CAPITULO 5. TECNOLOGA ENZIMTICA.

La tecnologa de enzimas involucra la produccin (obtencin de extractos con

actividad cataltica), purificacin (separacin de otras macromolculas orgnicas),
caracterizacin y finalmente, la inmovilizacin de las enzimas para su utilizacin en
gran variedad de biorreactores.

Biocatalizadores

Los biocatalizadores son protenas con actividad cataltica (enzimas) o pueden ser
cidos nucleicos (ribosimas) estos ltimos descubiertos en la dcada de los 80s.
Hoy en da, sabemos que las enzimas son necesarias en todos los sistemas vivos,
para catalizar las reacciones necesarias para su supervivencia y reproduccin. Las
enzimas aisladas (fuera de la clula o sistemas biolgicos) tambin pueden catalizar
estas mismas reacciones. Estas excelentes propiedades de las enzimas se utilizan
en la tecnologa de enzimas. Por ejemplo, se pueden utilizar como biocatalizadores
para catalizar reacciones qumicas en escala industrial de manera sostenible.

Su aplicacin abarca la obtencin de productos para todas las necesidades

materiales humanas (por ejemplo, alimentos, alimentos para animales, productos
farmacuticos, productos qumicos, fibras, la higiene, y la tecnologa del medio
ambiente), as como en una amplia gama de productos analticos, aplicados al
diagnstico.

Leccin 19. Nomenclatura y clasificacin

En la medida que se iban descubriendo nuevas clases de enzimas, los nombres

asignados a estas estaban relacionados con el tipo de sustrato aadindoles la
terminacin asa, tenemos como ejemplo la amilasa, celulasa, pectinasa, entre
otras; algunas veces su nombre no corresponde al sustrato ni al tipo de reaccin
que estas catalizan como: bromelina, pepsina, renina, catalasa entre otras; cierto
tipo de ellas llevan el nombre de la fuente de produccin como el caso de la proteasa
papana. Este tipo de terminologa, es confusa y desordenada, igualmente no da
informacin bsica de ella; por este motivo era imperioso crear una clasificacin
sistemtica que las clasificara y ordenara. En agosto de 1955, la Asamblea General
de la Unin de Bioqumica y Biologa Molecular, IUBMB (por sus siglas en ingles),
crea la Comisin Internacional de Enzimas (Enzymes Commission, EC) que aborda
el estudio, los criterios y reglas para la clasificacin de enzimas; junto con la
Comisin de Nomenclatura de la IUPAC, establecen los parmetros y reglas para
nombrar una enzima.

Clasificacin enzimtica

Para la clasificacin de las mismas la EC establece los siguientes criterios: (i) El

nombre de una enzima debe ser exclusivamente individual y este, estar
estrechamente relacionado con su clasificacin y actividad cataltica (ii) Si en una
reaccin cataltica intervienen mas de una enzima, a esta se le debe agregar el
nombre de complejo.

Desde 1964 la Comisin Internacional de Enzimas clasifica los diversos tipos de

enzimas en seis grandes grupos, as:

Grupo 1. Oxidoreductasas: son enzimas que catalizan reacciones de xido-

reduccin, empleando coenzimas, tales como NAD+ y NADP+, como aceptor de
hidrgenos.

AH2 B A BH2

ARed BOx AOx BRed

Grupo 2. Transferasas: Catalizan la transferencia de grupos de una molcula a

otra.

AB C A BC

Grupo 3. Hidrolasas: Catalizan reacciones que implican la ruptura hidroltica de

enlaces qumicos.

AB H2O AH BOH

Grupo 4. Liasas: Catalizan la ruptura de enlaces (C-C, C-S y algunos C-N,

excluyendo enlaces peptdicos), pero a diferencia de las hidrolasas no lo hacen por
hidrlisis.

AB A B

Grupo 5. Isomerasas: Cumplen la funcin de transformar substratos de una forma

isomrica en otra.

A BIsom

Grupo 6. Ligasas: Catalizan la unin de dos sustratos con hidrlisis simultanea de

un nucletido trifosfato (ATP,GTP, entre otros).

A B XTP AB XDP Pi

Toda enzima esta nominada con un nmero de cuatro cifras, los cuales se refieren
a:

Primer nmero: Se puntualiza el grupo al cual pertenece la enzima. As por ejemplo

la glucosiltransferasa pertenece al grupo de las transferasas, por tal motivo su
primer nmero es el 2. El segundo nmero: corresponde a la subclases (ver tabla
10), y hace referencia al grupo funcional que interviene en la reaccin, el tercer
nmero: define la subsubclase implicando el tipo de sustrato que interviene en la
reaccin; y el cuarto nmero: es el orden aleatorio de clasificacin dentro de la
subsubclase.

Tabla 10. Subclases de los diversos tipos de enzimas.

Subclases Nombre de la enzima y tipo
EC 1 Oxidoreductasas
EC 1.1 Acta sobre el grupo CH-OH como donador
EC 1.2 Acta sobre el grupo aldehdo o oxo.
EC 1.3 Acta sobre el grupo CH-CH.
EC 1.4 Acta sobre el grupo CH-NH2.
EC 1.5 Acta sobre el grupo CH-NH.
EC 1.6 Acta sobre el grupo NADH o NADPH
EC 1.7 Acta sobre el grupo de oros componentes nitrogenados.
EC 1.8 Acta sobre el grupo azufre.
EC 1.9 Acta sobre el grupo hemo.
EC 1.10 Acta sobre el grupo difenol y sustancias relacionadas.
EC 1.11 Acta sobre el grupo perxido como aceptor.
EC 1.12 Acta sobre el grupo hidrogeno como donador.
Acta sobre un donador simple con incorporacin de una molcula de
EC 1.13
oxigeno.
Acta sobre un par de donadores con incorporacin o la reduccin de
EC 1.14
una molcula de oxgeno.
EC 1.15 Acta sobre radicales perxido como aceptor.
EC 1.16 Acta oxidando iones metlicos.
EC 1.17 Acta sobre el grupo CH o CH2.
Acta sobre los grupos sulfuro y hierro de las protenas como
EC 1.18
donadores.
EC 1.19 Acta sobre los grupos flavonoides.
EC 1.20 Acta sobre los grupos fosfatos como los del arsnico como donadores.
EC 1.21 Acta sobre el grupo X-H y Y-H para formar un enlace X-Y.
EC 1.22 Acta sobre el grupo halogenoide.
EC 1.97 Otras oxidoreductasas.
EC 2 Transferasas
EC 2.1 Transfieren grupos a una molecula de carbono.
EC 2.2 Transfieren aldehdos o grupos cetnicos.
EC 2.3 Aciltransferasas.
EC 2.4 Glicosiltransferasas
EC 2.5 Transfieren grupos alkilo y metilos.
EC 2.6 Transfieren nitrgenos.
EC 2.7 Transfieren grupos que contienen fosfatos.
EC 2.8 Transfieren grupos que contienen azufre
EC 2.9 Transfieren grupos que contienen selenio
EC 2.10 Transfieren grupos que contienen molibdeno, tungsteno
EC 3 Hidrolasas
EC 3.1 Acta sobre enlaces ester
EC 3.2 Glicosilasas
EC 3.3 Acta sobre enlaces eter
EC 3.4 Acta sobre enlaces peptidicos
EC 3.5 Acta sobre enlaces carbn nitrgeno.
EC 3.6 Acta sobre acidos anhdridos
EC 3.7 Acta sobre enlaces carbn carbn
EC 3.8 Acta sobre enlaces haluros
EC 3.9 Acta sobre enlaces fosfonitrogenados
EC 3.10 Acta sobre enlaces azufre nitrgeno.
EC 3.11 Acta sobre enlaces fosfato carbn.
EC 3.12 Acta sobre enlaces azufre azufre.
EC 3.13 Acta sobre enlaces azufre carbn.
EC 4 Liasas
EC 4.1 Liasas carbn - carbn
EC 4.2 Liasas Carbn oxigeno.
 EC 4.3 Liasas carbn niyrgeno.
EC 4.4 liasas carbn azufre.
EC 4.5 Liasas carbn haluros.
EC 4.6 Liasas fosforo oxigeno.
EC 4.99 Otras liasas.
EC 5 Isomerasas
EC 5.1 Racemasas y epimerasas
EC 5.2 Cis-trans-Isomerasas
EC 5.3 Isomerasas intramolecular
EC 5.4 Transferasas intramolecular (mutasas)
EC 5.5 Liasas intramolecular.
EC 5.99 Otras isomerasas.
EC 6 Ligasas
EC 6.1 Forman enlaces Carbn oxigeno.
EC 6.2 Forman enlaces Carbn azufre.
EC 6.3 Forman enlaces Carbn nitrgeno.
EC 6.4 Forman enlaces Carbn carbn.
EC 6.5 Forman enlaces ester fosfricos.
EC 6.6 Otras ligasas
Tomado de: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

Composicin de las enzimas

Todas las enzimas son de composicin proteica (cuya unidad fundamental son
aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos), pero estn estructuradas en dos
partes bien definidas: la protena llamada Apoenzima y un grupo prosteico (fraccin
no proteica) llamado Coenzima, la cual forma parte estructural de la enzima. La
combinacin de la apoenzima con la coenzima, recibe el nombre de holoenzima.
Los cofactores son molculas que aumentan o disminuyen la actividad de un
enzima. La diferencia entre un coenzima y un cofactor radica que el primero hace
parte integral, no es disociable y le brinda estabilidad a la enzima; mientras que el
cofactor son grupos transitorios, disociables y se pueden unir tanto a la enzima
como al sustrato.

Como generalidades de las enzimas podemos decir lo siguiente (i) no sufren

modificacin al final de la reaccin (ii) no cambian la constante de equilibrio de una
reaccin qumica (iii) son muy especficas (iv) aceleran varios ordenes de magnitud
mayor con respecto a la reaccin no catalizada y (v) actan en condiciones
moderadas de presin y temperatura.

Actividad enzimtica (U)

La actividad enzimtica se define como la medida de la velocidad en la cual un

enzima cataliza una reaccin, midiendo cuantitativamente el consumo de sustrato o
el incremento en la concentracin de producto, en unas condiciones de temperatura,
pH y concentracin de sustrato optimas.

Figura 26. Clasificacin de las protenas.

Tabla 11. Nomenclatura de aminocidos, el sistema clsico de tres letras fue

remplazado por el sistema actual de una letra, lo cual facilita su utilizacin en
bioinformtica, desarrollado principalmente para biologa molecular.
 Cdigo de
aminocido
Aminocido
Tres letras Una letra
Clsico Actual
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
cido asprtico Asp D
Cistena Cys C
Glutamina Gln Q
cido glutmico Glu E
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina Ile I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptfano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V

La actividad enzimtica es el parmetro cuantificable mas importante del trabajo con

enzimas; saber medirla es clave y fundamental para todos y cada uno de los
procedimientos realizados en enzimologa.

V= -d[S] = d[P]

dt dt

donde:
V : es la velocidad.
[S]: concentracin de sustrato.
[P]: concentracin de producto.
dt: periodo de tiempo.

La definicin de actividad enzimtica (U) segn el Sistema Internacional de

unidades (SI) la define como: la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1
mol de sustrato en un minuto.
La actividad especfica: es el nmero de unidades de enzima por miligramo de
protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml).

Recientemente se ha definido la unidad de actividad enzimtica como la cantidad

de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal
(kat). Como 1 mol son 106 moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal
equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan
frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat, 10 -6 kat) o el nanokatal
(nkat, 10-9 kat).

Ejemplo:

Se requiere medir la actividad enzimtica de una invertasa extracelular, proveniente

del extracto crudo de una fermentacin del microorganismo Aspergillus niger. La
reaccin enzimtica se realiz bajo las siguientes condiciones: Concentracin se
sustrato (sacarosa): 190 mM, pH: 5.6, temperatura: 40 oC, Agitacin magntica
constante, relacin volumtrica enzima-sustrato: (1:1). Se tomaron alcuotas de 200
microlitros en los siguientes tiempos: 0, 2, 4, 8, 16, 32 y 64 min, inactivando la
enzima por calentamiento (5 minutos en un bao a ebullicin). Posteriormente
dichas muestras se analizaron para cuantificar la concentracin de azucares
reductores totales mediante el mtodo de DNS (acido dinitrosalicilico). Los
resultados son los siguientes:

Tabla 12. Concentracin de azucares reductores totales, producto de la reaccin

enzimtica de la invertasa de Aspergillus niger.

Concentracin de azucares
Tiempo (min)
reductores totales (mg/ml)a
0 0
2 0.03
4 0.26
8 0.48
16 0.92
32 1.23
64 1.54
a: La curva de calibracin utilizada relaciona Absorbancia (540 nm) y concentracin
(mg/ml) de azucares expresado en glucosa
 1,8

Concentracin de azcares
1,6

reductores (mg/ml)
1,4
1,2
1 a
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)

1,8
y = 0,0595x - 0,019
Concentracin de azcares

1,6
reductores (mg/ml)

1,4
1,2
1 b
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)

Grafico 27. Relacin entre la concentracin de azucares reductores totales

como producto de la reaccin enzimtica en funcin del tiempo, grfica a:
aumento en la concentracin de azucares reductores totales a travs del tiempo, b:
zona roja: puntos tomados para la regresin lineal y el calculo de la actividad
enzimtica.

Graficando los valores establecidos: y = 0,0595x - 0,019

Los valores tomados son aquellos que se encuentran en los primeros instantes de
la determinacin de los productos (puntos rojos de la grfica b), cuya pendiente sea
mas cercana a la unidad, igual mente se descartan los valores cuya pendiente sea
cero (0) o incidan de forma significativa en la disminucin del valor de la pendiente.
En este caso se tomaran los valores: (0,0); (2, 0.03); (4, 0.26); (8, 0.48); (16, 0.92)
y se descartaran: (32, 1.23) y (64, 1.64); la lnea de tendencia central con una
pendiente de 0.06 (mg/ml)/min implica la actividad enzimtica (U)

Leccin 20. Extraccin, purificacin y caracterizacin de proteinas

La biotecnologa ofrece un potencial para aumentar la produccin de bienes para la

satisfaccin de variadas necesidades humanas; un sub-campo de esta es la
tecnologa de enzimas, la cual novedosos y variados procesos estn siendo
desarrollados para la fabricacin a granel de alimentos de alto valor aadido
utilizando enzimas como biocatalizadores (por ejemplo, pan, queso, cerveza,
vinagre entre otros), productos qumicos como: aminocidos y vitaminas y productos
farmacuticos. Las enzimas son tambin utilizados para prestar servicios, como en
el lavado en procesos ambientales, o para fines analticos y de diagnstico. El
sustento de la tecnologa enzimtica tanto en el mundo acadmico como en el
industrial, se basa en dos corrientes: (i) Diseo de productos: El desarrollo de
nuevos y mejores productos, procesos y servicios para satisfacer las necesidades
humanas y (ii) Procesos innovadores: la mejora de procesos para la obtencin de
nuevos productos con materias primas existentes. Ambos deben cumplir con dos
criterios: ser competitivos y sostenibles.

La produccin de enzimas implica la fuente de obtencin de las mismas, as, existen

tres orgenes principales que son: (i) animal, (ii) vegetal y (iii) microbiano. Tanto la
animal como la vegetal son limitadas por las inclemencias externas como el clima,
la fuente de alimentacin, variedad de los suelos, entre otras; lo cual la produccin
microbiana brinda ventajas de ndole biotecnolgico como: la obtencin rpida y
controlada en reactores enzimticos.

Las enzimas en cuanto a su extraccin las podemos clasificar en dos grandes

grupos: intracelulares y extracelulares. En las primeras es obligatorio el rompimiento
celular, para lo cual existen diversos mtodos qumicos, fsicos y enzimticos, para
las enzimas extracelulares tan solo se requiere la separacin de la biomasa con el
sobrenadante de la fermentacin.

Figura 28. Diferencias entre la pared bacteriana de Gram positivas y Gram

negativas

Ruptura celular

La dificultad de la ruptura celular es dependiente del tipo de microorganismo, as,

de mayor a menor dificultad de rompimiento tenemos que: las esporas >cocos
Gram- >levaduras >clulas vegetales >bacilos Gram+ >micelios > clulas
animales.

Lo anterior hace referencia a que las bacterias Gram son mas difciles de romper
que las Gram + esto se debe a la estructura de la pared, como se muestra en la
figura 28.

Formas fsicas:

Homogenizacin mecnica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio,

mortero, licuadora, a veces con ayuda de abrasivos como almina, arena o
bolitas de vidrio; las clulas son suspendidas en un solvente isotnico
(sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico junto
con un buffer para mantener controlado el pH. La homogenizacin a altas
presiones es una practica muy comn en el rompimiento de clulas y en el
estudio sobre la actividad de enzimas. (Alline et al., 2012).

Homogeneizacin snica: el choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca

cambios de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular. Se
usa generalmente para bacterias y levaduras y a veces, para determinados
tejidos animales como el bazo, rin o eritrocitos. La sonicacin puede causar
efectos en la estabilidad enzimtica cuando las clulas se rompen por este
mtodo, dicho cambio varia dependiendo de factores asociados como el pH,
temperatura, tipo de Buffer, tiempo, entre otros; por ejemplo se ha reportado
una disminucin del 70% de la estabilidad enzimtica de la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (G6PDH) y un 15% de la Alcohol deshidrogenasa (ADH) por
la extraccin con sonicacin. (Belma et al., 2000)

Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento rpidos y

repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por
congelacin se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la
estructura. Al descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido
a la presencia de agua pura y se libera su contenido.
 Formas qumicas:

Se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, ter de

petrleo, isopentanol, entre otros.

Homogeneizacin por deshidratacin: se basa en la precipitacin de

protenas por solventes orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico"
se utiliza acetona en fro.

Formas enzimticas

Se utilizan enzimas capaces de hidrolizar las paredes bacterianas

permitiendo la salida del contenido intracelular; la enzima mas utilizada es la
lisozima la cual cataliza de forma especfica la hidrlisis de enlaces (1-4)
del cido N-acetilmurnico presentes en los mucopptidos de las paredes
celulares de las clulas bacterianas; de estas, las Gram-positivas son las que
presentar mayor sensibilidad a la lisozima, mientras que las Gram-negativas
se consigue con la adicin de EDTA (cido etilendiaminotetraactico) como
agente quelante, lo que facilita su ruptura.

Eleccin del mtodo de ruptura

En la eleccin del mtodo de ruptura celular depende de seis factores: (i) Naturaleza
y fuente de la enzima (origen animal, vegetal, microbiana: fngica o bacteriana) (ii)
Escala de la operacin (laboratorio, planta piloto o industrial) (iii) Velocidad del
mtodo de extraccin, (iv) Estabilidad de la enzima, (v) Pureza requerida y (vi) costo
del proceso.

Tabla 13. Mtodos y principios de ruptura celular

Homogenizacin El rompimiento se realiza en un

Mecnicos Homogenizacin
de cuchillas mezclador
 Las clulas son forzadas a pasar a
travs de un pequeo orificio lo
Homogenizacin que produce su rompimiento por el
de alta presin esfuerzo de corte junto con el
cambio rpido de presin. Los mas
utilizados son los microfluidizadores.
Mecanismo
en estado
lquido
Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin
Sonicacin celular. Esto produce una intensa agitacin lo que
destruye las membranas celulares

Rompimiento de las clulas en una combinacin de

Prensa francesa
presin y filtracin.

Las clulas son rotas por medio de una molienda

Molienda
Mecanismo con abrasivos, ejemplo: arena.
en estado
slido
Molinos de bolas Las clulas son trituradas con esferas de vidrio o acero.

Shock osmtico Ruptura osmtica de la membrana

No mecnicos Temperaturas
extremas Formacin y fusin de cristales de hielo. Rompimiento con
(congelacin, Nitrgeno lquido de tejidos vegetales.
Fsicos descongelacin)

Descompresin de Ruptura esplnica de las clulas por la generacin de

gas burbujas al disminuir la presin (ley de Henry)
 Consiste en la formacin de microburbujas de vapor
Cavitacin producidas de forma mecnica en un medio lquido por
hidrodinmica variaciones en la presin, lo cual induce al rompimiento
de la pared celular.

Secado por aire

forzado.
Deshidratacin celular, provocando
Desecacin Secado al vaco
un rompimiento de las mismas.
Secado por
solventes

Transiciones en la escala de pH, bsico y cido. Algunas

pH extremos
clulas no son resistentes a estas variaciones.

Permeabilizacin de clulas por solubilizacin de

Detergentes protenas de membrana, debido a apertura de poros.
Ejemplo: Triton X-100, SDS, Tween, Spam.

Disuelven la pared celular fundamentalmente por la

Solventes
disolucin de lpidos asociados a membranas. Ejemplo:
orgnicos
Tolueno, acetona.
Qumicos

Algunos se utilizan por sus propiedades en la sntesis de la

Antibiticos
pared celular, como algunas penicilinas.

Algunos como el EDTA atrapan cationes divalentes (Ca+2)

Agentes quelantes
que debilita la membrana celular.

Agentes Urea o sales de guanidina favorecen la disolucin de

caotrpicos protenas y minerales de la pared celular de algunas
 bacterias ocasionando su ruptura. Otro agente caotrpico
utilizado es el isotiocianato de guanidinio

Lisozima + EDTA; esta combinacin digiere las paredes

celulares por ruptura de los enlances (14) glicosdicos
Adicin de
entre el cido N-acetilmurmico (NAM) y la N-
enzimas
acetilglucosamina (NAG) del mucopptido. Otro ejemplo
es: la proteinasa K junto con SDS.

Es un proceso biolgico por el cual una clula se

autodestruye, en vegetales la absorcin de agua en exceso
puede causar el rompimiento de vacuolas; en animales la
Autolisis
produccin de la enzima autolisasa puede ocasionar la
Biolgicos hidrlisis celular; en bacterias las enzimas autolticas de la
pared bacteriana (autolisinas) lleva a la lisis celular.

Exponer las clulas a soluciones concentradas con sales

Lisis inducible
y/o tratamiento radioactivo puede inducir la lisis celular.

Algunas sustancias alteran la permeabilidad de la

Inhibidores de
membrana celular, como: polienos, polimixinas e
pared celular
imidazoles.

Tabla desarrollada basada en el artculo: Bangaru Balasundaram, Sue Harrison, Daniel G.

Bracewell. Advances in product release strategies and impact on bioprocess design .
Trends in Biotechnology, Volume 27, Issue 8, August 2009, Pages 477-485

Purificacin de enzimas

La purificacin de una enzima, es un procedimiento complejo, cuya metodologa es

nica para cada protena; cada paso sistemtico y el proceso total de la purificacin
depende de tres aspectos: (i) la naturaleza bioqumica (estabilidad y actividad
enzimtica), (ii) la utilizacin del enzima (analtica, industrial) y (iii) la complejidad
del proceso de purificacin (costos tecnolgicos).

La naturaleza bioqumica del enzima, cobra valor en la medida que se pueda utilizar
diversas metodologas tecnolgicas o la combinacin de ellas, segn lo permita el
mantenimiento de su actividad enzimtica en cada uno de ellos. Algunas enzimas
son menos estables que otras (muy delicadas en cuanto a la permanencia de su
actividad) lo cual limita significativamente cada metodologa de purificacin. Por
ejemplo la enzima fructosil transferasa proveniente de Aspergillus aculeatos
utilizada para la sntesis enzimtica de fructooligosacridos (FOS) es mas estable
a la temperatura que las bacterianas del gnero Erwinia herbicola, lo cual permite a
las primeras, procesos de purificacin a temperaturas por enzima de 18 oC, sin
afectar significativamente su actividad. (Iraj Ghazi et al., 2007).

La metodologa de la purificacin se ve afectada directamente por la utilizacin final

de la enzima; si el objetivo es usarla para aplicaciones analticas o encaminados a
su estudio bsico, el proceso se debe orientar hacia la obtencin de un alto grado
de purificacin junto con una aceptable actividad, ejemplos de este tipo de protenas
son las diversas enzimas utilizadas en biologa molecular (DNA polimerasa,
enzimas de restriccin: EcoRI, BamHI, HindIII entre otras) y en usos analticos como
en biosensores (glucosa oxidasa, peroxidasa, galactosidasa entre otras). Si su uso
se proyecta principalmente en procesos industriales el grado de purificacin no es
necesariamente muy alto, pero su actividad si; muchas soluciones enzimticas son
mezclas de varias protenas, esto amplia el espectro activo sobre todo cuando se
utiliza en sustratos complejos, como ejemplo tenemos las mezclas enzimticas en
la elaboracin de bebidas alcoholicas, el producto nombrado como Viscoferm de
la empresa farmacutica danesa Novonordisk, compuesto por una mezcla
enzimtica de: Celulosa, xilanasa y beta-glucanasa.

La complejidad del proceso de purificacin incide en el resultado final en cuanto al

valor econmico total, entre mas purificada sea una enzima mayor es el costo de
produccin, por ejemplo 500 ml de cuajo industrial (quimosina) para 5000 litros de
leche posee un costo promedio de 10 US (dlares americanos), mientras que una
taq ADN polimerasa convencional para amplificacin en PCR, 2ml posee un valor
de 145 US (dlares americanos).

Diseo de una metodologa de purificacin

Para el diseo de una metodologa de purificacin enzimtica, se debe tener

presente las siguientes recomendaciones:

(i) Seleccionar factores fsico-qumicos que permitan mxima productividad

y menores costos.
(ii) Avanzar de mtodos de menor a mayor rendimiento y resolucin.
(iii) Avanzar de mayor a menor capacidad de procesamiento.
(iv) Aprovechar las condiciones y caractersticas de la muestra al final de cada
paso, para que estas sirvan para la seleccin del prximo.

Existen variados mtodos para la purificacin de enzimas entre los mas utilizados
tenemos las separaciones cromatogrficas, las cuales se basan en las diferencias
de carga, tamao o afinidad de las diferentes protenas. La cromatografa utilizada
en la separacin de enzimas puede ser de dos tipos: (i) preparativa y (ii) analtica;
la diferencia radica en el volumen de muestra y la recuperacin de fracciones que
permitan obtener protenas para su posterior utilizacin, esta es la preparativa a
diferencia de la analtica que no permite esto ltimo.
 Figura 29. Caracteristicas generales de una purificacin enzimtica.

La columna en su interior posee un material slido con las caractersticas qumicas

diversas (fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace pasar a travs de
la columna (fase mvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la
columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase mvil. Cada protena
migrar a distinta velocidad segn su grado de afinidad por la fase estacionaria.

Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos: (i) cromatografa por filtracin
o exclusin molecular (ii) cromatografa de intercambio inico (iii) cromatografa
hidrofbica y (iv) cromatografa de afinidad.
 32,500 KDa.

0.07

0.06

62,000 KDa.
Absorbancia (280 nm)

0.05 Ft.asa

0.04 116,000 Kda. 84,000 KDa.

0.03

0.02

0.01

0
2.9 14.5 26.1 37.7 49.3 60.9 72.5 84.1 95.7 107.3 118.9 130.5 142.1 153.7

Fructosil transferasa. AN 166. Marcadores de peso. Volumen de retencin (ml.)

FIGURA 30. Cromatograma de exclusin por tamao. Determinacin del peso

molecular de la enzima Fructosiltransferasa (Ftasa) de Aspergillus niger AN 166.
por filtracin en gel con sephadex G-100. Fuente autor.
0.06 0.06

0.05 0.05

Gradiente de Nacl (molar)

Absorbancia (280 nm)

0.04 0.04

0.03 0.03

0.02 0.02

0.01 0.01

0 0
3 12 21 30 39 48 57 66 75 84 93 102 111 120 129 138 147 156

proteina Gradiente de NaCl Vol. de retencin (ml)

FIGURA 31. Cromatografia de intercambio aninico, utilizando Amberlys A-27

en la purificacin de la enzima fructosiltransferasa del Aspergillus niger AN 166.
Fuente: autor.
Parmetros de purificacin

Existen tres parmetros tericos que permiten cuantificar y comparar los diversos
mtodos de purificacin; estos son: (i) el porcentaje de rendimiento, (ii) el factor de
purificacin y (iii) la actividad enzimtica.

El porcentaje de rendimiento: es la relacin entre la actividad enzimtica total del

paso n de purificacin y el extracto inicial.

% Rendimiento= (U)n X 100%

(U)extracto inicial

El factor de purificacin: es la relacin entre la actividad especfica del paso n de

purificacin y la actividad especfica del extracto inicial.

Factor de purificacin= (U/mg)n

(U/mg)extracto inicial

Actividad especfica: Es la relacin entre la actividad total (U) sobre el contenido de

protena en mg.

Actividad especfica= (U)/mg de protena.

Ejemplo:

Se requiere completar la tabla 14 de purificacin de una levanasa producida por

Bacillus subtilis y clonada en E. coli.
 Tabla 14. Purification of B. suptilis levanase produced in E. coli.

Proteina Total actividad Rendimiento Factor

Paso de purificacin
(mg) (U) (%) Purificacion
Extracto Crudo 1,94 4,10
Sulfato de Amonio 1,17 3,76
precipitation
DEAESepharose CL-6B
Pico I 13,1 0,82
Pico II 12,7 1,14
S-Sepharoseb
Pico I 4,6 0,36
Pico II 2,4 0,2
MonoQ 1,3 0,12
Tomada de: Erich Wanker, Anton Huber, and Helmut Schwab: Purification and characterization of
the Bacillus subtilis Levanase Produced in Escherichia coli. Applied And Environmental Microbiology,
May 1995, Vol. 61, No. 5 p. 19531958

La metodologa propuesta por Erich, establece siete (7) pasos de purificacin para
la Levanasa; se parte del extracto inicial, el cual la actividad enzimtica total
(U)extracto inicial es: 4,10 unidades por ml, y el contenido de protena es:1,4 (mg)extracto
inicial/ml.

Para el extracto crudo el porcentage % de rendimiento es:

% Rendimiento= (U)extracto inicial X 100% = (4,10/4,10) X 100% = 100

(U)extracto inicial

Para el primer paso de purificacin (Precipitacin con sulfato de amonio) es:

% Rendimiento= (U)Sulfato Amonio X 100% = (3,76/4,10) X 100% = 91,7

(U)extracto inicial

Este resultado se interpreta como: el 91,7% de la actividad del extracto crudo se

conserva (el 8,2% de la actividad inicial se pierde) luego de la precipitacin con
sulfato de amonio.
 La actividad especfica del extracto crudo es:

Actividad especfica= (U) extracto inicial = 4,10/1,94 = 2,11 U/mg

mg extracto inicial
y para el primer paso de purificacin (Precipitacin con sulfato de amonio) la
actividad especfica es:

Actividad especfica= (U) Sulfato Amonio = 3,76/1,17 = 3,21 U/mg

mg Sulfato Amonio
El factor de purificacin para el extracto crudo es:

Factor de purificacin= (U/mg)extracto inicial = (4,10/1,94) / (4,10/1,94) = 1

(U/mg)extracto inicial
Para el primer paso de purificacin (Precipitacin con sulfato de amonio) el factor
de purificacin es:

Factor de purificacin= (U/mg)Sulfato Amonio = (3,21/2,11) = 1,52

(U/mg)extracto inicial
Lo que implica que la enzima se ha purificado 1,52 veces con respecto al extracto
inicial.

Tabla 15. Resultados de la purificacin de de levanasa de B. Suptillis producida en

E. coli
Actividad
Proteina Actividad Rendimiento Factor
Paso de purificacin Especfica
(mg) total (U) (%) Purificacin
(U/mg)
Extracto Crudo 1,94 4,10 2,11 100 1
Sulfato de Amonio 1,17 3,76 3,21 91,7 1,52
precipitation
DEAESepharose CL-6B
Pico I 13,1 0,82 0,06 20 0,03
Pico II 12,7 1,14 0,09 27,8 0,04
S-Sepharoseb
Pico I 4,6 0,36 0,08 8,78 0,04
Pico II 2,4 0,2 0,08 4,88 0,04
MonoQ 1,3 0,12 0,09 2,93 0,04
Generalmente el comportamiento de estos parmetros de control al desarrollar la
purificacin, es el aumento de la actividad especfica (en cada paso de purificacin
la concentracin de protena disminuye, encontrndose esta en el denominador, lo
cual hace que el valor total aumente, claro esta, asumiendo que la actividad no
tenga una disminucin tan drstica como la protena) y del factor de purificacin,
mientras que el porcentaje de rendimiento disminuye. Esto no siempre se cumple,
pero es una tendencia general.

Como una forma de comprobacin de la purificacin enzimtica, se analizan las

diversas fracciones obtenidas en cada paso, en una tcnica analtica llamada:
electroforesis de protenas; la cual consiste en la separacin por peso molecular de
las protenas en una matriz mediante la ayuda de un campo elctrico. Aun con ello
esta tcnica analtica puede presentar isoformas (dos o mas protenas diferentes
con el mismo peso molecular) lo cual en una electroforesis convencional
(separacin por peso) no es concluyente; para ello la muestra debe ser sometida a
una separacin tanto por peso molecular, como por punto isoelctrico (valor de pH,
donde la carga neta o total de una protena es igual a cero(0)) dicha tcnica recibe
el nombre de Isoelectroenfoque.

Tcnicas de purificacin de protenas

Existen variadas tcnicas y metodologas para la purificacin de protenas, pero

cada una de ellas consiste en separar la enzima de inters de otras protenas y
macromolculas, manteniendo la mayor actividad enzimtica posible. Algunas de
las tcnicas mas comunes son:

(i) Separacin por precipitacin. (solubilidad diferencial)

(ii) Cromatografa por filtracin por gel.
(iii) Cromatografa por intercambio inico.
(iv) Cromatografa por afinidad.
(v) Ultrafiltracin.
Figura 32. Verificacin
1 2 3 4

KDa

de la purificacin por electroforesis de protenas SDS PAGE de la enzima

fructosiltransferasa (Ftasa) proveniente de la cepa Aspergillus niger AN166; 1-
Fraccin obtenida de cromatografa de intercambio inico Amberlys A-27. 2-
Cromatografia de exclusin por tamao Sephadex G-100. 3- Extracto crudo
proveniente de la fermentacin de la cepa Aspergillus niger AN166. 4- Marcadores
de peso molecular. Las condiciones de corrida fueron: dimensiones del gel de 7 x 8
cm y 0.75 mm de espesor, la electroforesis fue realizada bajo condiciones
reductoras SDS PAGE con un porcentaje de acrilamida del 11% (T) y bis-acrilamida
del 3.5% (C) para el gel separador; 6% de (T) y 3.5% de (C) para el gel concentrador.
Se corri a 100 V y 12 mA , estos ltimos constantes. Electroforesis realizada por el
autor.
Separacin por precipitacin (Solubilidad diferencial)

El principio bsico de esta tcnica es provocar una alteracin de alguna

propiedad del solvente original que promueva la precipitacin de la protena,
afectando su solubilidad, esta depende de tres factores principales: (i)
composicin y distribucin de sus aminocidos perifricos (una protena rica en
aminocidos hidrofbicos es en general menos soluble que una rica en
aminocidos polares), en general los aminocidos hidrofbicos tienden a
encontrarse en el interior de la molcula y los hidroflicos en la superficie; (ii) su
estructura tridimensional (las protenas fibrosas son en general menos solubles
que las globulares) y (iii) el entorno de la propia protena como la temperatura,
la constante dielctrica del medio, el pH, y la fuerza inica.

Las tcnicas basadas en la diferencia de solubilidad tienen gran capacidad de

procesamiento, bajo costo pero tambin baja resolucin, por lo cual su uso es
muy comn al inicio del proceso de purificacin.

La separacin por precipitacin se puede realizar por tres mtodos: (i)

Precipitacin por sales, (ii) Precipitacin por solventes orgnicos y (iii)
Precipitacin por polmeros.

Precipitacin por sales: Por aos, la adicin de sales neutras a los extractos
enzimticos para su purificacin y concentracin, ha sido la tcnica mas
utilizada. En la separacin por solubilidad diferencial, al adicionar el soluto, se
pueden presentar dos fenmenos importantes para la enzima a separar; (i) que
la protena presente una mayor solubilizacin en el solvente debido a la
interaccin de los grupos cargados que se relacionan a su vez con los iones de
la sal incrementando la densidad de carga con una mayor repulsin
intermolecular, este fenmeno es conocido como: solubilizacin por salado o
salting in. Lo contrario de esto es la (ii) precipitacin por salado o salting out,
los grupos hidrofbicos superficiales originan un ordenamiento de las molculas
de agua alrededor de estas zonas dando como resultado un estado ordenado
 termodinmicamente inestable que lleva a la agregacin y precipitacin de la
protena.

Las sales de iones divalentes como el cloruro de magnesio MgCl2, cloruro de

manganeso MnCl2, el sulfato de amonio (NH4)2SO4 entre otros, son mucho mas
eficientes tanto para la precipitacin o solubilidad de protenas que las sales de
iones monovalentes como el cloruro de sodio NaCl, cloruro de potasio KCl o
cloruro de amonio NH4Cl. La sal mas utilizada es el sulfato de amonio por su alta
solubilidad y el alcanzar fuerzas inicas muy elevadas.

Figura 33. Saturacin del sulfato de amonio en la presipitacin de una

proteina.

La tabla 16 muestra la cantidad de sulfato de amonio en gramos requerida para

llevar una solucin de volumen conocido de una saturacin inicial a una final. Si
tenemos 30 ml de extracto enzimtico el cual deseamos llevar al 25 % de saturacin
con sulfato de amonio, la cantidad en gramos de esta sal a agregar es: 4,02 g; si
posterior a esto requerimos llevar la misma solucin del 25 al 40% de saturacin la
cantidad de sulfato de amonio a agregar es de: 2,52 g de (NH4)2SO4.

Igualmente la cantidad de sulfato de amonio se puede calcular segn la formula:

 W= G(S2 S1)/ (1- (VG/1000)S2)

Donde:

W: peso de (NH4)2SO4 en gramos a adicionar.

G: peso de (NH4)2SO4 en gramos contenido en 1 litro de solucin saturada.
V: volumen especfico parcial del (NH4)2SO4 en la solucin saturada.
S2 y S1: son las fracciones de saturacin a completar.
Los valores de G y V se toman de la tabla 17

Tabla 16. Sulfato de amonio requerido para la precipitacin de una protena.

Esta tabla muestra la cantidad requerida de sulfato de amonio (NH4)2SO4 para
llevar una solucin de 1 litro con una concentracin inicial de saturacin, a una
final a cero (0) oC

Porcentaje de saturacin a 0 OC.

Concentracin 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
inicial de sulfato
de amonio Sulfato de amonio en gramos (g) requerido para adicional a 1 litro de solucin

0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697

5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662

10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627

15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592

20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557

25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 395 436 478 522

30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488

35 0 28 57 87 118 151 184 218 254 291 329 369 410 453

40 0 29 58 89 120 153 187 222 258 296 335 376 418

45 0 29 59 90 123 156 190 226 263 302 342 383

 50 0 30 60 92 125 159 194 230 268 308 348

55 0 30 61 93 127 161 197 235 273 313

60 0 31 62 95 129 164 201 239 279

65 0 31 63 97 132 168 205 244

70 0 32 65 99 134 171 209

75 0 32 66 101 137 174

80 0 33 67 103 139

85 0 34 68 105

90 0 34 70

95 0 35

100 0

Tabla 17. Soluciones de sulfato de amonio saturado a varias temperaturas

Temperatura (o C)
0 10 20 25 30
Moles de (NH4)2SO4 por 1000 g de H2O 5,35 5,53 5,73 5,82 5,91
Porcentaje en peso 41,42 42,22 43,09 43,47 43,85
Gramos de (NH4)2SO4 requeridos para saturar
706,8 730,5 755,8 766,8 777,5
1000 ml de H2O
Gramos de (NH4)2SO4 por 1 litro de solucin
514,7 525,1 536,1 541,2 545,9
saturada (G)
Molaridad de la solucin saturada 3,90 3,97 4,06 4,10 4,13
Densidad (g/cm3) 1,2428 1,2436 1,2447 1,2450 1,2449
volumen especfico parcial del (NH4)2SO4 en la
0,5281 0,5357 0,5414 0,5435 0,5458
solucin saturada

Precipitacin por solventes orgnicos: La adicin de solventes orgnicos

miscibles en agua como el etanol o acetona disminuye la solubilidad de la mayor
parte de las protenas, de tal manera que precipitan de la disolucin. El efecto
principal es la disminucin de la actividad del agua. El poder de solvatacin del agua
por la molcula hidroflica cargada, disminuye cuando la concentracin del solvente
orgnico aumenta y esto esta determinado por la disminucin en la constante
dielctrica o permitividad relativa () con respecto al agua que es 82.

Tabla 18. Constantes dielctricas o permitividad relativa de solventes

orgnicos

Permitividad
Material
relativa ()
Agua 82
Etanol 24
Metanol 33
cido frmico 58
n-propanol 20
cido actico 6,2
Isopropanol 18
Acetona 21
Acetonitrilo 37
Acetato de etilo 6,0
Cloroformo 4,8
Benceno 2,3

El solvente para la purificacin de protenas debe ser seleccionado en base a cinco

criterios: (i) miscible en agua (ii) no reaccionar con la protena (iii) tener un buen
efecto precipitante (iv) no desnaturalizar la protena y (v) no ser inflamable.

Precipitacin por polmeros no inicos: La precipitacin de protenas tambin

puede realizarse utilizando polmeros neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar
de sales o solventes. El mecanismo no est claramente establecido; sin embargo,
hay dos modelos para explicar el mecanismo el de Ogston y Laurent ; estos sugieren
que los polmeros excluyen a las protenas de parte de la solucin y reducen la
cantidad efectiva de agua disponible para su solvatacin.

El modelo de Ogston se basa en la teora termodinmica y concluye que los

sistemas pueden ser explicados en trminos de los coeficientes de interaccin
protena-polmero, y protena-protena de las especies presentes. El modelo de
Laurent se basa en un mecanismo de exclusin geomtrica de regiones hidratadas
de la protena por el polmero.

Caracterizacin enzimtica

La caracterizacin enzimtica se refiere al conocimiento de parmetros

especficos de una enzima como su peso molecular, su punto isoelctrico, Vmax ,
Km entre otros.

Tabla 19. Parmetros para el anlisis e identificacin de enzimas.

Parmetro de Anlisis para su identificacin

un enzima
Punto isoelctrico Isoelectroenfoque
Peso molecular Electroforesis SDSPAGE
Subunidades proteicas Combinacin entre electroforesis SDS PAGE
desnaturalizantes y reductoras.
Km, Vmax Ensayos cinticos
Secuencia Espectrometria de masas
pH, Temp, [S] ptimos Ensayos cinticos
Estabilidad a la temp, pH Ensayos cinticos
etc

Leccin 21. Cintica enzimtica

Uno de las medidas ms importantes en los trabajos con enzimas son los
parmetros cinticos cuyos ms representativos son: la constante de michaelis (Km)
y la velocidad mxima (Vmax ).

Para determinar estos parmetros se relaciona la concentracin de sustrato [S] junto

con la actividad enzimtica (U). La linealizacin de la grfica se puede realizar por
medio de tres formas: (i) Lineweaver Burk (ii) Eadie Hofstee y (iii) Langmuir, siendo
la ms utilizada la primera de ellas.

Linealizacin con Lineweaver Burk:

1/V= (1/Vmax)+ (Km/Vmax)*(1/S)

Linealizacin con Eadie Hofstee:

V= Vmax - Km(V/S)

Linealizacin con Langmuir:

S/V = (1/Vmax)*S + (Km/Vmax)

Ejemplo: Determine la velocidad mxima y el Km de las dos enzimas reportadas en

la tabla 4. Establezca cul de ellas tiene mayor afinidad por el sustrato.

Tabla 20. Variacin de la actividad enzimtica con respecto a la

concentracin de sustrato de dos enzimas invertasas.

Enzima 1 Enzima 2
Sustrato Actividad Actividad
(M)a (U) (U)
0 0 0
0,11 1,5 1
0,22 1,9 1,5
0,33 2,3 2
0,44 2,5 2,3
0,55 2,8 2,5
0,66 3 2,8
0,77 3 2,8
0,88 3,2 2,9
1,1 3,2 2,8
1,32 3,2 2,8
a) Concentracin molar de sacarosa en buffer fosfatos 50 mM a pH: 5.5.

la representacin grfica es la siguiente:

Figura 34. Relacin actividad enzimtica (U) con respecto a la variacin de sustrato
S.

Realizando la linealizacin por Lineweaver Burk tenemos:

Enzima 1
 1,35
1/V
1,15 y = 0,0843x + 0,2473

0,95
Enzima 2
0,75

0,55

0,35

0,15

-0,05-0,01 1,99 3,99 5,99 7,99 9,99 11,99

1/S

Figura 34. Linealizacin de la curva micheliana utilizando el mtodo de

Lineweaver Burk. El intercepto es: 1/Vmax, en el caso de la enzima 1: su valor es:
0,28; y la enzima 2 es: 0,24; despejando, los valores de Vmax son: 3,57 U enzima
1 y 4,16 U enzima 2.

La pendiente es: Km/Vmax; despejando tenemos: Km enzima 1: 0,15 M y 0,34

M para la enzima 2. Debido a esto la enzima 1 posee mayor afinidad por el sustrato
toda vez que presenta un Km menor que la enzima 2.

Leccin 22. Inmovilizacin

La inmovilizacin enzimtica es el proceso por el cual el movimiento de las enzimas,

en el espacio, se ve restringido total o Parcialmente, dando lugar a una forma de
enzima insoluble en agua. Los enzimas inmovilizados son enzimas unidos,
insolubilizados, soportados o ligados a una matriz.

Las enzimas inmovilizadas se dividen en dos grandes grupos: atrapadas y ligadas,

ver figura 3.
 Figura 35. Clasificacin de enzimas inmovilizadas.

Caractersticas de las enzimas inmovilizadas

Son caractersticas de las enzimas inmovilizadas las siguientes:

1. Permiten reutilizacin

2. Se obtienen productos ms puros

3. Posibilidad de implementar procesos continuos

4. Requieren control de Temperatura y pH

5. Posibilidad de contaminacin

6. Requieren planta especial

Figura 36. Aplicacin de enzimas inmovilizadas en la fabricacin de jarabes
glucosados a partir del almidn de maz. 1: Tanque de mezcla. 2: Reactor de
tanque agitado y recuperacin por filtracin. 3: Intercambiador de calor. 4: Reactor
de tanque agitado y recuperacin por filtracin. 5: Ultrafiltracin. 6: Evaporador.

Leccin 23. Enzimas industriales, usos frecuentes y mercado

Existen tres tipos de aplicaciones bsicas: (i) Procesos industriales, (ii) procesos
analticos y (iii) uso clnico.

En los procesos industriales muchas enzimas se utilizan en diversas partes ya sea

en proceso o como producto terminado, entre ellas encontramos:

1. Industria de Alimentos

2. Industria Farmacutica

3. Industria Textil

4. Industria de Detergentes
 5. Industria del Cuero

6. Biorremediacin y tratamiento de efluentes

las caractersticas de este tipo de enzimas son: (i) Uso masivo, (ii) Estructura simple,
(iii) preferiblemente extracelulares, (iv) estables y (v) sin requerimientos de
cofactores disociables.

Tabla 21. Enzimas industriales y sus aplicaciones en la industria de alimentos.

Campo
Enzima Fuente Usos frecuentes
Industrial

Glucoamilasa Microbiano, Obtenida Industria del Fabricacin de cerveza, industria

principalmente de los gneros: almidn y panificadora y produccin de
Aspergillus y Rhizopus. licorera alcohol.

Alfaamilasa Fngico: Aspergillus oryzae, Industria del Fabricacin de cerveza, industria

bacteriano: B. almidn y panificadora y produccin de
stearothermophilus, B. subtilis, licorera alcohol.
vegetal: cereales y animal:
pncreas.

Aminoacilasa Extrada de rin porcino, o Sntesis de Preparacin de L-aminocidos.

algunas cepas bacterianas del compuestos
genero Pseudomonas sp. orgnicos

Bromelina Extrada de la pia (Ananas Industria Ablandamiento de carnes y

camosus). crnica preparacin de jugos.

Papaina Obtenida del fruto inmaduro Industria Ablandamiento de carnes y

de la papaya (familia crnica preparacin de jugos.
cariccea).

Ficina Obtenida a partir del ltex de Industria Ablandamiento de carnes y

rboles tropicales del gnero crnica preparacin de jugos.
Ficus (familia moreceas).
Catalasa Fngico: principalmente Industria de Antioxidantes en alimentos
Aspergillus niger, bacteriano: grasas y preparados como mantequilla,
Micrococcus sp. y animal aceites. mayonesa y grasa animal.
(hgado, eritrocitos de origen
vacuno y porcino).

Glucosa oxidasa Microbiano, Obtenida Industria de Antioxidantes en alimentos

principalmente de los gneros: grasas y preparados como mantequilla,
Aspergillus niger, Penicillium aceites. mayonesa y grasa animal.
vitale y notatum.

Celulasa, xilanasa, Microbiana de los gneros: Industria de Clarificacin de jugos y

Trichoderma reesei y T. viride, jugos produccin de alcohol.
peptinasa Aspergillus flavus.

Glucosa isomerasa Microbiana de los gneros: Industria de Manufactura de jarabes

bebidas no fructosados.
Streptomyces, Aerobacter, alcohlicas
Lactobacillus.

Lactasa (Beta Microbiana de los gneros: Industria Utilizacin en suero de leche e

galactosidasa) lctea hidrlisis de lactosa.
Aspergillus oryzae y Torula
cumoris principalmente.

Lipasa Animal (pancretica), Industria de Incrementa el aroma y el sabor

Microbiano de los gneros: grasas y en quesos mantequillas, cremas,
Aspergillus, Rhizopus, aceites y chocolates y como
Gandida y Mucor. Vegetal harinera desengrasante de protenas.
semillas de algodn, ricino,
trigo, maz, entre otros.

Renina (quimosina) Microbiana (recombinante) de Industria Manufactura de quesos.

los gneros: Streptococcus, lctea
Lactobacillus, Aspergillus,
 Candida, Penicillium, Mucor,
Torulopsis y Rhizopus.

Fitasa Fngico: principalmente de Industria de Mejora la disponibilidad mineral

especies como: Aspergillus, cereales y al hidrolizar el cido ftico.
levaduras como: leguminosas
Saccharomyces y Peniophora,
y algunas bacterias: Bacillus,
Enterobacter, Pseudomonas.

Invertasa o sacarasa La beta fructosidasa es Industria Hidrlisis de la sacarosa,

producida por Levaduras azucarera. obtencin de azcar invertido.
Sacaromyces cerevisiae,
Candida. La alfa-glucosidasa
constituye las invertasas
intestinales y de hongos como:
Aspergillus oryzae.

Lisozima Origen animal: clara de huevo. Industria Manufactura del queso

lctea (preservacin)

Lacasa Especie de hongos: Pleurotus Industria de Aumento de la susceptibilidad del

eryngii, y ostreatus, Trametes frutas y pardeamiento durante el
villosa. vegetales. almacenamiento.

Pululanasa Microbiana, principalmente de Industria de Ataca los enlaces (16) del

los gneros: almidn almidn, liberando
oligosacridos de glucosa con
Bacillus acidopullulyticus. enlaces (14).

Glucosiltransferasas, Microbiano de los gneros: Industria de Obtencin de almidn modificado

Aspergillus niger, Leuconostoc almidn y de con propiedades funcionales
Fructosiltransferasas y Streptococcus. alimentos mejoradas, tales como mayor
funcionales solubilidad, baja viscosidad, y la
retrogradacin reducida.
Produccin de biopolmeros y
obtencin de
 fructooligosacridos (FOS) como
prebiticos.

Dextransacarasa Microbiano principalmente de Industrias Produccin de biopolmeros tipo

los gneros: Leuconostoc sp. lcteas, dextran que actan como
frutas y estabilizantes, viscosantes y
vegetales produccin de pelculas
comestibles.

Naringinasa, Microbiana de los gneros Industria de Actuan sobre compuestos que

Aspergillus niger. jugos causan el sabor amargo a los
Limoninasa ctricos. jugos ctricos.

En aplicaciones clnicas se utilizan por incorporacin en lnea del reactor enzimtico

con un aparato analtico convencional o por inclusin del sistema enzimtico como
parte del sistema analtico; sus caractersticas son: (i) alta especificidad, (ii) alta
sensibilidad, (iii) alta pureza, (iv) baja estabilidad en condiciones operacionales y (v)
alto costo.

En cuanto a las aplicaciones clnicas: algunas se utilizan para ayudas

convencionales como: (i) ayuda digestivos (Diastasa pancretica, (ii)
antiinflamatorios (Papana - Bromelina) y antimicrobianos (Lisozima); otras enzimas
son utilizadas en el tratamiento de enfermedades como: Enfermedades congnitas
hereditarias (suministro exgeno de la enzima deficitaria), remocin de metabolitos
potencialmente txicos (ureasa en riones artificiales) y tratamiento de ciertos tipos
de cncer (asparaginasa en ciertos cnceres sanguneos) entre otras.

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