Universidad Autnoma de Zacatecas

Francisco Garca Salinas

rea de Ciencias de la Salud

Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas

Qumico Farmacutico Bilogo

Biologa Molecular

Metodologas de la Ingeniera Gentica

Docente

Dra. Olga Yadira Barbosa Cisneros

Integrantes

60 A

Campus UAZ siglo XXI Km 6 Carretera Zacatecas-Guadalajara s/n. Ejido la

Escondida, C.P. 98160, Zacatecas, Zac
ndice

Contenido
Introduccin. ....................................................................................................................................... 1
DNA Recombinante. ............................................................................................................................ 2
Vectores. ......................................................................................................................................... 3
Aplicaciones..................................................................................................................................... 3
PCR. ..................................................................................................................................................... 5
PCR en Tiempo Real ........................................................................................................................ 6
Aplicaciones......................................................................................................................................... 7
Secuenciacin del DNA........................................................................................................................ 7
Southern Blot y Northern Blot. ........................................................................................................... 9
Microarray. ........................................................................................................................................ 10
Aplicaciones....................................................................................................................................... 10
Referencias. ....................................................................................................................................... 12
Introduccin.

En la biologa molecular existen infinidad de aplicaciones que a lo largo

de la historia nos han dado para poder realizar desde nuevas formas de tratar
una enfermedad, entender alguna enfermedad, poder comprender como el ser
humano es la maquina tan compleja que es.

La biologa molecular es una herramienta para poder entender el

comportamiento, que tiene el DNA, RNA y protenas en nuestro organismo, su
dogma central est enfocado a eso, que nos quiere decir, que todas las especies
del mundo hasta la fecha conocida pasan por estos procesos, tiene DNA que va a
ser replicado, transcrito, traducido y expresado en alguna funcin en especfico,
desde el color de su pelo, piel, tamao, hasta su comportamiento, modo de
reproduccin, un sinfn de funciones que sin la biologa molecular no se hubieran
descrito y descubierto, porque ya existan, solo faltaba entenderlas.

Hay herramientas en la biologa molecular que nos permiten comprender

el funcionamiento de todos estos procesos tan complejos, uno de los ms
importantes fue la tcnica de PCR, que gracias a ella se logr amplificar un
fragmento tan pequeo de DNA en una muestra lo suficientemente grande para
realizarle una cantidad enorme de pruebas que con un simple bulbo de un cabello
se puede realizar todo un estudio completo de pruebas moleculares.

Todo esto nos permite conocer ms el comportamiento del DNA, que nos
permitir determinar distintas aplicaciones, como clonacin, modificaciones de
genes para evitar la expresin de una enfermedad o a su vez tratamientos
gnicos para que se controle o cure una enfermedad evitando la expresin de
alguna protena. La ingeniera gentica nos da para eso y mucho ms como rama
de la ciencia que cada vez va avanzando en su aplicacin y como puede
implementar nuevas metodologas para la resolucin de los problemas del da a
da.

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DNA Recombinante.

La primera molcula de DNA recombinante fue creada por Paul Berg, a

comienzos de los 70. Para aquella poca, los bilogos moleculares haban
aprendido a alterar genes individuales, cortar y pegar pedazos de DNA de
diferentes organismos y moverlos de uno a otro.
Otros pioneros de esta tecnologa fueron Stanley Cohen, un genetista
estadounidense, y Herbert Boyer, un bioqumico de la misma nacionalidad.
Cohen estaba interesado en aprender cmo los genes de plsmidos otorgan
resistencia a las bacterias y Boyer trabajaba con enzimas de restriccin, por lo
que decidieron trabajar juntos en la combinacin de dos plsmidos resistentes a
antibiticos diferentes para crear una bacteria resistente a ambos.
DNA recombinante es una molcula que proviene de la unin artificial de
dos fragmentos de DNA. Por lo tanto, la tecnologa de DNA recombinante es el
conjunto de tcnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su
posterior manipulacin e insercin en otro diferente. De esta manera podemos
hacer que un organismo (animal,
vegetal, bacteria, hongo) o un virus
produzca una protena que le sea
totalmente extraa.
Su preparacin consiste en
la unin covalente, in vitro, del
inserto de DNA al vector cortado,
empleando una ligasa. La
especificidad de dicha unin
depende del tipo de extremos que
hayan resultado al preparar el
inserto y el vector: si son cohesivos,
su secuencia es la especfica de la
enzima de restriccin empleada y
slo se asocian los extremos
compatibles; una vez asociados por
emparejamiento de bases, la ligasa
establece la unin covalente
sellando las dos mellas.

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Vectores.

Pueden ser de distinta procedencia para poder realizar la tcnica como son:

Procedencia eucaritica y procaritica

Tamao del inserto que se admite.
El tipo de molcula a partir de la que se preparan:
o Plsmidos: bacterianos, de levadura o de plantas.
o Virus: que infectan bacterias (bacterifagos o simplemente
fagos), plantas, invertebrados o vertebrados.
o Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosmicos
de fagos (PAC), de bacterias (BAC) o de levaduras (YAC).
o Quimeras, es decir, molculas formadas combinando partes de
otras cuyo origen es diferente. Normalmente, quimeras de
plsmido y fago: csmidos, fagmidos, fsmidos.
El tipo de clula anfitriona en la que se puede luego incorporar el DNA
recombinante producido
El gen de resistencia incluido en el vector para su posterior deteccin o
seleccin

Tabla de tipos de Vectores

Aplicaciones.

Industria Alimentaria

El proceso para fabricar el queso confa generalmente en una enzima llamada el

cuajo, que contiene la quimosina. Sin Embargo, la DNA recombinante de la
quimosina ha sido funcionando desde 1990, y est gentico y estructuralmente
idntica a la enzima original, pero se puede producir en mayores cantidades y
un ms barato.

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Industria Farmacutica

Los pacientes Diabticos requieren a menudo inyecciones de la insulina humana

ayudar a niveles de mando de glucosa. Usando el DNAr para crear la insulina
humana.
La hormona de incremento humano recombinante se utiliza para el
incremento normal y el revelado de los pacientes con funcionamientos
incorrectos en la glndula pituitaria. Esto ofrece una ventaja sensible,
determinado cuando est puesta en contraste a los mtodos previamente usados
de obtener la hormona de los cadveres.
Los factores de Coagulacin de la sangre desempean un papel esencial
en la administracin de los pacientes que sufren de hemofilia-A. La capacidad de
fabricar el factor de coagulacin de la sangre recombinante VIII permite que las
mayores cantidades sean utilizadas en la prctica y reduce la necesidad de la
donacin de sangre de obtener el factor naturalmente.
La Hepatitis B es una infeccin del hgado que se puede prevenir con la
vacuna de la hepatitis B. La DNA Recombinante del antgeno de la superficie del
virus de la hepatitis B se produce en las clulas de levadura que se incluirn en
la vacuna.
Investigacin Mdica

La DNA Recombinante se ha utilizado en el revelado de las tcnicas diagnsticas

ms comunes para el VIH. La prueba del anticuerpo utiliza una protena
recombinante del VIH para medir los anticuerpos en el cuerpo que proliferan
cuando hay una Infeccin VIH. La prueba de la DNA utiliza la reaccin en
cadena reversa de polimerasa de la transcripcin (RT-PCR) para detectar la
presencia de material gentico del VIH.
Industria Agrcola

Algunas cosechas como soja, maz, canola, alfalfa y algodn, se crecen con la DNA
recombinante que aumenta resistencia a los herbicidas usados en el proceso
agrcola. El Glifosato es el herbicida sabido comn pues el Rodeo es ampliamente
utilizado entre granjeros para ayudar con el control de malas hierbas y los genes
recombinantes en las cosechas agrcolas permiten que crezcan sin ser afectado
por el herbicida.
Adems, los recientes desarrollos han permitido a las instalaciones
expresar un formulario recombinante de la protena de la toxina de BT producida
generalmente por Bacillus thuringiensis. Esto puede naturalmente controlar los
insectos que amenazan a cosechas agrcolas y se ha convertido en una prctica
comn en cultivar un huerto y el cultivo.

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PCR.

La PCR es una tcnica para la sntesis "in vitro" de secuencias especficas de

DNA. Es una forma simple y muy rpida de multiplicar el DNA presente en
diferentes muestras biolgicas, obtenindose millones de copias de una
determinada secuencia de DNA. En poco tiempo esta tcnica ha conseguido ser
ampliamente utilizada no slo en el campo de la gentica molecular, sino en otras
muchas ciencias. Las siglas PCR significan "Polimerase Chain Reaction",
Reaccin en Cadena de la Polimerasa.
El inventor de esta interesante tcnica fue Kary Mullis por la cual se le
adjudic el Premio Nobel de Qumica en 1993. Utiliz la PCR para la
amplificacin del gen de la b-globina humana (Mullis y colaboradores., 1986;
Mullis y Faloona., 1987) y el diagnstico prenatal de la anemia falciforme (Saiki
y colaboradores., 1985; Saiki y colaboradores., 1986; Embury y colaboradores.,
1987).
Mullis se bas en la replicacin del DNA en los organismos eucariotas
realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una
cadena complementaria de DNA en el sentido 5--3 usando un molde de cadena
sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin doble
cadena se usan los denominados cebadores (primers). Son una pareja de
oligonucletidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno
de los extremos 3 del fragmento de DNA que se desea amplificar.
Como ya se ha indicado, se requiere una sucesin de ciclos (en general
entre 20 y 40, de 1,5 a 5 minutos de duracin cada uno) formados por
desnaturalizacin, hibridacin y replicacin, para conseguir una enorme
amplificacin del nmero de molculas que contienen la secuencia de inters o
diana. La duracin total es cercana a 2 horas, dependiendo de las condiciones
experimentales concretas.
Cada ciclo de una PCR consta, pues, de tres etapas:
1. Desnaturalizacin: calentamiento para la separacin de las dos hebras del
DNA, mediante una incubacin breve (30-120 seg) a una temperatura
comprendida entre 68 y 97 C, que debe ser superior a la de la temperatura
melting de la regin de DNA que quiere amplificarse.
2. Hibridacin: enfriamiento rpido por debajo de Tm, de forma que se
permite el emparejamiento del DNA monocatenario de inters con los
oligoscebadores. En general se usan temperaturas comprendidas entre 37
y 65 C que se mantienen entre 10 y 120 seg.

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 3. Elongacin (o replicacin): etapa de amplificacin propiamente dicha (72-
75 _C, 1-3 min), en la que la
DNA polimerasa
termoestable elonga los
cebadores, empleando como
molde ambas hebras
originales. La replicacin
transcurre en direccin 5--3
a partir del extremo 3-OH de
cada cebador, empleando
como sustrato los cuatro
desoxirribonucletidos
trifosfatos (dNTP), hasta
terminar la lectura del molde
o hasta que se eleve la temperatura en una nueva etapa de
desnaturalizacin.

PCR en Tiempo Real

El principio de la tcnica se basa en la PCR punto final, slo que la forma en

cmo se detectan y analizan los productos de la amplificacin es diferente. El
trmino en tiempo real se refiere a que la deteccin de los productos amplificados
sucede en cada ciclo de la reaccin. Por su parte, el trmino cuantitativo hace
referencia a que es posible cuantificar la cantidad de DNA en la muestra, a
diferencia de la PCR punto final en donde no es posible detectar en tiempo real
ni cuantificar la secuencia blanco
Actualmente, la PCR en tiempo
real es el mtodo ms sensible para
detectar y cuantificar los cidos
nucleicos. Aun teniendo una cantidad
muy pequea de templado, el sistema
garantiza una alta sensibilidad,
especificidad y eficiencia. Una de sus
aplicaciones ms usadas es para
cuantificar cambios muy pequeos en la
expresin gnica mediante la deteccin
de los niveles del RNAm procedente de
clulas o tejidos.

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Aplicaciones.

Durante los ltimos aos, la PCR se ha convertido en una herramienta

importante para analizar el genoma humano. Adems de generar cantidades
grandes de templado para secuenciar, la PCR se ha utilizado para el mapeo de
cromosomas y para analizar cambios grandes y pequeos en estructura
cromosmica. Por ejemplo, la PCR lo ha hecho posible: Usar las secuencias
repetidas en el genoma como marcadores genticos. Genere sondas de
hibridacin especficas para cromosoma. Estudiar la evolucin de las
secuencias de un gen y los efectos de variabilidad de la secuencia en la funcin
del cromosoma. Amplificar e identificar las secuencias blanco in situ.

Secuenciacin del DNA.

La secuenciacin del DNA significa determinar el orden de los cuatro

componentes bsicos qumicos, llamados "bases", que forman la molcula de
DNA. La secuencia les informa a los investigadores la clase de informacin
gentica que se transporta en un segmento especfico de DNA. Por ejemplo,
pueden usar la informacin de las secuencias para determinar qu tramos de
DNA contienen genes y qu tramos transportan instrucciones regulatorias, que
activan o desactivan genes. Adems, y de manera muy importante, los datos de
las secuencias pueden resaltar los cambios en un gen que pueden causar
enfermedades.
En la doble hlice de DNA, las cuatro bases qumicas se unen siempre con
la misma pareja para formar "pares de bases". Adenina (A) siempre forma pareja
con timina (T); citosina (C) siempre forma pareja con guanina (G). Este
emparejamiento es la base para el mecanismo mediante el que las molculas de
DNA se copian cuando las clulas se dividen, y tambin es la base para los
mtodos usados en la mayora de los experimentos de secuenciacin de DNA. El
genoma humano contiene alrededor de tres mil millones de pares de bases que
detallan las instrucciones para crear y mantener a un ser humano.
Mtodos clsicos de secuenciacin del DNA.
Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico y enzimtico)
comparten etapas comunes.
Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar radiactiva o
fluorescentemente

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 Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de DNA
marcadas cuyos tamaos se diferencian en una nica base. Estas cadenas
de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles
desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen
como una escalera de bandas cuya longitud vara en un nico nucletido.
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:
Mtodo qumico de Maxam y Gilbert
Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.
Esta tcnica consiste en romper cadenas de DNA de cadena sencilla
marcadas radiactivamente con reacciones qumicas especficas para cada una de
las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por
electroforsis, en funcin de su tamao en geles de poliacrilamida donde la
secuencia puede leerse en base al patrn de bandas radiactivas obtenidas.
Mtodo enzimtico de Sanger
Este mtodo de secuenciacin de DNA fue diseado por Sanger, Nicklen y
Coulson tambin en 1977 y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena
o dideoxi.
Para este mtodo resulta esencial disponer de un DNA de cadena simple
(molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una regin del
DNA molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza
como sustrato de la enzima DNA polimerasa I que va a extender la cadena
copiando de forma complementaria el molde de DNA.
Como se ha estado nombrando tiene distintas aplicaciones al igual que el
PCR no tanto como una metodologa individual, sino que es complemento de todo
el pull de aplicaciones que se le da a la biologa molecular algunas aplicaciones
son:
Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin
Diagnstico de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto
previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro.
Una o dos clulas del pre-embrin se retiran en el estado de 8 a 16 clulas,
previo a la implantacin. Estas pueden utilizarse para amplificar un gen o genes
especficos y as estudiar la enfermedad gentica o el sexo (utilizando genes
especficos del cromosoma Y).
Proyecto Genoma Humano

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El Proyecto Genoma Humano es un proyecto internacional cuyo objetivo final es
obtener una descripcin completa del genoma humano a travs de la
secuenciacin del DNA. El genoma que se investiga es el genoma nuclear.
Desde su inicio, el proyecto ha sido justificado especialmente por los
beneficios mdicos que se espera obtener del conocimiento de la estructura de
cada gen humano. Esta informacin proporcionar una capacidad de diagnstico
en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad.
Tambin se espera que aporte un marco de trabajo para el desarrollo de nuevas
terapias, adems de nuevas estrategias para la terapia gnica.

Southern Blot y Northern Blot.

Southern Blot
Fue desarrollada por Edwin M. Southern, al que debe su nombre (Southern blot).
Es una tcnica simple y fcil de realizar que detecta fragmentos de DNA,
separados por tamao mediante electroforesis en gel. Combina la separacin
electrofortica del DNA con su transferencia a un soporte slido o filtro (nailon
o nitrocelulosa) para su hibridacin.
Metodolgicamente, implica cinco etapas bien diferenciadas: separacin
electrofortica, desnaturalizacin, transferencia, hibridacin y deteccin:

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Northern Blot
A diferencia del caso anterior, su nombre (northern blot) no corresponde al de
ningn investigador, sino a un simple juego de palabras (southern = del sur,
northern = del norte). El procedimiento es idntico, pero el cido nucleico
analizado es RNA. Por su menor tamao, puede no ser necesaria su
fragmentacin con endonucleasas, pero debe tenerse especial cuidado para evitar
la accin de RNasas, tanto endgenas como exgenas (contaminacin muy
comn, incluso por las manos del analista, y difciles de inactivar). El uso de
agentes desnaturalizantes sigue siendo necesario para evitar emparejamientos
intracatenarios, que alteraran el patrn de separacin por tamao.
La tcnica de hibridacin northern se emplea principalmente para obtener
informacin sobre el tamao de RNA y sobre el modelo de expresin de genes
especficos. stos, una vez clonados, pueden utilizarse como sondas para hibridar
con muestras deRNAaisladas de una variedad de tejidos diferentes, y as conocer
los tipos celulares en los que se expresa el gen, la abundancia relativa y tamao
de los transcritos, y diversos detalles de su procesamiento posterior.

Microarray.

Un chip de DNA (del ingls DNA microarray) es una superficie slida a la cual
se une una coleccin de fragmentos de DNA. Las superficies empleadas para fijar
el DNA son muy variables y pueden ser de vidrio, plstico e incluso de silicona.
Los chips de DNA se usan para analizar la expresin diferencial de genes, y se
monitorean de manera simultnea los niveles de miles de ellos. Su
funcionamiento consiste, bsicamente, en medir el nivel de hibridacin entre la
sonda especfica (probe, en ingls), y la molcula diana (target), y se indican
generalmente mediante fluorescencia y a travs de un anlisis de imagen, lo cual
indica el nivel de expresin del gen.

Aplicaciones.

En el cncer
La formacin de tumores implica cambios simultneos en cientos de clulas y
variaciones en los genes. Microarray puede ser una bendicin para los
investigadores, ya que proporciona una plataforma para la prueba simultnea
de un gran conjunto de muestras genticas. Ayuda en la identificacin de
polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) y mutaciones, clasificacin de
tumores, identificacin de genes diana de supresores de tumores, identificacin

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de biomarcadores de cncer, identificacin de genes asociados con
quimiorresistencia y descubrimiento de frmacos.
Microarrays de genes se han utilizado para la hibridacin genmica
comparativa. En esta tcnica, el DNA genmico se marca fluorescentemente y se
usa para determinar la presencia de la amplificacin gnica. Se ha utilizado la
hibridacin genmica comparativa basada en matrices (aCGH) para mapear
anomalas genticas en una amplia gama de tumores, incluyendo carcinoma de
mama, carcinoma de vejiga, carcinoma de trompas de falopio, carcinoma
gstrico, melanoma, y linfoma. Los datos de expresin gnica pueden identificar
grupos de casos con resultados significativamente diferentes cuando el examen
histopatolgico de rutina no permite la subclasificacin.
Tratamiento antibitico
El aumento en el nmero de bacterias resistentes y las sepsis ha llevado al
fracaso de los antibiticos. La virulencia de las cepas bacterianas tambin afecta
el resultado del proceso de la enfermedad. En la cavidad oral, donde las bacterias
anaerobias pueden ser el agente infeccioso, a menudo no son fcilmente
cultivadas, especialmente organismos como actinomices. El anlisis de
microarrays de DNA ayuda a que el DNA genmico bacteriano a menudo
sobrevive a la viabilidad de las bacterias y un diagnstico se puede hacer con una
pequea cantidad de DNA, en contraposicin al gran nmero de bacterias
necesarias para el cultivo.
Deteccin precoz de lesiones precancerosas orales
Leucoplasia o lesiones blancas de la cavidad oral pueden resultar de una mirada
de condiciones reversibles. Actualmente, el examen microscpico no logra
identificar el pequeo subconjunto de estas lesiones que evolucionan al cncer
oral. La identificacin de perfiles de expresin gnica o "huellas dactilares
genmicas" permitir a los mdicos diferenciar lesiones blancas inofensivas de
lesiones precancerosas o de cncer muy temprano. Estudios recientes han
ilustrado la efectividad de microarrays en el cncer oral. En el futuro, las
muestras tomadas de una biopsia incisional o una biopsia con cepillo pueden ser
un laboratorio para el anlisis de la expresin gnica. El diagnstico precoz y el
tratamiento del cncer oral se correlacionaron con el aumento de la
supervivencia. La identificacin y el tratamiento de las lesiones orales
premalignas y precoces cancerosas pueden convertirse en uno de los servicios
ms valiosos en el futuro.

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Referencias.

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