(Junio/Julio, 2017)

REMEDIACIN DE AGUA CONTAMINADA CON SULFATO DE

COBRE (CuSO4) POR CULTIVOS DE BACTERIA DEL SUELO

REMEDIATION OF WATER CONTAMINATED WITH SULFATE OF COPPER

(CUSO4) FOR CULTIVATION OF THE SOIL BACTERIUM

Renata Arias, Martn Ponce; Tatiana Tafur; Astrid Valdivia

Universidad Cientfica del Sur, Facultad de Ciencias Ambientales
RESUMEN
El objetivo del trabajo fue estudiar el uso de bacterias obtenidas de muestra de
suelo de Tarma en la detoxificacin de suelos con Cu. Se evalu el
crecimiento y desarrollo de estas bacterias nombradas B1 y B2 con distintas
concentraciones de Cu, en diferentes tiempos y condiciones de trabajo. La
bacteria fue capaz de reducir Cu trabajando con concentraciones de 5mM y
10mM. Mostrando asi que la bacteria B1 capta ms concentracin de Cu en
menos tiempo que la Bacteria B2. Se comprob la adaptabilidad de la cepa
para adoptar como mecanismo de detoxificacin, la biorreduccin del metal
pesado. Los resultados obtenidos demuestran la posibilidad de utilizar estas
bacterias obtenidas de Tarma en la biorremediacin de un efluente industrial
conteniendo Cu.
ABSTRACT
The aim of this project was to study the use of bacteria obtained from Tarma
soil samples in soil detoxification with Cu. The growth and development of these
bacteria named B1 and B2 with different concentrations of Cu, in different
evaluated in different work times and conditions was evaluated. The bacteria
were able to reduce Cu by working with concentrations of 5mM and 10mM.
Thus showing that the bacterium B1 captures more concentration of Cu in less
time than the bacteria B2. The adaptability of the strain was verified to adopt as
detoxification mechanism, the bioreduction of the heavy metal. The results
obtained demonstrate the possibility of using these bacteria obtained from
Tarma in the bioremediation of an industrial effluent containing Cu.
Palabras claves: bacterias; biorremediacin; cobre; EDTA Keywords: bacteria;
bioremediation; copper; EDTA

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INTRODUCCIN

En el Per, el impacto ambiental de lo contaminantes metlicos en suelos y

sedimentos es estrictamente dependiente de la capacidad de acomplejamiento
de estos con componentes del ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoqumicas y biolgicas de su entorno. (Garca & Dorronsoro, 2002).

Los metales pesados son considerados como peligrosos debido a su elevada

tendencia a bioacumularse. La bioacumulacin es el aumento de la
concentracin de un producto qumico en un organismo biolgico en un cierto
plazo, de forma que llega a ser superior a la del producto qumico en el
ambiente (Vardanyan e Ingole, 2006). El cobre se encuentra principalmente en
forma de compuestos minerales en los que el Cu constituye el 69,1 % y el 65
Cu el 30,9 % del elemento.

El cobre est ampliamente distribuido en todos los continentes y forma parte de

la mayora de los organismos vivos. Generalmente se extrae en forma de
sulfuros, como es el caso de la covelita (CuS), la calcocita (Cu2S), la calcopirita
(CuFeS2) y la bornita (Cu3FeS3); o de xidos, como la malaquita
(Cu2CO3(OH)2); la crisocola (CuSiO32H2O) y la calcantita (CuSO45H2O).

El Cu es uno de los metales traza ms abundantes, es un micronutriente de

gran importancia en la produccin agrcola y se produce como Cu + y como
Cu2 + (Luo y Christie, 1998). Niveles potencialmente txicos de Cu en suelos
estn generalmente asociados con enmiendas de lodos de depuradora y con
fungicidas cpricos como las sales de cobre (Adriano, 2001). Las
concentraciones de Cu en la solucin del suelo son extremadamente bajas, con
ms del 98 % del mismo unido a materia orgnica, independientemente del pH
(Sauve y col. 1997).

Mediante la minera, se obtienen productos que son esenciales para la

subsistencia de la humanidad, uno de ellos es el cobre, que tienen mltiples
aplicaciones, principalmente como conductor elctrico. Sin embargo, si la
extraccin de metales se desarrolla sin las medidas de control adecuadas,
puede tener un impacto negativo en el ambiente y en la calidad de vida de los

2
organismos que habitan en zonas aledaas. Solo los microorganismos que
portan sistemas genticos que contrarrestan los efectos txicos de los metales
son capaces de sobrevivir en ambientes con elevadas concentraciones de esos
elementos. (Argenbio; 2014)

En el Per, la contaminacin del agua ha estado en el centro de los principales

conflictos socioambientales, y en su mayora relacionada con la minera. Una
de las principales causas del conflicto en nuestro pas. La contaminacin
causada por metales pesados en aguas superficiales ha sido siempre un
problema muy grave, ya que estos elementos no son biodegradables y se
acumulan en los tejidos vivos. El objetivo principal fue evaluar la lixiviacin del
CuSO4 por la presencia de bacterias remediadoras sometidas a estrs por este
compuesto. Haciendo uso de mtodos microbiolgicos y analticos para cultivar
y analizar las muestras.

MATERIALES Y MTODOS

En las pruebas realizadas en laboratorio, se estudi el crecimiento de dos tipos

de bacterias aisladas. Estas se encontraron en la muestra recogida a orillas de
la laguna Concn, ubicada a 4200 msnm en el distrito de Palcamayo de la
provincia de Tarma, Junn. A travs del mtodo de diluciones el cual se efecta
cuando la concentracin es alta, se realiz una secuencia de 1:10,
alcanzndose diluciones de 10-6. Finalmente se tom pequeas alcuotas de la
dilucin a 1:10000 y lo sembramos en agares ACA y AN. (Vermelho, 2006).
Una vez realizada la incubacin, las bacterias de ACA y AN fueron cultivadas
en la prueba bioqumica de LIA (Galen, 2009)

Los tipos de bacterias nombradas B1 (ACA) y B2 (AN), fueron incubadas en

tubos Falcon con 40 ml de caldo nutritivo durante una semana a temperatura
de 37C, ya que al ser bacterias mesfilas presentan una temperatura ptima
entre los 25 - 45C (Snchez, 2015). Al transcurrir una semana, se prepar 1L
de caldo nutritivo. Se separaron 180ml para el control de B1 y B2. Se agreg
10 ml de cada una de las muestras con 90 ml de caldo nutritivo

3
respectivamente en botellas de plstico de 500ml. Con el caldo nutritivo
restante se pas a preparar una solucin con cobre a 5mM haciendo uso de
CuSO4 (s). Fueron tomados 90ml de la solucin con cobre a las cuales se le
aadi 10ml de los cultivos de bacterias y se realizaron tres repeticiones en
botellas de plstico de 500ml. Cada repeticin fue sellada con parafilm para
mantenerlos en un medio anaerobio a temperatura de ambiente.

Mtodo del EDTA

Para la preparacin de las muestras a titular se agreg en el matraz 1 ml de las
bacterias sometidas a cobre, adems se agreg 9 ml de H2O, ms 4 gotas de
NaOH y ms una pizca de NET. Luego se coloc en la bureta 50 ml de EDTA
y se fue tomando nota del gasto de cada una de las ocho titulaciones, donde la
solucin cambiar de un color rosado para azul en el punto final de titulacin.
El EDTA es un titulante hexadentado complejometrico, se usa debido a que
forma quelatos muy estables con la mayora de metales y reacciona con los
cationes independientemente de la carga del metal. Es por ello que las
titulaciones con el EDTA se llevan a cabo a pH controlado para evitar
interferencias y para asegurar que el indicador trabaje adecuadamente. (UNCA,
2010)

Tincin Gram
Para identificar la morfologa bacteriana de los ocho cultivos, se us el mtodo
de tincin de Gram. Primero se fij la muestra, despus de fijar la muestra al
calor agregamos 1 gota de cristal violeta x 1 min el cual tiene afinidad con el
peptidoglicano de la pared bacteriana. Enjuagamos con agua y agregamos 1
gota de Lugol x 1 min. Enjuagamos y agregamos 1 gota de alcohol x 30 seg.
Enjuagamos y por ltimo agregamos 1 gota de safranina x 1 min,
posteriormente enjuagamos. Una vez realizada la coloracin, dejamos secar la
muestra por 5 minutos. Finalmente, la muestra fue llevada al microscopio para
identificar su morfologa; dicha muestra fue enfocada a 100X con aceite de
inmersin.
De esta manera las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram
negativas se presentan morfolgicamente como cocos o bacilos, sin embargo;
al ejecutar tincin de Gram se identifica su grupo taxonmico, las Gram

4
positivas se tien de color violeta, debido a que contienen una pared gruesa de
peptidoglicano y gran cantidad de cidos teicoicos que permiten fijar y retener
rpidamente el colorante inicial el cual es, el cristal violeta, y adems son
resistentes a la decoloracin. Mientras que las Gram negativas se tien de
color rosado. (Lpez, 2014)

RESULTADOS

SE HIZO UNA CIERTA COMPARACION MACROSCPICA DE LAS

BOTELLAS ANTES Y DESPUES DE LAS 72 HORAS
Lo que se quiere observar aqu es la diferencia de tonalidades, turbidez, algn
tipo de precipitado, algunos microorganismos que hayan aparecido durante el
transcurso de las 72 horas dadas

Tabla 1

CONTROL ANTES DE LAS 72h CONTROL DESPUS DE LAS 72h

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Observando con respecto la tabla 1, se puede ver mucha diferencia de
tonalidades, podemos observar que el control B1 cambia notablemente de un
tono claro a uno ms turbio y se torna un amarillo ms oscuro, mientras que en
el control B2 muestra un color cristalino amarillento, y cambia a un color blanco
y turbio.
Tabla 2

MUESTRA B1 Y B2 ANTES LAS 72h MUESTRA B1 Y B2 DESPUS LAS

72h

Se observa en la tabla 2, que comienza con un color verde cristalino, y despus

de las 72h se muestra un verde oscuro con un precipitado en la superficie del
lquido.

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OBSERVACIN MICROSCPICA EN FROTIS FRESCO

OBSERVACIN DESCRIPCIN

CONTROL 2 5Mm de Cu
Se observa un tincin gram positiva,
con bacterias dispersas de bacilos

B1- R1 5Mm de Cu
Se muestra una tincin gram
negativo , con colonias muy juntas en
algunas esquinas de bacterias tipo
bacilos de tamao pequeos y muy
delgados

B2 R3 5Mm de Cu
Se observa una tincin gram positivo
, con muy escasas bacterias de tipo
bacilos

7
B1 R3 5Mm de Cu
Se muestran una tincin positiva, con
bacterias dispersas de tipo bacilos y
diplobacilos , tambin hay colonias
juntas en pocas cantidades de
bacterias

B2 R2 5Mm de Cu
Se observa una tincin gram positiva,
con bacterias dispersas y algunas en
colonias, de tipo bacilos, en pocas
cantidades estreptobacilos y
diplobacilos

B2 R1- 5Mm
Se observa una tincin gram positiva,
aqu hay bacterias dispersas en
pocas cantidades de tipo bacilos y
cocos

8
 CONTROL 1 5Mm
Se muestra una tincin gram positiva,
con colonias de bacterias sobre
pobladas de tipo bacilos.

CONTROL 1 EN AGAR 10 Mm
Se muestra una tincin gram positiva
con bacterias dispersas de tipo
bacilos

ANALISIS DE MUESTRAS DE BACTERIAS SOMETIDAS POR ESTRS DE

COBRE DURANTE 72h
En la figura 1 se muestra las concentraciones de cobre obtenidas tras realizar
titulacin por EDTA. Se puede ver que si hay cambios en las tres repeticiones
tanto de la bacteria 1 (B1) como en la bacteria 2 (B2). Las concentraciones de
disminuyen para las 120 horas de incubacin a 20C (Temperatura en el
laboratorio de Microbiologa 1).

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 Figura 1. Concentracin de Cobre (Cu) de las muestras por da.

A travs de herramientas estadsticas se obtuvieron los promedios de la

biotransformacin del cobre de la B1 y B2, para luego poder realizar una
grfica de dispersin mostrada en la figura 2. Comparando ambas bacterias y
realizando una lnea de tendencia de ambas, se puede ver que ambos
microorganismos son capaces de biotransformar la molcula de cobre y reducir
su concentracin inmovilizando este metal.

Como se puede observar B2 es ms eficiente para reduciendo la concentracin

de cobre en la muestra lquida, ya que presenta una lnea de tendencia con una
pendiente de -71.875, la cual al ser un nmero menor, es ms pronunciada que
el -63.889 de la B1. Por ende, se podra estimar que con el pasar del tiempo,
B2 remediaria con mayor rapidez un espacio contaminado.

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Figura 2. Grafica de concentracin de Cu vs el tiempo en horas de B1 y B2

Concentracion de Cobre (Cu) en horas de

Bacteria 1 y Bacteria 2
8000.00

7000.00
6833.33 6833.33
6366.67 6466.67
Concetracion de Cu mg/L

6000.00
y = -63.889x + 11633
B1
5000.00
B2
y = -71.875x + 12339
Linear (B1)
4000.00
Linear (B2)
3300.00
3000.00 3016.67

2000.00
60 70 80 90 100 110 120 130
Horas

ELABORACIN PROPIA
Al comparar la concentracin de cobre final con la inicial de ambas bacterias y
restando la concentracin control de cobre, se obtuvieron los datos de la figura
3. Esta figura nos muestra lo que sera la cantidad de cobre inmovilizado por
ambas bacterias. En este caso la B1 presenta una mayor cantidad debido a
que su control present mayor presencia de cobre.

Figura 3.- Total de cobre biotransformado por B1 y B2 en mg/L

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La figura 4 nos muestra el porcentaje de Cu absorbido por las bacterias, B1
tuvo un mayor porcentaje de absorcin mientras que la B2 tuvo
aproximadamente un 10 % menos. Estos resultados se obtuvieron con la
siguiente ecuacin.

= %

Donde, Co = concentracin inicial del soluto, mg/L
Cf = concentracin final del soluto, mg/L

Figura 4.- % de absorcin de Cu de la Cepa de Bacterias 1 y 2

% de Absorcin de
Cu

B1 53.35051546

B2 48.16753927

DISCUSIONES

Al no contar con un espectrofotmetro de absorcin atmica en llama para la

determinacin de cobre en nuestras muestras se realiz el mtodo de titulacin
con EDTA. Las disoluciones de EDTA son valiosas para la titulacin porque se
combina con los iones metales en proporcin 1:1 independientemente de la
carga del catin. El EDTA es un reactivo notable no solo porque forma quelatos
con todos los cationes (excepto los metales alcalinos), sino tambin porque
muchos de esos quelatos tienen la estabilidad suficiente para llevar a cabo las
valoraciones. Esa considerable estabilidad resulta de los diversos sitios
complejos de la molcula que da lugar a una estructura de jaula, en la que el
catin queda rodeado de manera efectiva y aislada de molculas de disolvente.
(Diaz, 2011)

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Existen tres posibilidades por las cuales se redujo la concentracin del cobre
en nuestro medio lquido al 5mM. El primero es el del fenmeno de biosorcion,
luego el de lixiviacin y precipitacin

La biosorcin es un fenmeno ampliamente estudiado en la biorremediacin de

diversos metales pesados como el cadmio, cromo, plomo, nquel, zinc y cobre
(Liu, 2003). El fenmeno de biosorcin consiste en un incremento de la
concentracin de los metales sobre la superficie o en el interior de la clula a
travs de variados mecanismos de los cuales, sin dudas, el ms importante es
el mecanismo de intercambio inico, donde el microorganismo acta de modo
semejante a una resina de intercambio inico (Davis y col, 2003; Veglio y
Beolchini, 1997; Vullo, 2003; Whiteley y Lee, 2006). La biosorcin es un
fenmeno ampliamente estudiado en la biorremediacin de diversos metales
pesados como el cadmio, cromo, plomo, nquel, cinc y cobre. (Liu, 2003)

Bioprecipitacin: ciertos metales pesados pueden ser inmovilizados

eficientemente debido a la accin de bacterias con la capacidad de reducirlos a
un estado redox menor, reduciendo la biodisponibilidad de estos elementos
(Valls & De Lorenzo, 2002). Este fenmeno se conoce como reduccin
biolgica, y es reconocido como un proceso metablico importante que controla
el transporte y el destino de los metales pesados en el suelo (Tabak et al.,
2005; Volke-Seplveda et al., 2005).

Biolixiviacin (heterotrfica y autotrfica): el proceso de biolixiviacin

heterotrfica consiste en la acidificacin del medio por la movilizacin de
protones a travs de la membrana plasmtica, ocasionando una liberacin de
metales a travs de varias rutas; i.e. la competencia entre protones y metales
en un complejo metal-anin o cuando se encuentran en una forma asimilada
con algn otro elemento, lo cual genera una liberacin de cationes metlicos.
Tambin el metabolismo heterotrfico puede ocasionar lixiviacin debido a la
produccin de cidos orgnicos y siderforos (Gadd, 2004).

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De estos tres mtodos el que ms se acerca a nuestro proyecto es el de
bioabsorcin. La bioabsorcin es una propiedad de la biomasa, en particular la
microbiana, de inmovilizar y concentrar metales en soluciones acuosas (Brady
y Tobin, 1995; Volesky y May-Phillips, 1995; Lpez et al., 2000). Los
componentes de la superficie celular que actan como bioabsorbentes son
polmeros estructurales y extracelulares con un alto contenido de grupos
funcionales (polianiones), que interactan con los metales (Churchill et al,
1995), atrapndolos dentro de su estructura. Las ventas de la bioabsorcin se
encuentran (Churchill et al., 1995; Gutnick y Bach, 2000): La recuperacin
selectiva de metales valiosos en bajas concentraciones, en nuestro caso que
recuperamos el Cu en una concentracin de 5mM; la posibilidad de definir si
las concentraciones de metales que quedan en los efluentes cumplen con las
regulaciones para la calidad del agua; la bioabsorcin, constante en amplios
intervalos de temperatura y pH, a temperatura del laboratorio de microbiologa
1; es una tecnologa econmica, que requiere poco capital y tiene bajos costos
de operacin; los metales absorbidos se pueden recuperar de forma eficiente
(tratamiento cido) y minimizando el desecho; y se puede utilizar la biomasa de
desecho generada en procesos de fermentacin a gran escala.

Al observar los resultados en la figura 4, la B1 tiene un porcentaje de absorcin

del 53.35% y la B2 de un 48.17%, estos porcentajes se acercan al 61% de
remocin de cobre que logra realizar las bacterias de la especie Pseudomonas.
(Leung et al. 2000).

Al observar la tincin gram de la B1 y B2 se puede ver que las colonias que

pueden sobrevivir y absorber el cobre son en su mayora Gram positivas.
La interaccin inicial entre los microorganismos y los metales, ocurre por
atraccin electrosttica entre los iones cargados en solucin y los grupos
funcionales de la superficie celular microbiana. En las bacterias Gram-positivas,
que toman el color del cristal violeta durante la tincin de Gram (Beveridge,
1990; Madigan et al., 1997), la pared celular constituye el primer frente de
interaccin con las molculas presentes en el ambiente. Las especies Gram-
positivas presentan una pared celular cargada negativamente, aunque tambin
contiene cargas positivas en menor nmero. Los sitios aninicos son el

14
carboxilato del peptidoglicano y el fosfato del cido teicoico, mientras que los
sitios catinicos son los grupos amonio de la D-alanina (cido teicoico), los
grupos amino de los azcares (glicano) y del cido diaminopimlico (porcin
pept- dica del peptidoglicano). Estos grupos son las porciones inicas que
sirven de mediadoras entre la pared celular y los iones metlicos (Doyle et al.,
1980; Doyle, 1989)

La mayora de las especies metlicas que se acumulan en las clulas

bacterianas pueden ser transformadas a compuestos de menor toxicidad por
ciertos complejos enzimticos. A nivel del microorganismo, hay un lmite para la
cantidad de metal que se puede acumular sin perder la viabilidad y, por lo
general, antes de llegar a concentraciones letales se activan los mecanismos
de resistencia y se induce la sntesis de enzimas transformadoras o de
protenas enlazadoras de los metales (Silver, 1994)

CONCLUSIONES

En la liberacin del cobre a partir de obtencin de bacterias de un suelo en una

muestra liquida, cambios en la temperatura de extraccin de la muestra no
influyen en el proceso, ya que la relacin que tiene es el tiempo dejado y de
acuerdo a ello, estas actuaban segn la capacidad de reproducirse y que tan
efectivas pueden ser. Segn VII Congreso de Medio Ambiente /AUGM 24 a
mayor concentracin y mayor tiempo de incubacin se puede obtener un buen
porcentaje de extraccin del metal desde muestras contaminadas, pero en el
caso de ser tiempos muy cortos y con concentraciones ms bajas, se puede
observar una extraccin significativa de cobre.

Tambin se puede observar la cantidad de bacterias por microscopio con

respecto a las B1, que hay una sobrepoblacin dando as que tienden a
reproducirse con facilidad, son ms resistentes y actan en menor tiempo a
capturar las concentraciones de cobre de la muestra de suelo a comparacin
de las bacterias B2.

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BIBLIOGRAFA

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