BIOTECNOLOGIA ASOCIADA A LA GENERACION DE

PIGMENTOS MICROBIANOS PARA LOS ALIMENTOS

Autor: Ignacio J. Atenas Rodrguez.

Asignatura: Bioprocesos en empresas

alimentarias.

Docente: Alejandra Arancibia Daz.

Fecha: 29-10-2014.
ndice de contenidos

N Pgs.

Resumen. 1-2

Abstract. 3-4

Introduccin. 5

Desarrollo y Marco terico. 6-10

Hallazgos 11

Resultados. 12-18

Gnero Monascus.

A. Condiciones fermentativas en Monascus. 12-14

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos. 14
C. Estabilidad de los pigmentos. 14-15

Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma).

A. Condiciones fermentativas en X. dendrorhous (Phaffia rhodozyma). 16-17

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos. 17
C. Estabilidad de los pigmentos. 17-18

Discusiones y conclusiones 19-20

Recomendaciones 21-22

Referencias 23-24
ndice de tablas

Tab. 1. Crecimiento, produccin de biopigmentos y sntesis de citrinina por

diferentes cepas de Monascus, despus de 7 das de incubacin (en arroz) y 11
das (en bagazo de yuca, CB) Pg. 14

Tab. 2. Relacin de carotenoides encontrados en X. dendrorhous y la cantidad

media en la que estn presentes. Pg. 18

Tab. 3. Comparacin del crecimiento de distintas cepas de X. dendrorhous, en

distintos sustratos indicando la produccin de astaxantina. Con un asterisco (*) se
indican las cepas mutantes.YE:extracto de levadura; ME:extracto de malta. Pg.18

ndice de figuras

Fig. 1. Frmulas qumicas de algunos pigmentos microbianos de calidad

alimentaria. Pg. 2

Fig. 2. Variacin de color (medida como absorbancia relativa) con tiempo (en
horas) para soluciones de pigmentos acuosos a diferentes temperaturas de
incubacin, con pH 6. Pg. 15

Fig. 3. Variacin de color (medida como absorbancia relativa) con tiempo (en
horas) a diferentes valores de pH 6, a 100C Pg. 15

Fig. 4. Propiedades crticas de varios solventes. Pg. 20

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Resumen

El color de los alimentos entrega una primera impresin a cerca de ellos e influye
en la decisin final de cul de ellos consumir. El uso de colorantes sintticos
nocivos en los alimentos abri la bsqueda de pigmentos de origen natural. En
esta perspectiva, la extraccin de pigmentos microbianos se ha enfocado en la
obtencin de carotenos, de alta demanda comercial, tales como astaxantina,
licopeno, -caroteno, y zeaxantina; estos carotenoides por ejemplo, han sido
utilizados como complemento en las dietas de salmnidos para mejorar e
intensificar la coloracin de su carne. Los carotenoides extrados de Monascus,
han sido usados en China para la produccin de arroz rojo chino (Ang-Khak),
queso de soya, vino Shao-Shing, y vino rojo de arroz. Las levaduras Monascus
producen pigmentos con tonalidades que van del rojo al amarillo de carcter
hidrosolubles, y que difunden por todo el medio de cultivo; dada esta condicin
han podido ser extrados fcilmente mediante solventes apropiados o bien por la
tecnologa de fluidos supercrticos. Por otro lado, diferentes carotenoides
producidos por la levadura Phaffia rhodozyma y la cantidad del carotenoide
principal, astaxantina, han podido modificarse por cambios en la composicin del
medio de cultivo y por otros factores ambientales. Alternativamente, otros ensayos
de laboratorio han logrado modificar genticamente el hongo Fusarium
sporotrichioides para la elaboracin del colorante y antioxidante licopeno (de color
rojo) a partir del material de fibra de maz, un residuo de la industria energtica del
etanol. Siguiendo esta lnea, el -caroteno del hongo Blakeslea trispora, se ha
posicionado en la cspide de la industria alimentaria; as, al introducir iononas,
amidas, imidas, lactamas, hidrazidas, o piridinas sustituidas y, en particular
succinimida y isonicotinoylhidrazina, han producido un incremento de dos o tres
veces en la cantidad de -caroteno presente en los medios de cultivo; as mismo,
cepas apareadas de Blakeslea trispora han sintetizado 850 mg/g de peso seco de
carotenos.

Otros pigmentos han sido aplicados exitosamente al uso de la industria de

alimentos, tal es el caso del colorante arpink-red de Penicillium oxalicum, los
pigmentos derivados de Monascus purpureus (ankaflavina/monascina, de color
amarillo, la rubropunctatina/monascorubrina de color anaranjado, la
rubropunctamina/monascorubramina, de tonalidad prpura; el pigmento
cantaxantina en la cianobacteria Anabaena variabilis, y la riboflavina de Ashbya
gossypi, un superproductor de este pigmento en cantidades superiores a 1 g/L.

El xito de cualquier pigmento derivado de la fermentacin microbiana, depende

de su aceptacin en el mercado, de la aprobacin regulatoria, y el tamao de la
inversin de capital necesaria para llevar dicho producto al mercado. En trminos
de laboratorio, el trabajo se ha orientado en mejorar los parmetros de cultivo y las
condiciones fsico-qumicas respectivas (temperatura, pH, aireacin, relacin C:N);
variables como la solubilizacin, estabilidad y la extraccin de pigmentos en
solucin, han sido parmetros para medir la alta calidad fermentativa del
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colorante. ltimamente se ha usado la ingeniera gentica, mediante la cual se

han logrado producir mutantes con cambios en la capacidad de producir
pigmentos, tal es el caso de Escherichia coli, trasformada y condicionada para la
sntesis de carotenoides.

Palabras clave: Astaxantina, -caroteno, licopeno, Monascus purpureus, Phaffia

rhodozyma, Blakeslea trispora, calidad fermentativa.
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Abstract

The foods color gives a first impression about of them and this have influence in
the final decision of which of them consume. The use of harmful synthetic dyes in
the foods opened the search of pigments from naturally origin. In this perspective,
the extraction of microbial pigments has focused in the obtaining of carotenes of
high market demand, such as astaxanthin, lycopene, -carotene, and zeaxanthin;
these carotenoids for example, have been used as supplement in the salmonid
diets to enhance and intensify the coloration of its flesh. The carotenoids extracted
from Monascus have been used in China to the production of chinese red rice
(Ang-Khak), soya cheese, Shao-Shing wine, and red wine of rice. The yeasts
Monascus produce pigments with tonalities that ranging from red at yellow of
soluble character and that disseminate for all the culture medium; happened this
condition has been able easily extract it by means of suitable solvents or well for
the supercritical fluid technology. For other side, different carotenoids produced by
the yeast Phaffia rhodozyma and the amount of the principal carotenoid,
astaxanthin, they have been modified by changes in the composition of the growth
medium and by means of other environmental factors. Alternatively, other
laboratory tests have succeeded genetically modifying the fungus Fusarium
sporotrichioides, to prepare the dye and antioxidant lycopene (of color red) from to
material of corn fiber, a residue of energy industry of ethanol. Following this line,
the -carotene of the fungus Blakeslea trispora, have been positioned at the peak
of the food industry; thus at introduce ionones, amides, imides, lactams,
hydrazides, or substituted pyridines and in particular succinimide and
isonicotinoylhidrazine have produced an increase of two or three times in the
amount of -carotene present in the culture medium; of this mode the
microorganism strain consortium of Blakeslea trispora have synthesized 850 mg/g
of dry weight of the carotenes.

Other pigments have been applied with sucess to the use of the food industry, as
in the case of the arpink-red colorant of Penicillium oxalicum, the pigments derived
of the Monascus purpureus (ankaflavin/monascine, of yellow color,
rubropunctatin/monascorubrine, of orange color, the rubropunctamine
monascorubramine, of a purple tonality; the pigment canthaxanthin in the
cyanobacterium Anabaena variabilis, and the riboflavin of Ashbya gossypi, a
overproducer of this pigment, in amounts superior to 1 g/L.

The success of any pigment derived of the microbial fermentation depends of his
market acceptance, of the approval from regulating, and the size of the capital
investment necessary, to bring this product to market. In terms of laboratory, the
work has been focused on improving the parameters of culture, and the respective
physico-chemical conditions (temperature, pH, aeration, C:N relation); variables as
the solubilization, stability and the extraction of pigments in solution, have been
parameters to measure the high fermentative quality of the colorant. Recently,
genetic engineering has been used through which it reached, produce mutants with
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changes in the ability to produce pigments, as in the case of Escherichia coli,

transformed and conditioned to the synthesis of carotenoids.

Keywords: Astaxanthin, -carotene, lycopene, Monascus purpureus, Phaffia

rhodozyma, Blakeslea trispora, fermentative quality.
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Introduccin

Los pigmentos son compuestos qumicos que entregan color a otros materiales
debido al efecto ptico de la refraccin de la luz solar. El color es una cualidad
organolptica de los alimentos que se aprecia mediante del sentido fsico de la
vista; es considerado como un factor psicolgico y un criterio para elegir un
determinado alimento; e incluso en los productos de origen vegetal, el color se
relaciona con la posibilidad de distinguir su grado de maduracin y su idoneidad
(Bello-Gutirrez, 2000). Debido a esta caracterstica, los pigmentos son
importantes en la industria alimentaria, ya sea como aditivos, o intensificadores de
color. Un aditivo es una sustancia que se aade de manera intencional a los
alimentos, por lo general en pequea cantidad, para mejorar su apariencia, sabor,
color, y preservacin, de acuerdo al Codex Alimentarius de 1988. Otra definicin
es que los aditivos son sustancias que se aaden a los alimentos y bebidas con la
intensin de proporcionar o intensificar el aroma, color o sabor, prevenir cambios
indeseables o alterar en general su aspecto fsico.

Desde hace tiempo se ha investigado la elaboracin de pigmentos de origen

natural, recogiendo, caracterizando y purificando muchos compuestos de este tipo
(Durn, y col., 2002); los cuales se han obtenido a partir de plantas y
microorganismos principalmente; aunque en la actualidad los procesos
biotecnolgicos, parecen ser una mejor alternativa para la obtencin de estos
compuestos. El empleo de microorganismos, especialmente los hongos
filamentosos y varios gneros bacterianos, ha trado consigo la generacin de
nuevas tecnologas, y nuevos pigmentos; as mismo, la obtencin de estos
productos, puede reemplazar en gran medida el uso de colorantes qumicos o
sintticos. En referencia a esta perspectiva, la bsqueda de nuevos pigmentos
naturales apunta a retirar los colorantes sintticos, debido a su considerable
toxicidad, y sustituirlos por colorantes naturales (Gibaja, 1998). Las lista de
colorantes sintticos autorizados es cada vez ms corta, y su fabricacin objeto de
un control muy estricto por parte de los organismos gubernamentales, debido a
esto, la tecnologa de colorantes naturales se desarrolla a ritmo acelerado (Muller
y Riel, 1990). Aqu juega un rol importante revisar y reunir los ltimos avances en
esta temtica, destacando y estudiando los microbios (bacterias y hongos) con un
alto potencial biotecnolgico en la industria de generacin de pigmentos; junto a
ello, referir la problemtica, orientada a la optimizacin de los bioprocesos y las
variables que afectan el crecimiento y la proliferacin de la biomasa implicada.

En los microrganismos, algunos pigmentos se encuentran difusos, mientras otros

estn localizados en cromforos; unos son hidrosolubles y pasan al medio,
colorendolo (exopigmentos); otros en cambio, son insolubles en agua y
permanecen como inclusiones en el cuerpo microbiano (endopigmentos), siendo
preciso extraerlos mediante disolventes especficos (ter, cloroformo, benceno,
cidos o bases) o bien por lisis celular (Abbayes y col. 1989; Caneva, Nugari y
Salvadori, 2000).
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Desarrollo y Marco terico

Las publicaciones cientficas relativas a la generacin de pigmentos como

metabolitos secundarios se han enfocado esencialmente al estudio de los hongos
filamentosos. Estos, han sido estudiados por su actividad metablica, midiendo su
cantidad y capacidad de produccin extracelular de pigmentos, de tal forma de
facilitar los procesos fermentativos, pero su mayor nfasis recae en los altos
rendimientos de sntesis obtenidos (Carvalho y col., 2003). Los hongos
pertenecientes al gnero Monascus sp. han sido estudiados por largo tiempo y
diversos autores refieren a estos hongos, como potenciales productores de
pigmentos naturales (Blanc y col., 1994; Carvalho y col., 2003). Algunas especies
de Monascus sp. producen pigmentos hidrosolubles y que difunden por todo el
medio de cultivo (exopigmentos) con tonalidades rojas a amarillas; los cuales han
sido aplicados exitosamente como ingredientes alimenticios (Blanc y col., 2001). El
pigmento rojo se ha aplicado en el koji, salsa de soya, tofu, cuajada de frijol, vinos
rojos, carnes (salchichas, y jamones), productos marinos (como el surimi y la
pasta de pescado), salsa de tomate, helados, dulces y mermeladas (Socaciu,
2008).

Monascus sp. no es el nico microorganismo con potencial de producir colorantes,

otros microorganismos como los pertenecientes al gnero Paecilomyces sp.
tambin producen pigmentos en tonalidades rojas, amarillas y violetas; en
cantidades de hasta 4.73 g/L-1 (Cho y col., 2002). Siguiendo esta lgica, los
hongos pertenecientes a los gneros Penicillium sp. y Aspergillus sp. tambin han
sido estudiados como potenciales productores de pigmentos naturales (Engstrom
y col., 1982; Larsen y Breinholt, 1999; Suhr y col., 2002). Conjuntamente se han
reportado el uso de microorganismos tales como bacterias, levaduras y
actinomicetos, en la produccin de pigmentos; tal cual ha sido el caso de Phaffia
rhodozyma (Fontana y col., 1996; Lim y col., 2002). Esta levadura se ha utilizado
para la produccin de un pigmento rojo con mucho uso en la industria alimentaria,
la astaxantina, con nombre comercial AstaXin, comercializada por Igene
Biotechnology Inc., Columbia, Maryland; astaxanthin of Mera Pharmaceuticals Inc.
(Wani y col., 2004). Otros microorganismos han logrado ser modificados
genticamente para poder producir pigmentos, tal es el caso de Escherichia coli,
trasformada y condicionada para la sntesis de carotenoides. (Yokohama y col.,
1998).

Otros estudios han caracterizado los pigmentos tpicos de algunas especies:

piocianina en Pseudomonas aeruginosa; la violacena en Chromobacterium
violaceum, rubixantina, colorante propio de Staphylococcus aureus; prodigionina
de Serratia marcescens; el leproteno en Mycobacterium phlei; la rodoviolacena y
la flavocodina en los Rhodovibrio; la espiriloxantina de los Thyocystis; la
sarcinaxantina en las Sarcinas; y las bacteriorruberinas y en Bacterium
halobium (Abbayes et a. 1989). Otros pigmentos microbianos se han descrito;
como las benzoquinonas que son metabolitos sintetizados por los hongos como la
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espinulosina (de color prpura-negro y presente en Penicillium spinolosum Thom

y Aspergillus fumigatus, el cido poliprico (de color pardo violceo y aislado con
un 20 % de rendimiento del hongo Polyporus rutilans, la fumagantina (de color
pardo-castao producido por Penicillium spinolosum en presencia de fenolasas y
Aspergillus fumigatus (Gibaja, 1998).

En trminos de mercado, se han explotado con nfasis los pigmentos de

Monascus, la astaxantina de Xanthophyllomyces dendrorhous, el pigmento rojo-
rosa de Penicillium oxalicum, la riboflavina de Ashbya gossypii, y el -caroteno de
Blakeslea trispora (Dufoss, 2006).

A la actualidad slo la astaxantina extrada del alga verde Haematococcus

pluvialis y del hongo levaduriforme Xanthophyllomyces dendrorhous puede
competir con la astaxantina sinttica, ya que producen 30 y 4 mg de astaxantina
por gramo de peso seco, respectivamente, siendo las de mayor rendimiento
encontradas.

Monascus, se usa con frecuencia en la comida oriental, esencialmente al sur de

China, Japn, y al sureste del continente Asitico. En la actualidad un nmero
superior a las 50 patentes han sido emitidas en Japn, Estados Unidos, Francia y
Alemania, referentes al uso de pigmentos de Monascus en la comida. El consumo
anual de estos pigmentos de Monascus en Japn, moviliz ms de 100 toneladas
en 1981 a 600 toneladas a finales de los aos noventa, cantidad que fue valorada
en $1.5 millones. As mismo, se ha descrito la aplicacin del pigmento en cuanto a
la coloracin de las carnes procesadas (salchichas y jamn), productos marinos
como pasta de pescado, surimi y salsa de tomate.

Otros pigmentos de inters son la ankaflavina y la monascina (de color amarillo),

la rubropunctatina y la monascorubrina (de coloracin naranja), y la
rubropunctamina y monascorubramina, que son de tonalidades prpuras; todo
ellos presentes en Monascus purpureus. Si bien estos pigmentos presentan un
potencial biotecnolgico, exhiben ciertas problemticas: poseen una baja
solubilidad en agua, son sensibles al calor, inestables a pH entre 2-10, y se
desvanecen por accin de la luz. Un nmero de mtodos han sido patentados con
el fin de hacer que los pigmentos sean solubles en agua. En monascorubrina o
rubropunctatina, se sustituye el oxgeno por el nitrgeno del grupo amino de
diversos compuestos tales como aminocidos, pptidos y protenas, cambiando el
color de naranja a prpura. La estabilidad de los pigmentos se ve afectada por la
acidez, la temperatura, la luz, el oxgeno, la actividad y el tiempo de agua. Se
demostr que estos pigmentos aadidos a las salchichas o pat enlatado se
mantuvieron estables tras un almacenamiento de 3 meses a 4C, mientras que su
estabilidad vari desde 92 hasta 98%. Por lo tanto, los principales patentes se han
centrado en la solubilizacin, la estabilidad y la extraccin de pigmentos en
solucin. Los pigmentos pueden reaccionar fcilmente con grupos compuestos de
amino en el medio, tales como protenas, aminocidos, o cidos nucleicos para
formar pigmentos solubles en agua.
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El rojo-rosa (Arpink red) de Penicillium oxalicum, otro pigmento de importancia

comercial, ha tenido continuas patentes por parte de Ascolor Biotech s.r.o. en la
Repblica Checa, en las cuales se resea a una nueva cepa de dicho hongo con
propiedades de sntesis de un pigmento rojo que se puede aplicar en la industria
alimentaria. La cepa de Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, como fue
llamada, se aisl de la tierra, y genera un cromforo del tipo antraquinona. Su
cultivo en caldo lquido requiere de la aplicacin de carbohidratos (como sacarosa,
y melaza), nitrgeno (mediante el uso de extracto de maz, autolisado o extracto
de levadura), adems de sulfato de zinc y sulfato de magnesio. Las condiciones
ptimas para la ejecucin de la produccin microbiolgica fueron determinadas, y
corresponden a un valor de pH 5.6-6.2, y una temperatura de 27 a 29C. Al
segundo da de incubacin un colorante rojo se libera al caldo, el que aumenta en
concentracin de hasta 1.5 a 2.0 g/L de caldo despus de 3-4 das. Luego de
completarse la biosntesis del pigmento rojo, el caldo se filtra o centrifuga para la
separacin de la biomasa. El volumen obtenido se acidifica a pH 3.0-2.5 para
precipitar el colorante. Posteriormente, este precipitado se disuelve en alcohol
etlico y se filtra. Luego de la eliminacin del alcohol, se obtiene el colorante en la
forma cristalina, es decir, como un polvo de color rojo oscuro. El colorante da un
color rojo frambuesa en solucin acuosa, y estable a pH superior a 3.5. Las
soluciones neutras son estables incluso despus de 30 minutos de ebullicin y la
tonalidad del color no cambia en relacin con el pH.

Otro pigmento de aplicacin industrial, la riboflavina (vitamina B2) de Ashbya

gossypii tiene variedad de aplicaciones alimentarias como colorante amarillo. Las
aplicaciones incluyen bebidas, postres instantneos, helados, y otros productos.
La riboflavina tiene una afinidad especfica como base para la fabricacin de
productos cereales, pero su uso en estas aplicaciones est limitado debido a su
ligero olor y sabor amargo. Existen numerosos microorganismos que producen la
riboflavina por fermentacin. Esta podra clasificarse en tres categoras de
microrganismos: superproductores dbiles (100 mg/L o menos, como Clostridium
acetobutylicum), superproductores moderados (hasta 600 mg/L, en levaduras tales
como Candida guilliermundii o Debaryomyces subglobosus), y superproductores
fuertes (ms de 1 g/L, como los hongos Eremothecium ashbyii y Ashbya gossypi).

Otro pigmento de inters, el -caroteno de Mucor circinelloides tipo salvaje es de

color amarillo. Las caractersticas bsicas de la va de carotenoides, incluyendo la
fotocarotenognesis, son similares en Phycomyces y Mucor. Mucor Circinelloides
responde a la luz azul, activando la biosntesis de este pigmento. Cepas de tipo
salvaje cultivadas en la oscuridad contienen cantidades mnimas de -caroteno,
debido a los bajos niveles de transcripcin de los genes estructurales para
carotenognesis. Cuando se expone a un pulso de luz, el nivel de transcripcin de
estos genes aumenta fuertemente, lo que conduce a la formacin de altas
concentraciones de pigmento. Nuevas investigaciones se centran ahora en
mutantes semejantes a las levaduras (M. circinelloides es un hongo dimrfico que
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crece en forma de levadura o en forma de micelio) y que podran ser tiles en una
produccin biotecnolgica.

El -caroteno tambin puede ser extrado de Phycomyces blakesleeanus. El

contenido de caroteno de cepas salvajes cultivadas bajo condiciones estndar es
reducido, de aproximadamente 0.05 mg/g de masa seca, sin embargo, ciertos
mutantes acumulan hasta 10 mg. En cuanto a Blakeslea trispora, la estimulacin
sexual de la biosntesis de carotenos sigue siendo esencial para aumentar los
rendimientos hasta 35 mg/g. Las mejores cepas de Phycomyces hasta ahora
probadas, presentan su potencial carotenognico completo sobre sustratos slidos
o en medio lquido. Cerd-Olmedo hace hincapi en que su pariente, Blakeslea
trispora, es ms apropiado para la produccin en fermentadores habituales.

Jones y col. modificaron genticamente el hongo Fusarium sporotrichioides para la

fabricacin del colorante y antioxidante licopeno (de color rojo) a partir del material
de fibra de maz, correspondientes a los restos de la produccin de etanol. La fibra
de maz es abundante (la industria del etanol en EE.UU. produce cuatro millones
de toneladas anuales) y cuesta unos cinco centavos de dlar por libra. Se han
propuestos tambin el uso de granos secos de destilera con solubles (DDGS)
como sustrato. Fuertes secuencias promotoras y de trmino se han aadido a los
genes de biosntesis de carotenoides de la bacteria Erwinia uredovora, y los genes
quimricos o recombinantes se han ensamblado e introducido en el hongo
expresndose a niveles comparables a los observados para los genes
biosintticos endgenos. Cultivos en frascos de laboratorio produjeron 0.5 mg
(licopeno)/g de masa seca dentro de 6 das y tal produccin segn un estudio se
incrementar en los prximos aos.

La astaxantina de Xanthophyllomyces dendrorhous, antes conocida como Phaffia

rhodozyma, se pretende agregar a la dieta de salmnidos para impartirle la
coloracin rojo-anaranjado distintivo que lo hace atractivo para los consumidores
en el mercado. Entre los pocos microorganismos productores de astaxantina,
Xanthophyllomyces dendrorhous es uno de los mejores candidatos para la
produccin comercial. Para el crecimiento del cultivo se deben suministrar fuentes
complejas de nutrientes, tales como extractos de peptona, malta y levadura; as
tambin como subproductos de la agricultura (melaza), hidrolizados enzimticos
de madera, maz, bagazo de caa de azcar, y jugo de uva. La principal
desventaja de su uso radica en que estos sustratos son variables en composicin.
Palagyi y col. ensayaron once cepas por su capacidad para utilizar 99 compuestos
como nica fuente de carbono. En un segundo estudio, la biosntesis de
carotenoides se increment a bajos niveles de amonio o fosfato y se estimul por
citrato. Las condiciones ptimas de estimulacin ms altas de astaxantina fueron:
temperatura de 19.7 C, una concentracin de carbono de 11.25 g/L, pH 6.0, 5%
de inculo, y concentracin de nitrgeno de 0.5 g/L. En estas condiciones la
astaxantina contenida fue de 8.1 mg/L.
 P g i n a | 10

Por otro lado, las levaduras del gnero Rhodotorula sintetizan pigmentos
carotenoides. La mayor parte de la investigacin se centra en la especie
Rhodotorula glutinis, sin embargo, algunos artculos tratan con otras especies
como R. gracilis, R. rubra, y R. graminis. Los principales compuestos producidos
por estas levaduras rojas son tolueno y torularhodin, con una mnima cantidad de
-caroteno; empero se han hecho esfuerzos para aumentarla a travs de la mejora
de cepas, la mutacin, la optimizacin del medio y la manipulacin de las
condiciones de cultivo (temperatura, pH, aireacin, relacin C:N ) .

Otro pigmento, la zeaxantina de color amarillo se puede emplear, como alimento

para aves de corral con objeto de fortalecer la coloracin amarilla de la piel de
animales de este tipo o para acentuar el color de la yema de los huevos. Cultivos
de Flavobacterium sp. en un medio que contiene glucosa o sacarosa, aminocidos
tales como metionina, cistina o cistena, iones metlicos piridoxina y bivalentes
seleccionados de entre el grupo constituido por Fe +2, Co+2, Mo+2 o Mn+2 fueron
capaces de producir hasta 190 mg de zeaxantina/L, con una concentracin celular
especfica de 16 mg/g de masa seca celular.

El pigmento carotenoide cantaxantina se ha utilizado por muchos aos con el fin

de impartir el color de la carne deseada en los salmnidos de cra. Bradyrhizobium
sp., ha sido descrito como productor de cantaxantina y su grupo de genes de
carotenoides fue completamente secuenciado. Este ceto-carotenoide tambin se
encontr en otro microorganismo, una bacteria halfita extrema del gnero
Halobacterium belongingo.

En comparacin con la gran cantidad de investigacin de Xanthophyllomyces

dendrorhous, la produccin de astaxantina utilizando Agrobacterium aurantiacum
ha sido investigado en menor cantidad. La primera descripcin de la biosntesis de
astaxantina en esta bacteria fue publicada por Yokoyama y col. en 1994. Los
autores describieron la ruta biosinttica, la influencia de las condiciones de
crecimiento en la produccin de carotenoides y la ocurrencia de glucsido
astaxantina en dos artculos siguientes. Como los carotenoides representan un
grupo de pigmentos que han obtenido un creciente inters comercial en los ltimos
aos, numerosas proyecciones se han realizado con el objeto de caracterizar
nuevas fuentes biolgicas de astaxantina, y as se han aislados positivamente de
Paracoccus carotinifaciens y Halobacterium salinarium. Tres interesantes
resultados se informaron en el ltimo documento: (i) concentraciones extremas de
NaCl (aproximadamente 20%) se utilizaron en el medio de cultivo para evitar la
contaminacin con otros organismos (por lo que no es necesaria la esterilizacin);
(ii) las concentraciones de NaCl de menos de 15% inducen la lisis bacteriana, por
lo que no se necesita ninguna tcnica especial de rotura celular; y (iii) los
pigmentos pueden ser extrados directamente con aceite de girasol en lugar de
disolventes orgnicos, eliminando as posibles reacciones txicas debido al
arrastre de concentraciones de acetona o hexano y facilitando por lo tanto la
asimilacin del pigmento por los animales.
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Hallazgos

Los pigmentos carotenoides, de alta valor comercial, estn presentes en algas,

hongos y bacterias (Goodwin, 1980). En los hongos destaca el licopeno en
Blakeslea trispora, y la astaxantina en la levadura Phaffia rhodozyma; en las algas
verdes se han identificado la lutena en Spongiococcum excentricum y Chlorella
pyrenoidosa y la astaxantina en Haematococcus pluvialis. En bacterias no
fotosintticas destacan el licopeno en Streptomyces chrestomyceticus subesp.
rubescens, la zeaxantina en Flavobacterium sp., la cantaxantina en Brevibacterum
KY-4313 y la astaxantina en Brevbacterum sp. Entre las bacterias fotosintticas se
ha evidenciado la presencia de astaxantina en Rhodococcus maris, mientras que
entre las cianobacterias se ha encontrado cantaxantina en Anabaena variabilis. El
gnero Monascus, encierra tres especies principales (M. pilosus, M. purpureus y M.
ruber) perteneciente a la familia Monascaceae y a la clase Ascomyceta (Pitt, 1997),
cuya caracterstica ms notoria es la capacidad de producir metabolitos secundarios
de estructura policetdica, (Juszlov, 1996), algunos de ellos con una intensa
pigmentacin de color amarillo, naranja o roja. Las dos primeras especies son ms
importantes para la produccin de pigmentos, mientras que M. ruber se ha asociado
a la descomposicin de varios alimentos. Entre los pigmentos producidos
por Monascus, los rojos son considerados los de mayor importancia industrial, ya
que estos pueden ser utilizados como sustitutos de los nitritos en los productos
crnicos y de los colores sintticos tales como eritrosina (FD y C, rojo n3) (Johns y
Stuart, 1991; Fabre, 1993). Pases orientales como Japn han hecho un amplio uso
de estos pigmentos desde hace dcadas en una primera instancia, como
colorantes amarillos solubles en agua aplicados a caramelos (Watanabe, 1997), o
bien como se mencion anteriormente como pigmento rojo para el vino rojo de arroz.
Como es el caso de otros hongos, las diferentes cepas de Monascus producen
tambin micotoxinas. En este caso, la micotoxina producida es citrinina, una
sustancia nefrotxica que tambin presenta propiedades antibiticas, por lo tanto en
trminos industriales se ha seleccionado las cepas que producen grandes
cantidades de biopigmentos pero baja o nula cantidad de citrinina. Igualmente se ha
intentado sobreexpresar metabolitos propios del gnero como son monacolinas K y
L, un conjunto de anti-hiperlipidmicos (Ma, 2000). La aplicacin de xantofilas se ha
empleado exitosamente en la dieta de aves productivas (avicultura), ya que estas
son absorbidas a niveles apreciables y transportadas a la yema de huevo y masa
muscular (Mateas, 1991). En trminos prcticos, su dieta se ha suplementado con
distintos pigmentos para favorecer la coloracin amarillo-naranja de la yema de
huevo y en la piel de pollos y gallinas (Marusich y Bauernfeind, 1981). Un color
ptimo de la yema se consigue por adicin de un pigmento base amarillo (como
lutena, etil ster del cido -apo-w-carotenoico) y uno naranja-rojo, preferentemente
un cetocarotenoide (tales como astaxantina, cantaxantina, y/o zeaxantina). A su vez,
en salmnidos, la absorcin de los carotenoides ocurre a nivel del ploro (Torrisen,
1986), de donde pasa a la piel y al msculo, y como ocurre en el caso anterior se ha
asegurado la ingesta continua de los pigmentos para asegurar la llegada al perodo
de fertilidad reproductiva.
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Resultados.

Gnero Monascus

A. Condiciones fermentativas en Monascus

Medios de cultivo comunes son el agar papa dextrosa (PDA) y agar extracto de
malta (MEA) (ATCC, 2004). El crecimiento se hace posible entre 15-18C (mnimo)
y a 45C (mximo) (Pitt, 1997), pero la sntesis de pigmentos vara mucho entre
especies y depende adems de las condiciones de cultivo. El rango de T ptimo
para el crecimiento de Monascus es de 28-32C, aunque esta temperatura vara
dependiendo de la cepa entre 25 y 37C (Lin, 1991). El crecimiento se ha
observado de 2.5 a 8.0, con un rango ideal de 4.0-7.0 (Yongsmith, 1993). Durante
el cultivo de Monascus, se produce CO2, etanol y acetato.

Cuando se us SSF de arroz, Rosenblitt y col. (2000) evidenciaron que a las 240
horas finales de fermentacin, el balance de carbono fue el siguiente: 23% del
carbono se convierte en biomasa, 35% en CO2, 15% en etanol, 1% en cido
actico y un 17% permaneci sin usar. En condiciones ideales en fermentacin de
columna se obtuvo una velocidad mxima de crecimiento especfico de 0.039 h -1 y
una velocidad de produccin especfica de pigmento de 27.5 UA/g de biomasa por
hora, a 140 horas con 500 UA/g fermentado seco despus de 12 das. La
velocidad especfica de formacin de producto en el biorreactor fue de 4.7 UA/gh,
a un tiempo de 240 horas de fermentacin, y la produccin total de pigmento fue
de 108.7 UA/g fermentado seco despus de 15 das (de Carvalho, y col., 2006).
Mismos autores, en 2007 concluyeron que el arroz es el mejor sustrato para el
cultivo en SSF. Empero, algunos de los otros sustratos utilizados tambin
presentaron una buena produccin de pigmentos, especialmente el maz, el trigo y
la yuca. El bagazo de Yuca dio un bajo rendimiento de pigmento, pero es un
residuo agroindustrial cuyo bajo precio podra compensar su bajo rendimiento. Sin
embargo, la produccin eficiente de pigmento con este sustrato requiere que se
agreguen otros nutrientes al medio de cultivo. En este estudio, el tiempo de
fermentacin ptima para SSF con bagazo de yuca fue de 10-11 das. La
produccin de pigmentos de color amarillo fue superior a la de los pigmentos rojos,
pero la relacin rojo/amarillo (500Abs/400Abs) creci durante el curso del
proceso. La comparacin de varios disolventes para la extraccin exhibi que el
metanol era el mejor disolvente, seguido cercanamente por el DMSO y el
etanol. Los resultados tambin indicaron que una mezcla de etanol-agua con
Etanol al 60% (p/p) era ms eficaz que otras concentraciones de etanol.

Por otro lado, algunos pigmentos producidos por Monascus sp. son intracelulares
e insolubles en agua, pero de acuerdo a las condiciones de crecimiento tales
como la fuente de nitrgeno, el pH y la aireacin pueden resultar en la formacin
de pigmentos extracelulares y solubles en agua (Hayyay et al., 1998).
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La glucosa es el sustrato principal, pero adems pueden usarse etanol (Hamdi y

col., 1997), glicerina cruda, y residuos agrcolas. Pigmentos rojos se han obtenido
del crecimiento del hongo en medio slido con yuca (Babitha; Soccol; y Pandey,
2006), jarabe de maz (Hamano; y Kilikian, 2006), harina de trigo (Domnguez-
Espinosa y Webb, 2003), harina de camarn y con exoesqueleto de cangrejo
(Wang y col., 2002), jugo de pera (Hamdi; Blanc; y Goma, 1996), y los residuos de
la uva (Silveira; Daroit; y Brandelli, 2008). Por otro lado, la mayor sntesis de
colorantes rojos obtenidos usando glicerina y glucosa como sustratos fue de 8.28
UA (510nm) con una productividad de 0.13 UA (510nm) /h-1 y 2.15 g/L de
biomasa. La produccin de pigmentos se asocia al crecimiento; la fuente de
nitrgeno y el pH tienen grandes efectos que favorecen la produccin de
pigmentos rojos y el crecimiento de Monascus sp. En estudios anteriores
(Meinicke y col., 2012), se obtuvo un mxima de 7.38 UA de pigmentos rojos en
matraces usando glicerol. Pastrana y col. (1995) estudiaron la produccin de
pigmentos en un biorreactor de 20 litros usando glucosa como sustrato, y
obtuvieron 9.7 UA de pigmento rojo. Las condiciones ptimas de cultivo en un
biorreactor de 3 litros obtenido por Lee y col. (2001) fueron: 5,9 g/L-1 de biomasa y
13.37 UA de pigmentos rojos, en 80 horas de cultivo. Orozco y Kilikian (2008)
estudiaron los parmetros cinticos en un biorreactor de 4 litros; obtuvieron 5.2-
10.4 g/L-1 de biomasa y 11.3 UA de pigmentos rojos al usar M. purpureus y
glucosa como sustrato; la mayor produccin se obtuvo a pH 6.5-8.5. Otros autores
refieren que a pH 5.45-6.23 se favorece la liberacin y produccin de pigmentos
rojos (Chen, y Johns, 1993; Blanc y col., 1995). De Carbalho, y col. (2006),
lograron una disminucin del pH en la etapa inicial del cultivo, seguido de un ligero
aumento constante en la siguiente etapa. Mismo comportamiento detectaron Teng
y Feldheim (2001) en cultivos con M. purpureus, y Domnguez y Webb (2003)
tambin observaron una disminucin en el pH al comienzo del cultivo. Cuando los
pigmentos se excretaron al medio, el pH se mantuvo igual o ligeramente mayor
que su nivel original (6-7).

La tasa de crecimiento especfico obtenido por Hamdi, Blanc y Goma (1996) fue
de 0.1 y 0.05 h-1, y la tasa de produccin especfica de pigmentos rojos fue de
0.08 y 0.2 UA/g-1. La tasa de produccin especfica de pigmentos aument
continuamente con la formacin de pigmento rojo y lleg a 7.85 al final del cultivo.
En un biorreactor de 20 litros, Pastrana y col. (1995) observaron un crecimiento
mximo especfico de 0.04 h-1 y 0.08 UA/g h-1 de tasa mxima de produccin
especfica de pigmentos rojos en un cultivo que dur 180 horas
utilizando Monascus ruber y glucosa como sustrato. Las cuatro cepas de
Monascus utilizadas en dicho trabajo se compararon con respecto a la velocidad
de crecimiento en PDA, medido a travs del crecimiento radial y en relacin a la
sntesis de pigmento rojo usando como fuente de SSF, arroz y bagazo de yuca,
despus de 7 y 11 das de fermentacin, respectivamente. El anlisis mostr que
las cepas 1991, 2897 y LPB 31 se desarrollaron de una manera comparable, pero
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las colonias ms grandes fueron las de LPB 31, mientras que la cepa 3802
presentaba colonias un 30% ms pequeas. La velocidad de crecimiento, mostr
que la cepa aislada, LPB 31, presentaba una velocidad de crecimiento similar a las
cepas NRRL 2897 y NRRL 1991, y superior a la cepa CCT 3802 (Tabla 1).

Se utiliz el bagazo de yuca porque es un sustrato tradicional para SSF en LPB,

mientras que el arroz es el sustrato tradicional para la produccin de pigmentos en
Monascus. Al comparar las caractersticas de las cepas probadas con otros
evaluados por Miyashira (2003), tambin en el uso de arroz como SSF, es
evidente que la cepa aislada, LPB 31, es superior a otras cepas ensayadas, y que
su produccin de citrinina, fue la ms baja de todas las cepas.

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos

Varios estudios refieren una baja o nula toxicidad de los pigmentos de Monascus
(Lin, 1991a). Sin embargo, se ha demostrado la existencia de la toxina fngica
citrinina (Blanc et al., 1995a), pero no en todas las cepas. La fuente de nitrgeno
utilizada interfiere en la produccin de citrinina; para la misma cepa de M. ruber en
un medio sinttico con etanol, la produccin de citrinina vari de 0 mg/L usando la
metionina como fuente de nitrgeno, a 100 mg/L usando nitrato de amonio como
fuente de nitrgeno (Blanc, 1995).

Por otro lado, estudios sobre la toxicidad de los extractos mostraron que hubo de
hecho una actividad antibitica para Monascus, especialmente los pigmentos
naranjas y, en menor grado, los rojos (Martnkov, 1995).

C. Estabilidad de los pigmentos.

Segn Lin y Demain (1992), estos pigmentos son estables a una amplia gama de
pH. Fabre (1993), demostr que salsas y pats con pigmento rojo
de Monascus muestran un color residual de 92-98% luego de tres meses a 4C, y
con buena aceptacin sensorial. Sin embargo, estos pigmentos son inestables a la
luz (slo se mantiene un 20% del color residual despus de 50 das) y frente al
calor (45% del color residual despus de 2 horas a 100C). Estos pigmentos son
ms estables a pH bsico o neutro (Fabre 1993, Lee 2000). Carvalho, y col. (2005)
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midieron la absorbancia residual relativa de pigmentos a distinto pH y T; la

absorbancia disminuy en el tiempo, y dicho patrn se reforz a temperaturas
crecientes (degradacin trmica), lo que supone un problema en alimentos que
pasan por un tratamiento calorfico (Fig. 2). A pH bajo el color disminuy ms
rpido (Fig. 3), lo que supone un problema para su aplicacin en alimentos cidos,
(ej.: leches fermentadas); esto ltimo debido a la ruptura de un enlace ster en
rubropunctamina o monascorubramina. En resumen, los resultados indican que
existe una disminucin importante del color a todos los pH, a temperaturas
superiores a 60C, y que en pHs ms altos (cerca de la neutralidad), el pigmento
es ms estable. Estos resultados estn de acuerdo con lo sealado por Fabre
(1993) y Lee (2000).
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Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma)

A. Condiciones fermentativas en X. dendrorhous (Phaffia rhodozyma)

Medios de cultivo de bajo costo utilizan: residuos de alfalfa (Okagbue y Lewis,

1984), melazas de caa de azcar (Haard, 1988; Fontana y col., 1996),
hidrolizados de turba (Martin y col., 1993; Vazquez y Martin, 1998), zumo de uva
(Meyer y du Preez, 1994a), subproductos de la maceracin hmeda del maz
(Hayman y col., 1995), jugo de caa de azcar (Florencio y col.,1998), hidrolizados
hemicelulsicos de eucalipto (Parajo y col., 1998b), hidrolizados de Yucca fillifera
(Ramrez y col., 2000), leche de coco (Domnguez-Bocanegra y Torres-Muoz,
2004) o residuos de mostaza (Tinoi y col., 2006) (Tab.3).

La astaxantina (Fig. 5) se produce en la fase exponencial de crecimiento celular y

la mayor parte se acumula en la fase estacionaria. Para un crecimiento ptimo, el
pH y la temperatura deben mantenerse entre 5.0 y 22C, respectivamente. P.
rhodozyma, genera 30-800 ppm de astaxantina libre/kg levadura seca (Markovits,
1991), dependiendo del medio de cultivo.

Aumentan la sntetis de carotenoides: la valina (Meyer y col., 1993), el extracto de

levadura (Fang y Cheng, 1993), el cido actico (Meyer y duPreez, 1993), el cido
mevalnico (Calo y col., 1995) y el etanol (Gu y col., 1997). Precursores de la
sntesis de astaxantina, como el licopeno, aadidos al medio de cultivo estimulan
la produccin de astaxantina. El uso de algunos de estos compuestos, como el
mevalonato (precursor de los isoprenoides), aumenta considerablemente la
produccin de astaxantina (hasta cuatro veces), pero es demasiado caro para
usarlo en fermentaciones a gran escala (Calo y col., 1995). Sin embargo,
compuestos como el etanol, constituyen una forma simple y econmica de
incrementar la produccin de astaxantina en procesos industriales (Gu y col.,
1997). Un incremento en la produccin de carotenoides se observ con un
descenso en la concentracin de nitrgeno en el medio (Meyer y du Preez, 1994b;
Yamane y col., 1997; Flores-Cotera y col, 2001). La disminucin en la
concentracin de nitrgeno genera una reduccin en la sntesis proteica, lo que
hace que aumenten los niveles de carbono, ATP y NADPH en la clula; para
adecuar estos niveles al estado normal, se produce un aumento en la sntesis de
cidos grasos y carotenoides (Flores-Cotera y col., 2001).

En el uso de caldo nutritivo de extracto de malta y levadura, se reportan 487 ppm

(Martin y Sivagurunathan, 1999); pero con cultivos mutantes, se obtienen valores
de 3000 ppm o superiores. An y col. reportaron el aislamiento de dos mutantes
que producan 800-900 y 900-1300 g. de astaxantina/g de clulas. Meyer y col.,
luego de un tratamiento con nitrosoguanidina (NTG), obtuvieron una mutante de
Phaffia que sintetizaba 1688 g/g de biomasa, contra los 330 que produca la cepa
silvestre, si bien disminuy el crecimiento celular y la mxima velocidad especfica
de crecimiento, aument la produccin de pigmento. El uso de manitol y succinato
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como fuentes de carbono, aument igualmente la tasa de generacin de 1926 a

1973 g/g de biomasa respectivamente. Fang y Cheng, estudiaron distintas cepas
con NTG, usando el medio agar YM con -ionona. Una cepa mutante (NCHFU-FS
301), tuvo una produccin de 1515.63 g/g de clulas, mientras que la cepa
silvestre CBS-6398 slo obtuvo una produccin de 565.08 g/g de clulas.
Determinaron adems que con glucosa como fuente de carbono se tuvo una
produccin de 7809.3 g/L de astaxantina, y que el extracto de levadura fue la
mejor fuente de nitrgeno al producir un valor de pigmento de 8637.6 g/L.

Inhiben y/o reducen la produccin del carotenoide: la luz, la saponina, las

condiciones semianaerbicas y las concentraciones de glucosa superiores a 1.5 %
(p/v); esto, debido a que la sntesis de carotenoides ocurre una vez que la glucosa
del medio se ha agotado, por lo que concentraciones elevadas de este
carbohidrato, si bien proporcionan altas tasas de crecimiento, provocan un
descenso en la sntesis de carotenoides.

Inconvenientes en la obtencin son: i) la levadura tarda 7 das en alcanzar la fase

estacionaria de crecimiento; ii) la astaxantina es producida intracelularmente,
asociada fuertemente a membranas celulares, de modo que los animales
alimentados con clulas intactas del hongo son incapaces de asimilar el pigmento
debido a que no pueden digerir la pared de la levadura (Johnson y col., 1978).
Para que la astaxantina sea asimilada por el animal es necesario aadir la
levadura lisada o bien obtener pigmento como extracto. Para lo primero, se han
usado enzimas lticas de Bacillus circulans WL-12 (Johnson y col., 1978), o bien
provenientes de cultivo mixto (Johnson y col., 1978); problemticas de esta cepa
es el estrecho rango de pH al que crece, lo cual implica la necesidad de reajustar
el pH del medio. El uso de hongos hiperparsitos (ej: Trichoderma harzianum)
evita el uso de dichas enzimas lticas; iii) La concentracin de pigmento presente
en extractos de P. rhodozyma oscila entre 50-300 flg. de astaxantina por gramo de
levadura seca segn la cepa. Por tanto, hay que aadir gran cantidad de levadura
a la dieta para proporcionar 50-200 mg de astaxantina por kg de alimento para
lograr una pigmentacin adecuada de salmnidos (An y Johnson, 1989). Este
aporte alto de levaduras supone un suplemento excesivo de nutrientes que podra
ser perjudicial debido a que segn se ha evidenciado, esto produce un engorde
excesivo del animal. Por ello, es preferible la administracin tanto del pigmento
aislado como de cepas de levadura hiperproductoras en las que la relacin
pigmento/biomasa de levadura sea ms beneficiosa para la nutricin integral del
animal.

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos

El grupo cromforo en astaxantina constituye un agente fotoprotector y

antioxidante en P. rhodozyma (Nelis y De Leenheer, 1989). Contrarresta el efecto
del perxido de hidrgeno (H2O2), radicales superxido (O2-), hidroxilo (OH-), el
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oxgeno monoatmico (1O2), y de los radicales libres (Krinsky, 1979). As, los
carotenoides, localizados en glbulos lipdicos en el citoplasma y en las membranas de la
levadura, compensan la falta de enzimas antioxidantes (Schroeder y Johnson, 1993;
1995a; 1995b). Los carotenoides, que estn asociados con los lpidos y con la membrana
celular, pueden servir como un excelente mecanismo de defensa contra la peroxidacin
lipdica en la clula (Schroeder y Johnson, 1995a). Adems, los radicales perxido
reducen el contenido de astaxantina en X. dendrorhous por degradacin oxidativa,
desencadenando un aumento en la concentracin de -caroteno, lo que sugiere la
existencia de un mecanismo de retrorregulacin de la carotenognesis por el producto
final (Schroeder y Johnson, 1995b).

C. Estabilidad de los pigmentos.

La inestabilidad de estos pigmentos se produce frente a agentes fsicos (luz, oxgeno,

calor) y qumicos (cidos, y a veces bases). La exposicin a la luz solar, y UV induce una
fotoisomerizacin cis-trans llevando a la destruccin de los carotenoides. Estos pigmentos
son termolbiles, por lo que es necesaria seleccionar aquellos solventes que presentan
menor punto de ebullicin; as, las fracciones ligeras de petrleo, con un punto de
ebullicin de 30-60 oc son preferibles a las fracciones pesadas. Los carotenoides pueden
ser oxidados por oxgeno o por perxidos, siendo particularmente sensibles a la oxidacin
en cromatografa de capa fina, por lo que es necesario trabajar en atmsfera inerte
(Davies, 1976). Los cristales de los carotenoides son adems sensibles a la oxidacin
cuando estn expuestos al aire y deben ser mantenidos en atmsfera inerte o a vaco
(Britton, 1992). Se caracterizan por su insolubilidad en agua y su alta solubilidad en
disolventes orgnicos e incluso en aceites vegetales.
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Discusiones y conclusiones

Un punto crtico en la obtencin de los pigmentos, sean estos de bacterias o bien

de hongos, es el proceso de extraccin.

Para endopigmentos, se debe romper la pared celular segn los siguientes

mtodos: 1) ruptura mecnica por tratamiento con homogeneizador Braun, o bien
el paso por una prensa de French; empero, estos mtodos son laboriosos, y
requieren un gran aporte energtico, por lo que su aplicacin a escala industrial es
difcil; 2) ruptura celular qumica por hidrlisis cida o alcalina; sin embargo,
algunos pigmentos (como el caso de carotenoides) son susceptibles al uso de
cidos o bases; 3) ruptura enzimtica, mediante la cual se destruye la pared
celular por medio de enzimas lticas de origen microbiano (un ejemplo es el uso de
las enzimas del microorganismo Bacillus circulans cepa WL-12, que en diferentes
estudios presentaron una elevada actividad ltica (Johnson y col., 1978; Tangeraas
y col. 1989), o bien el caso de la enzima ltica de la levadura Rhizoctonia solanni.
Con posterioridad al tratamiento, el pigmento se debe extraer por aplicacin de
disolventes especficos tales como ter, cloroformo, benceno, cidos o bases.

Estos solventes orgnicos, no obstante resultan poco efectivos por ser txicos,
inflamables, poco selectivos y muy laboriosos. Como solucin a la problemtica
anterior, se debe aplicar la tecnologa de fluidos supercrticos (FSC), la cual se ha
aplicado exitosamente a la extraccin de pigmentos como el caroteno, la bixina, y
el licopeno desde vegetales y frutas, ya que los extractos obtenidos mediante la
tecnologa de FSC se caracterizan por no contener residuos ni contaminantes.

Existen dos solventes que se utilizan en esta tecnologa (Fig. 4.): el dixido de
carbono y el agua supercrtica; ambos, bajo condiciones cuasicrticas exhiben
propiedades solventes atractivas, no son txicos ni inflamables y presentan un
bajo costo. En referencia al tiempo de produccin mediante esta tecnologa, es
relevante destacar que requiere un tiempo de trabajo inferior si se compara con
otras tcnicas de extraccin, como son la destilacin o la aplicacin de los
solventes orgnicos mencionados, ya que demanda un menor nmero de
operaciones, al no generar residuos en el proceso, evitando as una posterior
operacin de separacin y/o purificacin.

La tecnologa de FSC se basa en el denominado punto crtico, que es especfico

para cada solvente, y se define como la presin y temperatura a las cuales el gas
y el lquido son indistinguibles; por encima de ste punto los fluidos presentan
caractersticas de ambas fases, propiedades similares a las de los gases, como su
gran difusividad (capacidad de difundir a travs de un medio), y otras que los
asimilan ms a los lquidos, tal cual es su alta densidad (Domnguez y Parzanese,
2011).
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La desventaja de FSC es que los costos de operacin son elevados, por lo que se
necesita de una inversin inicial alta, hay una baja disponibilidad de equipos y hay
un reducido desarrollo de diseos, adems de tener un costo de mantenimiento
elevado. El valor de un equipo cuya capacidad de operacin es de 4 5 litros, en
algunas de las firmas americanas o europeas que se dedican a fabricarlas, ronda
los US$ 150.000.

En resumen la principal limitacin desde el punto de vista econmico es el costo

energtico requerido para mantener las altas presiones a establecer. Debido a ello
hasta el momento esta tecnologa se ha aplicado a productos que, por su alto
valor agregado, consienten absorber dichos costos: aromas, pigmentos, aditivos
alimentarios, compuestos bioactivos, productos farmacuticos. En este sentido, las
lneas de investigacin deben orientarse a la bsqueda de nuevos solventes, con
propiedades especficas deseadas (como etano, propano, agua, mezclas de
solventes; y hacia la optimizacin de los procesos, para minimizar el costo
energtico requerido (Domnguez y Parzanese, 2011).
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Recomendaciones

En vista a lo estudiado, es necesario hacer notar que las investigaciones se deben

orientar hacia la identificacin de nuevas especies microbianas, con potenciales
biopigmentos nuevos, o bien, que sinteticen los ya conocidos, pero que presenten
elevadas tasas de generacin de pigmentos y altas velocidades especficas de
crecimiento; todo lo anterior de acuerdo a las condiciones de cultivo ptimas, tanto
nutricionales como a las condiciones fsico-qumicas propias de cada especie.

Por otro lado se deben hacer mayores estudios en relacin a la gentica molecular
de cada una de las cepas ya identificadas, logrando un mapeo completo de sus
genes, tanto en cepas silvestres como mutantes. Adems se debe determinar
especficamente la funcin biolgica de metabolitos primarios y secundarios de
estos microorganismos, con nfasis en la funcionalidad de los pigmentos con
potencial uso en la industria de los alimentos.

Otra lnea de investigacin debe centrarse en la bioseguridad de los pigmentos

obtenidos, identificando todos aquellos biocolorantes potencialmente txicos para
los consumidores, y con ello, aplicar mtodos bioqumicos y biotecnolgicos que
logren modificar las propiedades propias de cada uno de ellos, eliminando la parte
perjudicial y expresando en ellos otros constituyentes que entreguen un valor
agregado a cada pigmento, tales como concentraciones de determinadas
vitaminas, aminocidos, y otros constituyentes con beneficio a los consumidores.

La ingeniera gentica debe potenciar los estudios sobre la generacin de cepas

superproductoras de biopigmentos, sobreinduciendo la expresin de los genes
transcripciones, y enfocndose en la expresin de pigmentos exgenos en
aquellas cepas que no los expresan naturalmente, tal es el caso mencionado de
Escherichia coli, trasformada y condicionada para la sntesis de carotenoides,
organismo de fcil manejo tanto a nivel de laboratorio como industrial. Mismo
ejemplo, es el practicado por Meyer y col., que obtuvieron una mutante de Phaffia
rhodozima que sintetizaba 1688 g/g de biomasa, contra los 330 que produca la
cepa silvestre, o bien el caso de la cepa mutante (NCHFU-FS 301), que tuvo una
produccin de 1515.63 g/g de clulas, mientras que la cepa silvestre CBS-6398
slo una produccin de 565.08 g/g de clulas.

Siguiendo la lgica anterior, el estudio debe enfocarse en producir y mejorar las

bacterias y hongos superproductores fuertes de pigmentos; es decir, aquellos que
sintetizan ms de 1 g/L de estos colorantes, como es el caso de los hongos
Eremothecium ashbyii y Ashbya gossypi, que producen dichas concentraciones de
riboflavina. Metabolitos como este, pueden ayudar a suplir la ingesta recomendada
de dicha vitamina, y orientarse a sectores especficos del mercado, tal como
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mujeres embarazadas y en condiciones de lactancia, que necesitan 1.4 y 1.6 mg

de riboflavina por da, respectivamente (Biesalski y Grimm, 2007).

En otra perspectiva, se deben buscar mtodos fsicos, qumicos y biolgicos, que

mantengan estable en el tiempo las propiedades de los pigmentos extrados, ya
que muchos de ellos son sensibles al calor, inestables a determinados intervalos
de pH, y/o se desvanecen por accin de la luz. Encontrar los ajustes ptimos para
cada pigmento, lograr mantener estables la vida de anaquel de los alimentos en
los que este se aplic, y por consiguiente las propiedades organolpticas de ellos.

En conjunto a lo anterior, se deben buscar nuevos mtodos de extraccin, tanto de

endopigmentos como exopigmentos; asegurar de la misma forma un 100% de
pureza de los extractos, ya que con los mtodos de extraccin tradicionales
algunas veces se extraen sustancias innecesarias y hasta metabolitos txicos.
Debido a lo anterior, tambin se deben optimizar los procesos de post-extraccin.

Finalmente, el xito de cualquier pigmento producido por la fermentacin de

microorganismos depende de su aceptacin en el mercado, la aprobacin
regulatoria, y el tamao de la inversin de capital necesaria para llevar el producto
al mercado. De cualquier forma, el uso de biopigmentos es una alternativa mucho
ms segura que el uso de su contraparte sinttica, adems ltimamente se ha
enfatizado el movimiento y cultura de lo natural por parte de los consumidores,
por lo que el inters de los empresarios de la alimentacin sobre la obtencin de
biopigmentos de origen microbiano, se ve como un buena fuente de ganancias.
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Referencias

Libros

- FIGUEROA, Eugenio. Biodiversidad marina: valoracin, usos y

perspectivas: hacia dnde va Chile?. Santiago, Chile. Editorial
Universitaria, 2005. Pgs. 360-361.
- BELLO Gutirrez, Jos. Ciencia bromatolgica: principios generales de los
alimentos. Madrid, Espaa. Ediciones Daz de Santos, 2000. Pgs. 179-
181.
- ABBAYES, H., CHADEFAUD M., FELDMANN J., DE FERR Y., GAUSSEN
H., GRASS P., PRVOT A. Botnica: vegetales inferiores. Barcelona,
Espaa. Editorial Revert, 1989. Pgs. 9-11.
- CANEVA G., NUGARI, Mara Pa, SALVADORI O. La biologa en la
restauracin. Volumen 5 de Arte y restauracin. Andaluca, Espaa.
Editorial NEREA, 2000. Pgs. 54-55.

Tesis

- GARCA Guerra, Ana. Estudio de la produccin de astaxantina por

Xanthophyllomyces dendrorhous. Tesis (Doctorado en Biotecnologa).
Len, Espaa. Universidad de Len, Departamento de Biologa Molecular,
2012 (176 h).

Revistas

- MNDEZ Zavala A., CONTRERAS Esquivel J.C., LARA Victoriano F.,

RODRGUEZ Herrera R., AGUILAR C. N. Produccin fngica de un
pigmento rojo empleando la cepa xerofilca Penicillium purpurogenum GH-
2. Universidad Autnoma Metropolitana de Mxico. Iztapalapa, Mxico.
Revista Mexicana de Ingeniera Qumica, vol. 6, nm. 3, 2007, pgs. 267-
273.
- PREZ Galvn, C., MONTAEZ Senz, J. C., MNDEZ Zavala, A.,
RAMOS Ponce, L. M., LARA Cisneros, G. Produccin fngica de un
pigmento amarillo a partir de una cepa de Aspergillus ustus. Coahuila,
Mxico. Editorial Universidad Autnoma de Coahuila, 2010.
- VILLA, Pilar., CALO, Pilar. SEIRO, Blanco, y SEIRO, Carmen. Phaffia
rhodozyma: primer microorganismo explotado para la produccin de
astaxantina. Departamento de Microbiologa. Facultad de Farmacia.
Universidad de Santiago de Compostela, Espaa.

Artculos de Revistas

- DE CARVALHO, Jlio Cesar, PANDEYB, Ashok, OLIVA, Bruno, BRANDA,

Dbora, RODRGUEZ-LONA, Jos ngel, SOCCOLA, Carlos Ricardo.
Relacin entre el crecimiento, anlisis respiromtrico y produccin de
biopigmentos desde Monascus por fermentacin en estado slido. Revista
 P g i n a | 24

de Ingeniera Bioqumica (Biochemical Engineering Journal). Editorial

Elsevier. Volumen 29. Pgs. 262-269. 15-Abril-2006.
- NINET L., RENAUT J. y TISSIER R. Activacin de la biosntesis de
carotenoides por Blakeslea trispora. Revista de Biotecnologa y
Bioingeniera (Biotechnology and Bioengineering). Editorial John Wiley &
Sons, Inc. Volumen 11, pags. 1195-1210, Noviembre de 1969.
- THOMAS D.M., GOODWIN T.W. Estudios de carotenognesis en Blakeslea
trisporaI.: Observaciones generales de la sntesis en cepas con y sin
acoplamiento. Revista de Fitoqumica (Phytochemistry). Volumen 6. Marzo
de 1967. Pgs. 355360.
- FANG, Tony J., CHENG, Yi-Shin. Mejora de la produccin de astaxatina
por Phaffia rhodozyma a travs de la mutacin y optimizacin de las
condiciones de cultivo. Revista de Fermentacin y Bioingeniera (Journal of
Fermentation and Bioengineering). Volumen 75, Marzo de 1993. Pgs.
466469.
- HAILEI, W, ZHIFANG, R, PING, L, YANCHANG, G, GUOSHENG,
L, JIANMING, Y. Mejora de la produccin de un pigmento rojo en
Penicillium sp. HSD07B sintetizado durante co-cultivo con Cndida
tropicalis. Revista Bioresour Techno. Editorial Elsevier. 9 de Marzo de 2011.
- VSQUEZ Rodrguez, Jess Alberto, GARCA Daz, Graciela, NEZ
Gonzlez, Mara Adriana, HERNNDEZ Luna, Carlos, PALACIOS Corts,
Luca. Efecto de hidrolizados enzimticos de grano e inflorescencia de
Amaranto (Amaranthus cruentus) sobre la produccin de pigmentos
carotenoides en cultivo mixto de Saccharomyces exiguus y Phaffia
rhodozyma. Revista de la Facultad de Ciencias Biolgicas, UANL.
Monterrey, Mxico. 2007.
- LIM, Seong Han, CHOI Jong Soo, PARK Enoch Y. Produccin microbiana
de riboflavina usando los superproductores de riboflavin: Ashbya gossypii,
Bacillus subtilis, y Cndida famate. Revista de Biotecnologa e Ingeniera en
Bioprocesos (Biotechnology and Bioprocess Engineering). Volumen 6, Abril
de 2001. Pgs. 75-88.
- DUFOSS, Laurent. Produccin microbiana de pigmentos de calidad
alimentaria. Chicago, EEUU. Revista Food Technol, 2006. Volumen 44.
Pgs. 313321.

Referencias electrnicas

- MEINICKE Bhler, Rose Marie, DUTRA, Anderson Cesar,

VENDRUSCOLO, Francielo; ESTEVES, Moritz Denise, NINOW, Jorge Luiz.
Produccin de pigmentos de Monascus en biorreactor utilizando un co-
producto de biodiesel como sustrato [en lnea]. Ciencia y tecnologa de
alimentos (Food Science and Technology), Febrero de 2013.
<<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0101-
20612013000500002&script=sci_arttext>> [consulta: 18 de Octubre de
2014].