, y an as, una
las pruebas deben dirigirse a identificar el porcin significativa de los casos analiza-
EBHGA, por el riesgo de complicaciones dos pueden presentar falsos positivos. De-
supuradas e inmunolgicas que implica su bido a que FISH permite la visualizacin e
presencia. Es aqu cuando las tcnicas mo- identificacin de bacterias individuales en
leculares, y entre ellas FISH, son indispen- secciones de tejido, se han diseado sondas
sables para la identificacin rpida de S. que permiten identificar todas las especies
pyogenes por su alta sensibilidad y especifi- de Brachyspira con base en la secuencia de
cidad (13) y para iniciar lo antes posible la datos del gen ARNr 16S actualmente dispo-
terapia con antibiticos que permitan evitar nibles (15).
complicaciones y detener la transmisin de
la infeccin a otras personas. La presencia de parsitos tambin es detec-
tada mediante FISH. Un ejemplo es el par-
El tracto digestivo puede ser infectado por sito del gnero Cryptosporidium, que puede
varios patgenos, y entre estos la bacteria causar infeccin gastrointestinal en el hom-
Helicobacter pylori, la cual es conocida por su bre, la cual presenta un cuadro de diarrea
capacidad de colonizar el estmago huma- acuosa y voluminosa con moco, sin sangre

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ni leucocitos, tras una semana de incuba- ta de diagnstico muy til en este tipo de
cin. De manera caracterstica, la identifica- infecciones, por tener una alta precisin y
cin de las especies de este gnero a partir un tiempo de respuesta rpido (3-4 h) (19).
de la morfologa del ooquiste constituye De igual manera, la rapidez y sensibilidad
una gran dificultad, ya que las diferencias se pueden apreciar en otro tipo de mues-
en algunos casos son indetectables. En la ac- tras, como en la deteccin de bacterias que
tualidad se recurre a la biologa molecular no crecen en cultivos a partir de muestras
con tcnicas de hibridacin para identificar de lesiones de tejido blando (20) y de biope-
especies y genotipos de este y otros parsi- lculas que se forman en fracturas de huesos
tos (16). en proceso de cicatrizacin (21).

En infecciones sanguneas, el hallazgo de Las infecciones intrahospitalarias (IIH) son


cocos Gram positivos dispuestos en raci- un problema de salud pblica en nuestro
mos (CGPR) en una muestra de hemocul- pas por su frecuencia, severidad y alto
tivo es sugestivo de bacteriemia, pero la costo, de manera que la identificacin fia-
relevancia del diagnstico depende de la ble y rpida de los microorganismos es de
identificacin correcta del microorganismo suma importancia para dar el tratamiento
y su evaluacin dentro del contexto clnico adecuado y comprender su papel en la pa-
de cada paciente. En estos casos, el uso de la tognesis de las infecciones. En la prctica
Hibridacin in situ ha mostrado ser un m- clnica, FISH puede ser utilizado en situa-
todo rpido, fidedigno y practicable para ciones en las que una identificacin rpida
la identificacin directa de bacterias que se es necesaria para un tratamiento ptimo del
han desarrollado en hemocultivos, median- paciente, y por otra parte, para conocer la
te sonda dirigida, por ejemplo, al gen ribo- abundancia, distribucin espacial y la mor-
smico de Staphylococcus aureus (17). fologa de las clulas bacterianas que pue-
dan presentarse en las diversas salas, como
Se ha reportado el empleo de FISH para de- urgencias, obstetricia, pediatra o ciruga,
tectar biopelculas formadas por bacterias entre otras, y determinar los tipo de micro-
en diferentes procesos infecciosos. De esta bios que puedan estar adheridos a material
manera, ha permitido esclarecer cul es la como vendas, ropas, sondas, monitores o
distribucin espacial de las bacterias forma- instrumentales.
doras de biofilms que predominan en las
heridas crnicas de la piel humana y para b. Ambientes acuticos
obtener la medida de la respuesta inflama-
toria celular contra las bacterias en dichas FISH permite detectar los microorganismos
heridas (18). Otros estudios estn enfoca- individuales en su microhbitat sin ningn
dos a la bsqueda de bacterias causantes paso de purificacin selectiva o amplifica-
de infecciones del tracto urinario. En esta cin, por lo que puede ayudar a desvelar
caso, en comparacin con los mtodos con- la funcin ecolgica que cumplen all. Se
vencionales de identificacin, el mtodo de han realizado revisiones del empleo de esta
FISH produce resultados positivos para el> tcnica en el estudio de la diversidad de las
90 % de las muestras analizadas y tiene el poblaciones ambientales como en hbitats
potencial de convertirse en una herramien- acuticos (22) y en los grupos microbianos

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especficos que participan en la eutrofica- termales y su participacin en el ciclo del


cin del agua marina, y ms recientemente azufre (27). De igual manera, FISH ha sido
ha permitido estudiar la comunidad bac- til para determinar la asociacin sintrfica
teriana presente en el fitoplancton del no- que se presenta en la comunidad de bacte-
roeste del ocano Pacfico con el apoyo de la rias que oxidan el amonio (AOB) y el nitrito
tcnica inmunocitoqumica con bromodes- (28).
oxiuridina (BIC-FISH) (23).
d. Biorremediacin
Las arqueobacterias cuyo hbitat son fuen-
tes termales, depsitos profundos de petr- Se destacan trabajos con FISH en procesos
leo caliente, fumarolas marinas, lagos sali- de tratamiento de aguas de desecho con
nosos o ambientes polares han sido estudia- residuos txicos y recalcitrantes como los
das mediante FISH, y en algunos casos con compuestos fenlicos (29), en el empleo de
el uso combinado de microsensores, lo cual bacterias Gram positivas, tiles en la de-
permite el anlisis simultneo de la comu- gradacin anaerbica del benceno (30), as
nidad bacteriana y su actividad metablica como en la identificacin de microorganis-
(2-24). Se han diseado sondas para cuanti- mos empleados en la biorremediacin de
ficar miembros especficos de una comuni- compuestos xenobiticos (31) y de hidro-
dad microbiana que habita en el hielo, como carburos poliaromticos (32).
Octadecabacter, Glaciecola y Polaribacter, y se
ha determinado la influencia de los cambios Otras aplicaciones estn orientadas a eva-
estacionales en la identidad y la actividad luar los procesos metablicos que realizan
in situ de las asociaciones microbianas que ciertas bacterias empleadas en la oxidacin
habitan en el rtico (25). de hierro (33) y el uso de bacterias magneto-
tcticas (34). El empleo de oligos especficos
c. Plantas de tratamiento ha sido til en la deteccin de cepas que co-
lonizan superficies de las rocas y estn in-
Los primeros trabajos realizados empleando volucradas en procesos de biodeterioro de
FISH se enfocaron a determinar la cantidad monumentos (35).
de microorganismos presentes en las aguas
residuales de las plantas de tratamiento. e. Simbiosis
Posteriormente se orient su uso a evaluar
la relacin entre el volumen de lodos acti- Algunos microorganismos que realizan sim-
vados y la presencia de bacterias filamento- biosis son difciles de aislar en cultivos pu-
sas; asimismo, ha sido til en el monitoreo ros. en estos casos FISH se convierte en una
microbiano de procesos de degradacin de herramienta que facilita la identificacin de
una mezcla de lodos activados a partir de microorganismos asociados a plantas, ya
desechos vegetales (26). que permite la localizacin del microorga-
nismo dentro del husped. Esta tcnica se
Las recientes investigaciones se han orien- ha aplicado a la deteccin de bacterias in-
tado a analizar la distribucin in situ y la tracelulares de yemas y races de plantas; de
funcin de las bacterias sulfato-reductores igual manera, para mostrar la presencia de
presentes en tapetes microbianos de aguas bacterias fijadoras de nitrgeno en la caa

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de azcar (36) y en trabajos de identificacin problemas que se pueden presentar duran-


de Micromonospora spp., y Paenibacillus spp. te el desarrollo de la tcnica:
en ndulos de la planta Lupinus (figuras 2)
(37) y de bacterias endofticas del cactus (38). a. Autofluorescencia

a) b)
Algunos microorganismos producen au-
tofluorescencia, la cual enmascara la seal
que emite la propia muestra en estudio.
Es el caso de algunas especies bacterianas
como Salmonella, arqueobacterias como las
metangenas y de una variedad de mohos
y levaduras (45), cianobacterias (46) y algas
Fuente: propia de los autores.
verdes como las Chlamydomonas (47).

Figura 2. FISH en una mezcla de los cultivos La fluorescencia tambin se puede encon-
puros de Paenibacillus spp. (P) y Bradyrhizobium trar en el material que rodea las clulas mi-
spp. (B), aislados de la planta Lupinus. (a) Mi- crobianas; por ejemplo, en el tejido de las
croscopa de contraste en la que se observan las plantas, lo cual es una fluorescencia biolgi-
dos morfologas bacterianas. (b) Hibridacin ca natural (37) (figura 3). Adems se presen-
nicamente de Paenibacillus con la sonda mar- ta en muestras ambientales como lodos ac-
cada con Cy3. Barra, 2 mm. tivados o plantas de tratamiento de aguas,
donde la fluorescencia es causada por los
La interaccin de bacterias con otros orga- desechos inorgnicos all presentes (48).
nismos ha sido tema de muchos trabajos en
los que la tcnica de FISH se convierte en
una enorme herramienta de utilidad. Por
citar algunos ejemplos, se ha aplicado para
determinar el arreglo espacial de las bacte-
rias en tejidos de esponjas (39), en la iden- a)
a
b)
b

tificacin de endosimbiontes de amebas de


vida libre (40), en hongos micorrizas arbus- Fuente: Propia de los autores.

culares (41), en el estudio de la microbiota


intestinal de gusanos marinos (42) y de ter- Figura 3. FISH de ndulos Lupinus angustifolius
mitas (43), as como de bacterias quimiosin- con la sonda Lupsa Cy3 en microscopio de
tticas hospedadas en vertebrados marinos epifluorescencia. a. Tejido visto en contraste de
fases, b. Se aprecia la fluorescencia emitida por
(44).
las bacterias, la cual es ms intensa (lo indica
las flechas) que la autofluorescencia del tejido
INCONVENIENTES AL APLICAR
vegetal.
LA TCNICA FISH

Aun cuando es una tcnica bastante espec- Son escasos los estudios que se centran en
fica y sus resultados son altamente confia- el anlisis del fenmeno de autofluorescen-
bles, es necesario tener en cuenta algunos cia y cmo evitar la interferencia con FISH,

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sin embargo, se ha encontrado que el medio fluorescencia sern consideradas como los
de crecimiento, los mtodos de fijacin y el organismos que son objeto de estudio (51).
medio de montaje influyen en la intensidad
de la seal. c. Dificultad de acceso de la sonda al
sitio diana
Algunas formas de evitar la autofluorescen-
cia son mediante el empleo de FISH con otra La baja intensidad de la seal puede presen-
tcnica de deteccin (22), manipulando el tarse como consecuencia de la insuficiente
sistema de filtros durante la visualizacin y penetracin de la sonda dentro de la clula
sistemas que permitan amplificar la seal, o bacteriana, lo cual depende de la estructu-
mediante el procesamiento y manejo digi- ra de su pared celular. Las bacterias Gram
tal de los espectros obtenidos en la imagen negativas generalmente no tienen ningn
(49). problema, ya que su pared es permeable a
la sonda de oligonucletidos.
b. Especificidad de la sonda
En algunos casos, por ejemplo, al emplear
La exactitud y confiabilidad de los resulta- bacterias Gram positivas se debe realizar
dos obtenidos por FISH depende de lo espe- un tratamiento enzimtico con lisozima o
cfica que sea la sonda de oligonucletidos. proteinasa K que permita abrir la capa de
El diseo, as como la evaluacin exhaustiva peptidoglicano (37). En bacterias que con-
de nuevas sondas, son pasos crticos, por lo tengan en su pared cido miclico, como
que las sondas deben ser fabricadas en labo- en los actinomicetos Mycobacterium o No-
ratorios que tengan una amplia experiencia cardia, se debe realizar la permeabilizacin
en microbiologa y en mtodos de biologa empleando una hidrlisis cida con HCl 1M
molecular. Cada experimento debe incluir o tratarlas con mutanolisina o 1,4 ditio-L-
tanto controles positivos como negativos; en treitol (52).
el control negativo se debe emplear sondas
dirigidas hacia cepas que estn relacionadas En el estudio realizado por Yilmaz y su
filogenticamente con la cepa en estudio equipo de trabajo desarrollaron un mode-
(50). lo termodinmico de la hibridacin, el cual
provee los mecanismos para calcular la
A pesar de que la sonda haya sido bien dise- afinidad de la sonda al sitio especfico del
ada y probada se puede presentar la unin ARNr, la cual est definida sobre todo por
a microorganismos que no se hayan descri- los cambios en la energa libre de Gibbs (53).
to hasta el momento, especialmente cuando
se estudia algn tipo de bacteria especfica d. Estructuras de Orden Superior
a partir de una poblacin. Para permitir que
el organismo de inters sea detectado es Debido a la forma tridimensional del ARNr,
conveniente emplear 2 sondas especficas la formacin de horquillas, as como las in-
marcadas con diferentes fluorocromos que teracciones protena-ARNr, hacen que la se-
vayan dirigidas a distintas posiciones del cuencia de oligonucletidos que conforma
ARNr 16S, y de este modo, las clulas que se la sonda en muchas ocasiones tenga dificul-
detecten con ambas sondas y exhiban doble tad de acceder al sitio especfico, impidien-

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do de esta manera la hibridacin. Esto ex- Por otra parte, la sensibilidad tambin se
plica el porqu sondas que han presentado puede incrementar utilizando sondas de
buena hibridacin empleando ARN o ADN polirribonucletidos, as como por medio
desnaturalizado no dan resultados satisfac- de la incubacin de las clulas en cloranfe-
torios en FISH (54). nicol, el cual inhibe la sntesis de protenas
y degradacin del ARNr. De esta manera, la
En un estudio sistemtico dirigido a eva- divisin celular tambin se inhibe, lo cual
luar este problema se crearon ms de 200 lleva a una acumulacin e incremento de
sondas de oligonucletidos especficas para ARNr dentro de la clula (57).
diferentes posiciones en el ARNr 16S de E.
coli y se midi por citometra de flujo la in- En el caso de especies de lento crecimien-
tensidad de la seal emitida por FISH. Se to se recomienda emplear marcadores que
emplearon helperoligos, los cuales son produzcan una gran intensidad de luz fluo-
oligonucletidos no marcados que se unen rescente, como el Cy3- Cy5. Tambin se pue-
a los sitios cercanos de unin de la sonda de usar 2 o ms sondas especficas marcadas
marcada y abren la estructura secundaria con el mismo fluorocromo, que permitan
del ARNr, facilitando de esta manera que la aumentar el nmero de molculas fluores-
sonda marcada se una al sitio especfico e centes por clula. Esta tcnica est limitada,
incrementando hasta 25 veces ms la seal por supuesto, a la disponibilidad de sitios
(55). especficos para la sonda (51).

e. Bajo contenido de ARNr f. Prdida de fluorescencia

Normalmente el contenido de ARN riboso- Muchos fluorocromos se pueden decolorar


mal de las bacterias puede variar considera- al ser excitados por el haz de luz y sufrir
blemente no solo entre especies, sino dentro el proceso de degradacin paulatina e irre-
de cepas de una misma especie. Lo anterior versible a travs del tiempo. Periodos de
depende del estado fisiolgico que presen- exposicin de la muestra de solo algunos
ten las clulas y que a su vez se correlaciona segundos o minutos pueden tener un efec-
con la tasa de crecimiento. La disminucin to crtico, particularmente cuando se desea
de la actividad celular debido a factores nu- obtener microfotografas. Para superar este
tricionales conlleva a una baja cantidad de inconveniente es aconsejable el uso de una
ARNr que genera pocos sitios de unin de la serie de filtros de banda estrecha, as como
sonda fluorescente, lo que se traduce en una del empleo de marcadores fotoestables y
escasa intensidad luminosa y, por ende, en de reactivos que evitan la prdida de color
resultados falsos negativos. Esta limitacin como el citifluor AF1 o Gelvatol.
puede mejorarse mediante el empleo de un
modelo termodinmico de competencia de g. Uso de sondas bacterianas
las sondas, el cual permite conocer el nme-
ro de copias de ARNr 16S presentes en las Una alternativa para evaluar si se presen-
bacterias y que son necesarias para detec- tan problemas metodolgicos de la tcnica,
tarlas mediante la tcnica CARD-FISH (56). as como de resultados falsos negativos, es
mediante el empleo de una sonda bacteria-

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na universal. Si la hibridacin con la son- estos ltimos aos es la Hibridacin in situ


da universal da resultados satisfactorios Fluorescente (FISH). La hibridacin in situ
en FISH, se puede deducir que la fijacin, se utiliza en los casos en que los microor-
la penetracin de la sonda y contenido de ganismos por estudiar resultan difciles o
ARNr 16S de clulas bacterianas no son los imposibles de cultivar, como en el caso de
factores limitantes. las bacterias que requieren exigencias nu-
tricionales y ambientales que los medios de
La sonda universal EUB 338 (de eubacterias) cultivo no les proporcionan, y adems se
es la sonda de uso comn para este prop- utiliza cuando en la muestra el material por
sito, sin embargo, en algunos phyla, como evaluar es insuficiente.
por ejemplo Planctomycetes y Verucomicrobia,
esta sonda no es til. Debido a que la sonda Por otra parte, en el trabajo diario con FISH
EUB 338 se usa como rutina para cuantificar se pueden presentar diversos inconvenien-
miembros del dominio bacteria, ha sido me- tes. Pero ms all de estas limitaciones se
jorada por 2 sondas ms: la EUB 338 II y EUB deben buscar alternativas que hagan cada
338 III, que van dirigidas hacia bacterias que da ms eficiente la labor, y son esas nuevas
no son detectadas por la EUB 338. Para tener opciones de mejora a la tcnica las que se ha
un control de la unin no especfica de la venido presentando con el transcurso de los
sonda eubacteria al ARNr 16S o a otros com- aos y con el avance de otras tecnologas.
ponentes celulares como los cidos nuclei-
cos, se puede usar la sonda complementaria En los ltimos aos, el uso de FISH con mi-
NON 338, la cual no deber dar ninguna se- crosensores ha facilitado el estudio y moni-
al con el FISH. Otra sonda empleada es la toreo de la actividad metablica, cambios en
GAM42, dirigida al ARNr 23S de la mayora las poblaciones microbianas y el crecimien-
de los miembros de las gammaproteobacte- to de la biopelcula a travs del tiempo. La
rias (51). direccin de la tcnica FISH apunta hacia el
empleo con las tecnologas omicas como
La accesibilidad de la sonda al sitio diana la metagenmica, transcriptmica y prote-
puede mejorarse mediante el empleo de mica. De igual manera, la utilidad de FISH
sondas coadyudantes no marcadas, el in- con la espectrofotometra de masa inica
cremento del tiempo de hibridacin hasta (FISH-NanoSIMS) ha abierto las puertas ha-
96 horas o el uso de sondas de cidos nu- cia el anlisis metablico de clulas indivi-
cleicos peptdicos (PNAs). duales a partir de grupos filogenticos mi-
crobianos. La principal ventaja que presen-
CONCLUSIONES ta esta tcnica es que permite correlacionar
la identidad filogentica del gen ARNr 16S
Uno de los objetivos del empleo de tcnicas con la funcin metablica especfica que
microbiolgicas moleculares es identificar y presenta en la clula (58).
cuantificar los microorganismos presentes
en un determinado ecosistema de una ma- Como se puede apreciar, de manera cons-
nera rpida y efectiva sin que se requiera el tante aparecen nuevas publicaciones en las
empleo de mtodos de cultivo. En este con- que se muestra la diversidad de campos de
texto, una de las tcnicas ms utilizadas en aplicacin de FISH, la cual se ha extendido

336 Salud Uninorte. Barranquilla (Col.) 2013; 29 (2): 327-340


Aplicaciones e inconvenientes de la tcnica Hibridacin in situ Fluorescente (FISH)
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