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LES METHODES DE DOSAGE DES PRINCIPALES

VITAMINES HYDROSOLUBLES (1)


Jean Adrian

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Jean Adrian. LES METHODES DE DOSAGE DES PRINCIPALES VITAMINES HY-
DROSOLUBLES (1). Annales de zootechnie, INRA/EDP Sciences, 1956, 5 (4), pp.295-334.
<hal-00886658>

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LES MTHODES DE DOSAGE DES PRINCIPALES
VITAMINES HYDROSOLUBLES (1)

PAR

Jean ADRIAN
Attach de Recherches au C. N. R. S.
laboratoire de Biochimie de la Nutrition (Bellevue).

A. -
INTRODUCTION

Bien que de dcouverte souvent trs rcente, les vitamines hydro-


solubles ont suscit un grand nombre de mthodes de dosages, bases
sur des principes varis.
A cette abondance et cette diversit on peut voir plusieurs raisons :
-
la recherche des rsultats spcifiques a multipli les mthodes
et les modalits opratoires ;
-
on ne cherche pas toujours le mme rsultat : tantt on dsire

doser une molcule chimique dfinie (industrie pharmaceutique), tantt


on sintressera lefficacit vitaminique (dans le cas dun aliment par

exemple) ;
-

enfin, la multiplicit des mthodes est avant tout redevable


des progrs que lon a fait dans la connaissance biochimique des vita-
mines.
Cette connaissance sest faite en 3 tapes principales, et chacune
delles correspond un type de mthode de dosages :
a) la premire tape a t marque par la dcouverte des symptmes
cliniques davitaminoses et lattribution de ces maladies des carences
alimentaires.
A cette poque, on mesurait la valeur vitaminique des aliments
en recherchant leur efficacit protger les animaux (cobaye, souris, rat)
de lavitaminose, ou, au contraire, restaurer ces animaux aprs les avoir
carencs.
Les rsultats de ces mthodes biologiques sont exprims en units mal
dfinies, et surtout chaque laboratoire possde ses Units propres.
b) Ensuite les biochimistes ont dcouvert les molcules chimiques
des diverses vitamines, acide ascorbique, thiamine, riboflavine, etc.
On a pu alors doser ces molcules dans les aliments et les divers

)
1
( 6 la Maison de la Chimie,
Cours-confrence donn le y mai 195 sous les auspices du Centre
de perfectionnement technique.
matriaux, et les rsultats de ces mthodes chimzques sont exprims en
milligrammes de thiamine, ou riboflavine, etc.
I,es rsultats sont donc comparables dun laboratoire lautre,
et les mthodes sont plus spcifiques.
c) P;nfin, rcemment, il a t mis en vidence que lefficacit vita-
minique dun aliment tait la rsultante de lactivit dun ou plusieurs
corps chimiques, les uns possdant une activit vitaminique plus ou
moins grande par rapport la vitamine elle-mme (famille B6 et acide
folique), les autres possdant des proprits anti-vitaminiques (thia-
minase).
Paralllement, se sontdveloppes des .mthodes mic
obiologiques
y
de dosages vitaminiques, qui permettent de mesurer une efficacit bio-
logique laide de souches bactriennes diverses.
Il existe ainsi actuellement 3 grands types de dosages vitaminiques :
biologique, chimique et microbiologique. Nous allons les passer succes-
sivement en revue, mais auparavant nous rappelons les principales carac-
tristiques physiques des vitamines hydrosolubles. Quelle que soit la
mthode adopte, il faudra en effet se placer dans des conditions qui
respectent lintgralit de la vitamine.
B. -
LES MTHODES BIOLOGIQUES

Ce sont les mthodes les plus anciennes et en mme temps celles qui
refltent le mieux lefficacit vitaminique dun chantillon. Elles sont
bases sur la prvention ou la gurison dun animal soumis un rgime
carenc.

1! Gnralits

On utilise dans cette technique le Rat pris au sevrage ou le Poussin


dun jour, cest--dire des animaux nayant pas encore accumul de
rserves vitaminiques propres. I,e dosage de lacide ascorbique faisant
exception car il emploie des cobayes adultes. Cest la seule vitamine dont
on puisse raliser des carences sur animaux adultes.

I,a mthode prventive ou test de croissance de lanimal demande


tout dabord une courte prpriode pour enlever lanimal ses surplus
vitaminiques. On obtient ce rsultat en soumettant les Rats au rgime
de carence pendant quelquesjours, ou les Poussins pendant une dure
plus courte.
Ace moment-l on constitue les lots exprimentaux avec le plus

grand soin possible en rpartissant dans chaque lot un nombre gal


danimaux du mme sexe (mle), provenant des mmes mres, et de
poids gal avant et aprs la prpriode. Cette opration est trs impor-
tante et conditionne lexactitude du dosage.
Chaque lot doit contenir le mme nombre danimaux (de 8 12 ).
Une fois les lots ainsi tablis, on fournit certains lots des quantits
croissantes de vitamine pure qui permettent dtablir une courbe-talon,
tandis que dautres lots reoivent des quantits connues de lchantillon
doser, et ceci 2 ou 3 niveaux diffrents. Il convient que la substance
soit suffisamment riche en vitamine pour que les quantits fournir
aux animaux ne reprsentent quun faible pourcentage de la ration.
De plus, on doit corriger la composition du rgime de base en fonction
de la nature de lchantillon : par exemple, si on dsire connatre la valeur
vitaminique dune poudre de viande on retranchera du rgime de base
une quantit de casine gale la quantit de lchantillon introduite
dans les lots exprimentaux : ainsi tous les lots seront au mme niveau
azot. Si on analyse des chantillons de crales, on retranchera du rgime
de base une partie du sucre, etc.
A titre dexemple, on peut constituer les lots suivants pour le dosage
biologique dune des vitamines B :
Originellement la priode exprimentale stendait sur q semaines
environ, puis on la ramene 15 ou mme 10 jours. Quoiquil en soit,
la fin de lessai, on mesure les gains de poids des diffrents lots et en
intrapolant les augmentations pondrales des lots exprimentaux par
rapport celles des lots constituant la courbe-talon, on en dduit la

teneur vitaminique du produit analys.


a mthode curative ou test de restauration des animaux ne com-
4
I
mence que lorsque les animaux sont en tat de carence vitaminique

aigu, cest--dire quand les symptmes cliniques sont nettement appa-


rents. Dans ce cas, la prpriode est videmment plus longue, surtout
pour le Rat (6 9 semaines). Les animaux sont rpartis en lots comme pr-
cdemment, avec la mme attention ; il faut ici que tous les lots prsentent
le mme tableau clinique.
Chaque lot reoit un supplment vitaminique soit sous forme de
vitamine pure, soit sous forme de substance analyser. Au bout de
quelques semaines on note le pourcentage danimaux guris dans les
diffrents lots. De l on btit une courbe-talon et on calcule la teneur
vitaminique de lchantillon.
Dans dautres cas, on mesure le gain de poids des animaux pendant
la priode de la restauration. Mais, en aucun cas, on ne peut se baser
sur la vitesse de restauration des animaux, qui, elle, nest pas uniquement
fonction de la teneur de la ration en vitamine.
Du reste, la spcificit reste la difficult majeure de ce type de dosage.
En effet, dune part la ration de base doit tre complte et quilibre,
et dautre part la composition de la ration (glucides, lipides) ou la nature
de lchantillon ne doit pas influencer la rponse de lanimal. Cest ainsi
que la dcouverte des derniers membres du complexe B a pu jeter une
suspicion sur les rsultats antrieurs des mthodes biologiques, car les
rations de base risquaient dtre partiellement dficie-ntes en facteurs
alors inconnus (la remarque est encore valable de nos jjours) ; par ailleurs,
dans le cas dun dosage de niacine, par exemple, ni la ration, ni surtout
lchantillon ne doivent renfermer de tryptophane, linterrelation exis-
tant entre ces 2 mtabolites faussant la rponse de lanimal.
On peut faire ces mthodes un reproche dordre matriel, cest
leffort, le temps et les frais quelles ncessitent. Il est bien difficile de
les utiliser dans le travail courant.
Ces mthodes biologiques nen prsentent pas moins des avantages
certains. Ce sont elles qui ont le plus de chances de fournir des rsultats
valables pour lHomme. De plus, elles mesurent lefficacit vitaminique
relle , et
permettent de dcouvrir les facteurs dpargne et les indis-
ventuelles existant dans certains aliments : en fait, elles
ponibilits
dosent la vitamine utilisable et non la vitamine totale.
Un autre avantage des techniques biologiques sur les mthodes
chimiques et microbiologiques est de pouvoir donner lchantillon sous
sa forme naturelle, sans avoir besoin de librer la vitamine par une hydro-

lyse chimique ou enzymatique. Cette hydrolyse est trs souvent cause


de rsultats errons.
La composition de la ration est videmment dune importance capi-
tale. Pour la plupart des facteurs, on peut partir de cette ration ci dessous
complte et quilibre en supprimant la vitamine doser. Voici, titre
indicatif, une ration de croissance pour le Rat, qui permet un gain de
poids journalier de
4 g.

Il faut signaler que pour les dernires vitamines B dcouvertes,


lomission de la vitamine ne suffit pas crer lavitaminose. Dans le cas
de la carence du Rat en biotine, par exemple, il faut ajouter au rgime
une antivitamine, lavidine, qui bloque la biotine. Cest pourquoi la
ration comporte 20 p. 100 de blanc doeuf cru.
Dans dautres cas, on additionne la ration de 2 p. ioo de sulfamides
ce qui inhibe les synthses vitaminiques de la flore intestinale.
Pour le dosage de la vitamine Bi2, il faut que les mres des animaux
utiliss soient elles-mmes limites en cobalamines.
Pour les dosages en acide ascorbique, utilisant obligatoirement le
cobaye, la ration carence est une ration naturelle prive de verdure ;
elle peut tre base de haricots, de levure et de beurre 6)12 ou compose
(
de flocons davoine et de poudre de lait chauff 120&dquo; ).
152
(
2 Dosage de la thiamine

Il existe de nombreuses mthodes biologiques de dosage de cette


vitamine. Elles sont spcifiques et ne demandent pas dhydrolyse parti-
culire de lchantillon ,6
3.
(
)
1 3
I,e rgime peut tre une ration synthtique prive de thiamine,
ou plus simplement une ration naturelle pralablement tuve 3 heures

pour la priver de Bz. Cest ainsi que la mthode officielle britannique utilise
le mlange suivant, comme rgime de base pour le Rat, aprs chauffage
convenable :

Cette vitamine peut tre dose biologiquement laide du Pigeon,


du Poussin ou du Rat.

a) Pigeon.
On utilise la mthode prventive ou curative de la polynvrite du
pigeon ,
30
( , 39
32 , 8 , 88).
1 Dans la deuxime mthode, le test consiste
observer le pourcentage doiseaux guris ,
32 88).
(
b) Poussin.
Il existe une mthode base sur lindex de mortalit par polyn-
vrite , exprim ainsi (8q.) :
dure de lexprience en jours (
22 jours) nombre de jours de
-

survie.
Il est vident que plus le lot est riche en thiamine, plus la valeur
de cet index est faible.
c) Rat.
On peut utiliser une mthode prventive ou curative, ou encore la
mesure de la bradycardie.
I,a prcision de la mthode prventive est de lordre du y si on donne
les chantillons 3 niveaux diffrents au moins. La dure de lessai est
passe de 8 semaines ) 149 4 semaines (
( z) et mme 10 jours (iq.5).
3
La prpriode se poursuit jusquau moment o la courbe de poids des
animaux devient stationnaire ( 3 semaines).
Dans la mthode curative la prpriode dure 2 mois environ (r 6).
5
On sait, par ailleurs, que le rythme cardiaque du Rat diminue au
cours de la carence Bi et revient la normale avec un retour un
quil
rgime quilibr, et proportionnellement la quantit de vitamine offerte
lanimal.
Sur cette observation on a pu tablir une mthode de dosage de
la thiamine (z) : aprs 3 semaines de carence on mesure le rythme car-
3
diaque des animaux laide de llectrocardiographe. On administre
alors des doses connues de vitamine pure ou de solution titrer et 24 heures
aprs on mesure nouveau la frquence cardiaque. La diffrence entre
les 2 valeurs permet de calculer la dose de Bi administre aux animaux.

3! Dosage de la ril!oFlavinc

On peut utiliser le Poussin (,) ou le Rat ,


83
37, 17 z8
( , 4 , 4!). Il est
2
prfrable dutiliser le Rat.
Depuis prs de 25 ans la vitamine G est dose par la mthode pr-
ventive chez le Rat, et a t nettement amliore. Mais, comme pour
tous ces dosages, il est difficile davoir une rponse spcifique et il a
t montr que la composition de la ration et de lchantillon pouvait
influencer la croissance de lanimal. Cest principalement la nature et
le taux des glucides et des lipides qui peuvent modifier la rponse de
lanimal (zo4).

0
4 Dosage (te laeide pantothnique
Ici plus, le, dosage nest pas rigoureux en ce sens que lon ren-
non

contre certain facteur dpargne de lacide pantothnique dans la


un

ration de base ou dans la nature des chantillons ) 35


( ; on dose plus une
efficacit pantothnique que la vitamine elle-mme. Par contre, les
mthodes biologiques offrent sur les mthodes microbiologiques
- -

lavantage de pouvoir doser des formes lies de lacide pantothnique


sans hydrolyse pralable ,27 67).
(
Pour ce dosage il est possible dutiliser le Rat (
, 5, 5
4 9 o2), mais
, I
la mthode prventive stale sur4 semaines, tandis que les dosages
sur Poussins, tout aussi satisfaisants, ne demandent que 10 jours (85).

5 Dosage de la niacine

Les dosages biologiques de la niacine prsentent dassez grosses


difficults pour deux raisons : dabord la plupart des animaux (Rat,
Poussin) synthtisent des quantits importantes de niacine et par suite
il est difficile dobtenir des animaux carencs, dautre part tant donn
les interrelations niacine-tryptophane il est impossible de doser des
chantillons contenant des protines. Ainsi, ne peut-on appliquer la
mthode biologique qu des solutions pures de niacine.
Avec de tels chantillons il est possible de pratiquer la mthode
prventive chez des Poussins (
6), des Rats (6j, 95
2 ) ou de jeunes chiens 6)
17
(
sur qui on observe la prvention de la blacktongue.

0
(; Dosage de la vitamine B6

Le dosage biologique de cette vitamine est difficilement spcifique


car composition de la ration interfre avec la vitamine (
la , 3
9 8) ; mais
lchantillon peut tre fourni directement sans hydrolyse.
On peut employer le test de lacrodynie (
66) chez le Rat, en sachant
1
que la production et la gurison de ce symptme ne sont pas sous la

seule dpendance de la vitamine B6, et que son intensit varie avec les
saisons ,
14 6o, 151).
(
La meilleure technique est celle base sur la croissance du Rat ,25
(
8, 142
2 , iq.). I,e rgime de base peut tre le suivant : sucre 75 g, fibrine
3
8 g, sels 4 g, huile de mas 3 g et toutes les vitamines hormis B6.
1
On peut galement doser la vitamine B6 sur le Poussin en pratiquant
la mthode prventive ) 142 ou curative ).
( II7
(
Si lchantillon est mlang la ration du Rat ou du Poussin et
donn par consquent en mme temps que celle-ci, le pyridoxal et la
pyridoxamine prsentent une activit de 25 p. 100 infrieure celle de
la pyriroxine ; par contre si lchantillon est donn !ey os dune manire
spare de la ration, ou sil est sous forme dune solution injecte intra-
pritonalement, les 3 composs de la famille B6 offrent une activit com-
parable. Lactivit du pyridoxal et de la pyridoxamine est fonction de
la forme sous laquelle ils sont administrs, et ceci explique que les dosages
biologiques peuvent donner des rsultats plus faibles que les techniques
microbiologiques.
Il existe larve, Corcyra cephalonica St., dont la croissance est
une

proportionnelle la quantit de B6 quelle reoit ; on a utilis cette pro-


prit des fins analytiques. Dans ce cas les 3 formes de la vitamine
exercent une activit comparable ,140 141
( ).

0
7 Dosage de la hiotine

La mthode curative chez le Rat semble spcifique. Aprs 6 8 se-


maines de prparation les lots sont constitus et le dosage dure 4 semaines
au bout desquelles on enregistre les gains de poids.
On peut raliser le mme dosage laide de Poussins ; dans ce cas
4 semaines).
la prpriode est plus courte (
Si lon choisit le Rat, le rgime de la prpriode doit contenir de
lavidine, cest--dire du blanc doeuf cru. Ceci nest pas indispensable

dans le cas du Poussin ( , 66).


2
Pendant lessai proprement dit, le blanc doeuf est remplac par une
protine dvitamine, comme la casine, sinon il bloquerait la biotine
ajoute dans les diffrents lots.

no Dosage de la vitamine B12

I,a prparation des animaux est un peu spciale : non seulement


pendant la prpriode les animaux (Rat ou Poussin) ne doivent pas
recevoir de vitamine Bi2, cest--dire que la ration doit tre entirement
vgtale, base de soya la plupart du temps ),235 mais encore les mres
(
doivent-elles avoir t dans des conditions sous-optimales en ce qui
regarde ce facteur.
Pendant la prpriode, on peut acclrer la carence en ajoutant
la ration de 0
60
, 1 p. 100 de thyroprotine (i2
, ).
7
Dans les dosages laide de Poussins lessai dure 3 4 semaines et
le test est le gain de poids ).135
(
Avec le Rat , 53 ioi) on enregistre galement le taux de croissance
(
aprs une priode de 2 4 semaines.

0
9 Dosage de Jacide ascorbique

Les mthodes biologiques dosent la fois la forme oxyde et la


forme rduite de lacide ascorbique.
Comme on le sait le Rat synthtise la vitamine C ce qui oblige se
servir du Cobaye pour les tudes sur le scorbut.
Dans le dosage de la vitamine C on utilise donc des cobayes que lon
choisit adultes (contrairement ce qui se passe pour les membres du
complexe B il est possible de carencer un animal adulte en acide ascor-
bique) .
I,a mthode prventive, la premire utilise (i
o), consiste recher-
5
cher la quantit minimum dchantillon pour prvenir le scorbut. La
mthode curative sapplique la restauration des animaux carencs
par une prpriode dune quinzaine de jours. Dans les 2 cas le test est
la courbe pondrale des animaux.
Par ailleurs, une des manifestations du scorbut, toujours chez le
Cobaye, est utilise des fins analytiques. Cette avitaminose modifie
nettement lhistologie de la dent :
-

dsorganisation des odontoblastes ;


-

structure irrgulire de la dentine ;


-

dcalcification de la prdentine.
On a chafaud une mthode de dosage base sur la prvention
des troubles scorbutiques de la dent ,
73 8
( ).
7
Il est galement possible de mesurer lintensit de la carence ascor-
bique en dosant la phosphatase alcaline du sang, dont le taux est pro-
portionnel la quantit de vitamine chez lanimal ( 8).
5

C. -
LES MTHODES CHIMIQUES ET PHYSIQUES

Dans les mthodes biologiques, une difficult majeure tait dtre


assur que ni la composition de la ration, ni la nature de lchantillon
ninfluaient sur la rponse de lanimal. Si ces soucis ne se retrouvent pas
dans les mthodes chimiques, celles-ci nen sont pas pour autant plus
spcifiques a priori.
0 Gnralits
1

Dans le cas prsent, les principes des mthodes sont bases sur une
raction -

la plupart du temps colore -

de la molcule vitaminique ;
mais dans les chantillons il est rare que dautres molcules, sans acti-
vit vitaminique, ne donnent pas la mme raction que la vitamine.
Cest ainsi que les mthodes fluoromtriques de dosage de la thiamine
et de la riboflavine demandent la plupart du temps une purification de
lextrait pour liminer des substances fluorescence parasite. De mme
dans le dosage de la vitamine C, bas sur le pouvoir rducteur de lacide
ascorbique, il convient dliminer ou dinhiber les autres systmes oxydo-
rducteurs de lextrait.
Cest pourquoi, dans ces mthodes, ainsi que dans les techniques
microbiologiques, la prparation de lextrait rclame des soins nombreux
et attentifs ; elle se passe en 2 temps : dabord hydrolyse de la molcule
vitaminique (ce qui ntait pas utile dans les dosages sur animaux),
ensuite purification de lextrait.
Lhydrolyse est simple et fonction des proprits de la vitamine :
si elle est trs rsistante, comme lacide nicotinique, la prise sera hydro-
lyse chimiquement lautoclave ; par contre, si la molcule est plus
fragile, telle la thiamine, lchantillon subira une lgre hydrolyse chi-
mique puis une digestion enzymatique approprie, cest--dire fonction
des liaisons dans lesquelles la molcule est incluse. A ce propos, on peut
citer la fonction des principaux enzymes utiliss :
-

enzymes protolytiques : papane, pepsine ;


-

enzymes phosphorolytiques : takadiastase, mylase P, clarase,


polidase S.
- enzymes amylolytiques : clarase, takadiastase, mylase P.
Ces enzymes sont des produits commerciaux, utiliss aussi bien
dans les mthodes chimiques que microbiologiques ; ils doivent tre la
fois chimiquement et bactriologiquement purs.
Aprs hydrolyse, lextrait est purifi, soit par adsorption sur terres
ou charbons suivie dune lution, soit par oxydation, ou autre traite-
ment chimique. Cette opration a pour but de sparer la vitamine des
autres corps pouvant donner la mme raction finale, ou de dtruire
ces corps parasites.
Actuellement on peut employer la chromatographie comme mthode
de sparation et de purification de la vitamine doser : il est possible
de travailler laide de chromatogrammes sur papier. Une fois la vita-
mine isole on pratique gnralement une raction colore (mthodes
chimiques) ou bien on soumet les fractions un test de croissance de
microorganisme (mthodes microbiologiques) (io5 a).
En ce qui concerne le dosage chimique celui-ci se termine gnrale-
ment par le dveloppement dune substance colore ou fluorescente
dont on mesure lintensit laide dun appareil appropri ; on rapporte
la valeur de lextrait une courbe-talon constitue avec une solution
pure de vitamine.
Enfin, il faut signaler que si lacide ascorbique et les vitamines Bi
2 se dosent couramment par voie chimique, les autres vitamines B
et B
ne le sont quexceptionnellement. On prfre les mthodes microbiolo-

giques pour les membres plus rcents du complexe B.


2 Dosage de la thiamine

La mthode la plus employe est celle qui consiste doser un produit


doxydation de la thianime, la thiochrome. Ce corps met une couleur
bleue en lumire ultra-violet.
La raction a lieu en milieu fortement alcalin par laction du ferri-
cyanure de potassium (6, i2o) ou du permanganate de potassium ). 79
(
Le thiochrome ainsi obtenu est recueilli dans de lalcool isobutylique.
La sensibilit de cette mthode est de lordre de 1/100 de !.
Cette mthode exige lhydrolyse des formes phosphoryles de la
thiamine, car le phosphate de thiamine donne un phosphate de thio-
chrome insoluble dans lisobutanol.
On peut noter que le N-mthylnicotinamide perturbe la transfor-
mation de la thiamine en thiochrome, et que ce driv de lacide nico-
tinique doit tre limin par adsorption sur Permutit (mq. a).
En pratique, on commence lhydrolyse de lchantillon en milieu
H, 0
2
S0 1 N ioo
, o ou lautoclave. Aprs refroidissement, on ajoute
pH 4 5
, des enzymes phosphorolytiques et autres raison de i/io du
poids sec de lchantillon et on incube une nuit 45.
A ce moment on purifie gnralement lextrait par adsorption sur
une colonne de Decalso (68), puis on lue laide dune solution de chlo-
rure de potassium. On pratique alors loxydation de la thiamine en ajou-

tant de la soude et loxydant, et enfin lisobutanol une minute exactement


aprs la soude. On agite vigoureusement et on centrifuge : le thiochrome
passe dans la couche alcoolique.
On mesure la fluorescence du thiochrome, ou bien on peut effectuer
une lecture spectrophotomtrique de ce driv (55 a).

Ce procd subit quelques exceptions selon la nature de lchantillon.


Cest ainsi que dans le cas du lait on commence par prcipiter la casine
par lacide trichloractique, avant de faire la digestion enzymatique.
Pour les dosages dans lurine, il nest pas ncessaire de pratiquer
dhydrolyse, mais comme lurine renferme des substances fluorescentes,
il est indispensable de pratiquer une purification. Cette opration a fait
lobjet de nombreuses tudes critiques et on y a apport des solutions
diverses (8
, i2i, i3o).
0
Le sang offre galement un cas particulier, en ce sens que lhmatine
favorise la destruction du thiochrome. Pour viter ce phnomne on pro-
cde au traitement suivant 8) 11
( : hydrolyse rapide du sang en milieu
actique, puis digestion enzymatique ordinaire. On traite ensuite par
lacide trichloractique.
Il existe videmment de trs nombreuses variations de cette tech-
nique et aussi dautres principes de mthodes. En particulier, une mthode
de dosage pour le sang ) 23 est base sur la raction de la thiamine sur
(
une amine aromatique (p-aminoactophnone) , ) qui donne un
107 122
(
produit color.

3! Dosage de la riboflavine

Il existe 2 principes chimiques permettant de mesurer fluorimtri-


quement la riboflavine : soit on dose directement la molcule de la ribo-
flavine, soit on dose un driv de cette vitamine qui est aussi fluorescent,
la lumiflavine.
Ce second procd (5 ,8
4 , 129
2 , ) 34 consiste irradier la riboflavine
z
en milieu alcalin pour obtenir la lumiflavine. On pratique une hydrolyse

acide, ensuite on photolyse la vitamine B 2 pH 13 ou i 4 ; on acidifie


et on extrait la lumiflavine par le chloroforme. La solution chloroformique
est passe au fluorimtre.
Cette mthode de dosage est sujette de trs graves reproches car
on ne mesure parfois gure plus de la moiti de la riboflavine de lextrait

sous forme de lumiflavine ). 103 La transformation de la riboflavine


(
en lumiflavine, apparat rarement quantitative.
Cest pourquoi, la mthode recommander est le dosage de la fluo-
rescence de la riboflavine elle-mme.
hydrolyse de lchantillon se fait par voie chimique (C1H 0
/
1 1 N)
,
ou enzymatique (takadiastase et papane) ou par les deux moyens la
fois 93
(
, ,
s
li 178).
La purification de lextrait peut faire de diverses faons :
se
-
soit on avec du permanganate (
oxyde rapidement lextrait 2 mi-
nutes) et on limine le surplus avec de leau oxygne )
3
(g. Ce traitement
peut crer une certaine fluorescence (8 ), et, en prsence dune forte
9
quantit de il
fer, peut se produire une oxydation de la riboflavine )99
( ;
-

soit on peut adsorber la riboflavine sur une terre, tel que le


Florisil et lluer ensuite par une solution actique de pyridine , 29 4
( ,7
9 ).
2
Il semble prfrable de faire ces 2 traitements la suite en commen-
ant par loxydation de lextrait ;
-

soit la sparation entre la riboflavine et les autres pigments peut


soprer par rduction avec lhydrosulfite ou le chlorure stanneux , 71
(
6). Seule la riboflavine se roxyde lair. Cette sparation se fait au
3
i
moment du titrage ;
-

soit aprs loxydation par le permanganate, on peut extraire la


riboflavine en la faisant passer dans un mlange pyridine-butanol. Pour
terminer on titre la solution de riboflavine dans un fluorimtre, et on
mesure la fluorescence verte de la riboflavine.
Il faut noter que pendant la purification de lurine en vue du dosage
de la vitamine B , il apparat des corps prsentant des ractions analogues
2
celles de la riboflavine.
Enfin, il existe dautres mthodes chimiques de dosage de la vita-
mine B , notamment une micromthode fluoromtrique )
2 22 et des
(
mthodes permettant de dissocier la riboflavine libre de la B 2 estrifie
et de la B2 des nuclotides , 10 44, 54)!
(

0
4 Dosage de la niacine

Ce facteur est le dernier des membres du complexe B tre dos


dune manire habituelle par voie chimique. Il existe un grand nombre
de mthodes de dosage de la niacine. Cette vitamine tant un driv
de la pyridine, les mthodes de dosage seront des ractions colores du
noyau pyridique.
La plus connue est celle base sur la raction de Ko!rriG ,
91 1
( )
2
8
condensation du bromure de cyanogne sur la pyridine, ce qui donne
un sel de pyridinium. Ce produit de condensation donne ensuite nais-
sance un driv daldehyde glutaconique, qui est de couleur rouge
dans le cas de la vitamine PP. Cette coloration est due laction dune
amine aromatique.
Pour obtenir des rsultats valables, il faut que toute lamide soit
transforme en acide nicotinique pendant lhydrolyse.
Par ailleurs, les conditions exprimentales du dosage, et notamment
le choix de lamine aromatique, ont fait lobjet de nombreuses publications
dont les dernires en date sont celles de G
YORGY et coll. (6 ) et de PRI!D-
1
MANN et coll. (5).
2 En gnral, le choix de lamine sest port sur la p-
amino actophnone. La trigonelline ne donne pas la raction de
ENIG (175).
O
K
Il existe de nombreuses autres mthodes chimiques de dosage de
la vitamine PP, nous nen parlerons pas tant donn leur utilisation
limite.

Dosage de la N mthylnicotinamide
Chez lHomme, le Chien ou le Porc le principal mtabolite urinaire
de la niacine est la N mthylnicotinamide. Chez les Mammifres on
rencontre de la trigonelline. Ces deux drivs se dosent globalement
selon une technique de H q.). Elle consiste traiter les mta-
UFF et coll. (
7
bolites de lacide nicotinique par lactone en milieu alcalin. Il se dve-
loppe alors une fluorescence que lon rapporte celle dune solution
connue de N mthylnicotinamide.
Il est conseill de dcolorer dabord les urines sur du charbon actif
en milieu actique, afin dliminer linterfrence de certains pigments
urinaires.
La trigonelline peut aussi se doser dans les urines de mammifres
(41, SI, 1
8).
3

5 Dosage de lacide pantothnique

Cette vitamine ne dose pratiquement pas par voie chimique.


se

Les mthodes quon a proposes sappliquent plutt des solutions


pures qu des extraits de nature complexe.
Les principes sur lesquels sont btis les dosages sont ou la libration
par hydrolyse chimique de lalanine, et son dosage colorimtrique ,3g)
(
6
I 4
ou la libration de lacide pantoque et son dosage ( 8i) ; cette dernire
I
mthode ne diffrenciant pas lacide pantothnique de sa moiti inactive,
la lactone.
Une mthode chromatographique vient dtre avance : on spare
cette vitamine par adsorption sur le Florisil et ensuite le sulfate de cuivre
donne une raction colore caractristique ).
I7I
(
0
6 Dosage de la vitamine B6

Comme dans le cas de la niacine, il existe de nombreuses mthodes


chimiques pour doser la vitamine B6, mais une se dtache particulire-
ment : celle de GIBBS ( 6) utilisant le dichloro 2
5 -6 quinonechlorimide.
On peut faire lensemble de ces mthodes le reproche davoir
t tudies au moment o lon ne connaissait que le chlorhydrate de
pyridoxine et non le pyridoxal et la pyridoxamine, et par suite ces tech-
niques rendent compte assez mal des 2 derniers membres de la famille
de la vitamine B6. Par ailleurs, malgr une certaine analogie de structure,
les ractions de dosage de la pyridoxine ne sont pas sensibles la niacine
prsente dans lextrait (g6).
La raction de ladermine avec le dichloro 2 -6 quinone chlorimide
donne une coloration bleue 8) 14 qui permet de doser o,
( 5 v par ce. Une
solution alcool-butanol pH 7 ,o permet dliminer certaines substances
interfrantes.
Autrefois on dterminait un blanc avec un tampon de borate,
qui bloque la pyridoxine ; sur cette solution on fait agir le chlorimide
qui donne une coloration uniquement avec les substances parasites.
Paralllement, si on fait agir le chlorimide sans tampon de borate, on
obtient la valeur de la pyridoxine plus celle des autres corps. Par dif-
frence, il en dcoule la teneur de lextrait en pyridoxine.
Ce procd est prim aujourdhui car on sest aperu que le pyridoxal
et la pyridoxamine ragissent avec le chlorimide mme en prsence de
borate ; cest pourquoi le tampon de borate peut maintenant servir
sparer la pyridoxine dun ct, le pyridoxal et la pyridoxine dun autre
ct.
En pratique, on commence par hydrolyser la vitamine avec de
lacide sulfurique et ensuite avec de la takadiastase. A ce moment on
adsorbe la pyridoxine sur du Superfiltrol pH 3 0 puis on lue par une
,
solution de dichloro 2 -6 quinone chlorimide dans le butanol ). II On
(
ajoute enfin une solution de vronal pH 7,8 pour dvelopper la colo-
ration (6).
1
Une variante fait ragir la pyridoxine dans le chlorimide dans liso-
butanol. On limine les interfrences (bases et sels) avec un tampon
vigoureux ammoniaque-chlorure dammonium. La coloration maximum
se produit en une minute. Dans ce cas, le pyridoxal et la pyridoxamine

ragissent faiblement par rapport la pyridoxine 8). 10


(
Une mthode base sur une raction entre lacide sulfanilique
diazot et ladermine dose un compos azoque jaune-rouge ( ). I,in-
7
6
1
convnient de la mthode est que la pyridoxine donne une coloration
rouge-orange, la pyridoxamine une coloration orange-rose et le pyridoxal
une coloration jaune brillante 6).
11 De plus, dans ce dosage, il faut li-
(
miner tous les composs azots : protines, purines, pyrimidines, etc.
(i68). On peut adsorber la vitamine sur le Superfiltrol, et lluer ensuite
par lalcool en milieu alcalin.

0
7 Dosage de lacide folique
Cette vitamine peut se doser chimiquement de deux faons. La m-
thode de HUTCHINGS et coll. ) 75 consiste rduire lacide folique par le
(
zinc en milieu chlorhydrique N/ , ce qui donne une ptridine et une
2
amine aromatique, dose colorimtriquement ). 20 On peut diminuer
(
linterfrence de certains corps par une rduction avec le chlorure stan-
) en remplacement du zinc.
neux (5
7
Une micromthode, base sur loxydation de lacide folique par le
permanganate en milieu alcalin, donne lacide amino-2-hydroxyptri-
4 carboxylique qui
dine- est dos fluoromtriquement aprs purification
sur le Florisil (r).

0
8 Dosage de la hiotine

A notre connaissance il nexiste pas de mthode chimique pour


doser la biotine.

9 Dosage de la vitamine 12
B
12 est dose chimiquement dune manire peu usite.
I,a vitamine B
En photolysant de la vitamine Bi2 avec une lumire monochroma-
tique le groupe cyanogne de la molcule est libr. On peut lentraner
par un courant dair et ainsi le doser colorimtriquement laide du
phosphate de chloramine T (ig).

0
10 Dosage de lacide ascorbique
La mthode chimique est la seule technique couramment employe
pour le dosage de lacide ascorbique. Ce corps rduit nombre de ractifs,
et pour la dtermination quantitative de lacide ascorbique on utilise
gnralement son pouvoir de transformer un colorant en son leuco-
driv.
La technique la plus rpandue consiste observer la dcoloration
du dichloro 2-6 phnolindophnol )173 qui est un colorant rouge ou
(
bleu selon le pH.
Il convient de prendre certaines prcautions car le dichloro-2-6
phnol indiphnol peut oxyder des substances organiques trs varies
, 43, 46, 55, 12
(7, 4
0 8, 1 ).
0
8
En pratique, on extrait lacide ascorbique de lchantillon laide
de lacide trichloractique, actique, mtaphosphorique, oxalique, etc.
Si lon veut doser lacide ascorbique total il faut passer lextrait
un courant de 2
SH en milieu acide pour rduire la forme dhydroascor-

bique.
Ensuite, on mesure au photomtre, toutes les 15 ou 30 secondes, la
dcoloration dune solution 0025 p. ioo de dichloro 2
, -6 phnolindo-
phnol par action de lextrait contenant lacide ascorbique (io6, iog).
Une autre mthode dffectue pH 3 ,o et, en prsence, dhyposulfite
on claire violemment la solution de bleu de mthylne contenant lextrait
dacide ascorbique.
On peut doser la acide ascorbique plus acide dhydroascor-
somme

bique par une raction avec la dinitro-2-


4 phnylhydrazine, qui donne
) et dont on dose lintensit au photo-
une osazone de couleur rouge (z
33
mtre.
Enfin, il est de doser chromatographiquement la vita-
possible
mine C papier
sur faisant
en un chromatogramme de la dinitro 2 4 ph-
-
nylhydrazone de lacide ascorbique, que lon dose colorimtriquement
aprs lution (117 a) ; une autre mthode chromatographique spare
lacide ascorbique de lacide isoascorbique et dautres substances pertur-
bantes (67 a).

D. -
LES MTHOI)ES 1IICROBIOLOGIQUES
Peu avant la dernire guerre S
CHOPPER et coll. ont montr
144
(
)
quun champignon mycelien, Phycomyces blakesleanus, avait une crois-
sance proportionnelle la quantit de thiamine contenue dans son milieu
de croissance. Une telle observation, reproduite sur dautres moisissures,
puis sur des bacilles, et pour tous les membres du complexe B, est la
base de la technique microbiologique pour le dosage des vitamines B
et des acides amins indispensables.
La vitamine C ne se dose pas microbiologiquement.

1 ! Gnralits

Cette technique a pris remarquable, et qui semble d


un essor
deux sortes de raisons : les scientifiques, les autres matrielles.
unes

Lorsquil est apparu que lefficacit vitaminique tait due la pr-


sence dune vitamine et de corps activit vitaminique, ainsi que dven-
tuelles antivitamines, les dosages chimiques se sont rvls dpasss.
Au contraire, la croissance dun microorganisme prsentait les mmes
avantages que les anciennes mthodes sur animaux suprieurs en ce qui
concerne lefficacit vitaminique des chantillons.
Ces mthodes microbiologiques offrent lavantage, sur les techniques
biologiques, dtre rigoureusement spcifiques, en ce sens quaucun des
membres du complexe B ninfluence la pousse dune souche se dvelop-
pant dans les conditions du dosage. Srr!r,!, et G TRON (i5
S ) ont pris des
9
tubes de courbe-talon dun dosage de B , contenant tous 0
2 1 y de ribo-
,
flavine, cest--dire un point correspondant au dbut de la courbe. Ces
tubes, doss au photomtre donnaient des valeurs se situant entre 0
52
,
,5 A ces tubes, les auteurs ont ajout des doses croissantes de vita-
et 3
0
.
mines B diverses et ils ont mesur la croissance de ces tubes au photo-
mtre, ce qui a donn les rsultats suivants, mettant en vidence la
spcificit des dosages microbiologiques :

Par ailleurs, lorsque la technique microbiologique est utilise pour


la dtermination dun des membres du complexe B, le dosage dautres
vitamines ne demande pas un effort supplmentaire considrable, car
il est possible de se servir dune mme solution pour doser un grand
nombre de vitamines. Cest ainsi que lon peut mener de front le dosage
des principaux membres du groupe B.
Cette technique comprend deux parties prparatoires : lextrac-
tion de la vitamine et la composition du milieu de base.
Lextraction de la vitamine se fait par hydrolyse, dune manire
souvent identique lhydrolyse effectue pour un dosage chimique :
autoclavage pouss si on en a la possibilit, hydrolyse enzymatique si
la vitamine est sensible.
l,e volume de liquide de lextrait doit tre au minimum dans un rap-
port de 5 i avec le poids de lchantillon, et il est conseill de suspendre
la prise dans dix fois son poids de liquide. 1 hydrolyse chimique a in-
/
trt tre faite en milieu chlorhydrique plutt que sulfurique, lanion
4 prsentant une toxicit possible pour le microorganisme.
S0
La purification de lextrait est trs simple en microbiologie : seules
les protines et les lipides sont liminer : les premires sont extraites
par une filtration pH 4 5 en fin dhydrolyse, cest--dire une fois la
,
vitamine libre des liens protidiques dans lesquels elle peut tre incluse ;
les lipides peuvent tre limins grossirement par un traitement froid
pH 4 , de prfrence avec le mlange 2/3 ther sulfurique 1/3 ther de
ptrole. Cette opration se fait avant ou aprs lhydrolyse.
Cette double limination des protines et des lipides est rigoureuse-
ment indispensable. Nous nen prendrons tmoin que le dosage de la
riboflavine effectu par L. casei s. Dans le cas dchantillons riches en
protines, llimination des matires azotes se traduit de la manire
suivante (179)
:

Dans ces chiffres on voit que la prsence de protines


quelques
dans lextrait fournit des taux de riboflavine deux fois trop levs. Lin-
fluence des lipides, parfois moins nette, reprsente galement une cause
derreur trs apprciable, ces chiffres le prouveront (8) :

On peut dmontrer laction de facteur de croissance des lipides en


ajoutant des chantillons des acides gras varis : dans ce cas, la pousse
du lactobacille est gnralement stimule et on trouve des valeurs gn-
ralement comparables celles obtenues sans extraction lther. Nan-
moins il faut signaler que certains acides gras peuvent, selon leur con-
centration, jouer le rle de facteur de croissance ou, au contraire, inhiber
partiellement la pousse microbienne. Par la double limination des pro-
tines et des lipides de lextrait on obtient alors une valeur qui corres-
pond spcifiquement la teneur vitaminique de lextrait. !n effet,
comme nous lavons montr aucune vitamine B ninflue sur la croissance
dune souche quand on se place dans les conditions requises pour lana-
lyse.
Ces conditions exigent notamment que le milieu de base apporte
tous les mtabolites ncessaires ou utiles (indispensables ou accessoires)
la croissance de la souche, et cela en quantits suprieures la dose
minimum indispensable au dveloppement. Il est vident que seul le
facteur faisant lobjet du dosage doit tre totalement absent du milieu
de base.
Ce milieu peut tre ou naturel ou synthtique, cette alternative
tant fonction de notre propre connaissance des besoins nutritifs des
microorganismes. Dans le second cas, il ny a aucune difficult composer
le milieu nutritif qui consiste en une liste de produits biochimiques
simples.
Sil sagit dun milieu naturel, on part toujours de substances com-
plexes (levure, peptone) dont on doit liminer la vitamine que lon veut
doser. Pour cefaire il existe des traitements propres chaque cas qui
permettent de dtruire spcifiquement tel ou tel facteur de ces milieux
naturels. Par exemple, pour le dosage de lacide pantothnique on li-
mine cette vitamine de la peptone par linfluence du pH alcalin froid :
ceci probablement dtruit dautres facteurs sensibles aux bases. Mais
pour liminer lacide pantothnique de la levure on autoclave celle-ci
ce qui dtruit des facteurs thermolabiles, dont lacide pantothnique.

Au total, le seul facteur qui sera dtruit la fois dans la levure et la pep-
tone sera lacide pantothnique. A titre indicatif, voici les milieux com-
plets pour deux lactobacilles trs employs dans les dosages micro-
biologiques pour cent tubes :

On peut procder de deux manires pour remplir les tubes, mais


il faut dans les deux cas que le tube renferme les mmes quantits ab-
solues de milieu et de vitamine : la manire la plus simple est dutiliser
des solutions talons et des extraits suffisamment concentrs pour que
les quantits utiliser ne dpassent pas o,
5 cc (pipettes au i/ioo de cc ) ;
on met ensuite 10 ce du milieu de base dilu selon les indications
ci-dessus.
Ensuite, on strilise, on ensemence avec la souche adquate, on
incube 24 h., ou, de 48 72 h. Dans le premier cas on titre nphlom-
triquement, dans le second on dose lacide
lactique form dans les cul-
tures de Lactobacilles (avec Na OH N/io en prsence de bleu de bro-
mothymol).
Comme dans les mthodes chimiques ou biologiques, chaque dosage
microbiologique comprend unecourbe-talon. Ici elle est compose de
10 points et on prend 4 points croissants par extrait.
Les principales souches employes actuellement sont des bacilles,
bien que les premires mthodes aient utilis des mycliums.
Les souches doivent tre dfinies avec rigueur et voici leur dnomi-
nation exacte avec la rfrence de lAmerican Type. Culture Collections
(Georgetown University Medical School, Washington DC).

0
2 Dosage de la thiamine

En marge des techniques microbiologiques courantes, on peut doser


la vitamine Bi en mesurant lintensit fermentaire de Saccharomyces
cerevisiae (levure de boulangerie). En effet, le pouvoir de fermentation
de cette souche est li la quantit de thiamine prsente dans le milieu
14 147).
(
6,
Il existe deux mthodes indirectes pour mesurer lactivit fermen-
taire de la levure de boulangerie : soit on peut doser lalcool form au
cours de la fermentation (JACQUOT et THIVOI,!!, 7 8), soit on mesure le
gaz carbonique dgag (Y. , RMAND 7
A 8), en se servant dun Warburg.
Quelle que soit la mthode adopte, on constitue une courbe-talon
avec des doses croissantes de thiamine pure, et pour chaque chantillon,
on prend plusieurs doses croissantes.
De plus, on traite une partie aliquote de lextrait par une solution
,6 p. ioo de sulfite acide, et on neutralise ensuite lexcs de sulfite par
0
la quantit exacte deau oxygne ncessaire. Ce traitement a pour but
de pouvoir mesurer lactivit de substances interfrentes parasites qui
augmente le taux de fermentation de la levure. I,e sulfite, en effet, d-
truit spcifiquement la thiamine en la scindant en pyrimidine et en thia-
zole qui sont inactifs, mais il respecte les autres facteurs de lchantillon.
Dans les fioles de Warburg lincubation se poursuit gnralement
pendant 3 h et on mesure les volumes gazeux produits. Pour obtenir la
teneur de lextrait en thiamine, on dduit de la valeur de lchantillon
total le chiffre obtenu avec lextrait trait au sulfite et on rapporte la
courbe-talon le produit de la diffrence.
La mthode la plus courante pour le dosage de la thiamine ) 139
(
utilise le Lactobacillus lermenti 36.
Le milieu de base est semi-synthtique. Lincubation dure 1 8 h au
bout desquelles on titre la nphlomtrie des tubes de culture. On peut
ainsi doser 5 ,o m y de thiamine.
Rappelons que la premire mthode microbiologique a t cre
par F
P
O
H
SC
R E et JurrG ) 144 pour doser la thiamine laide dun Phyco-
(
myces se dveloppant sur un milieu extrmement simple.

Lextraction de la thiamine en vue de son dosage microbiologique

se fait gnralement en deux temps : extraction chimique en milieu

sulfurique 0
1 N, puis digestion enzymatique (papane
, et clarase)
pH 4,5. Filtration et pH 6,o environ.

0
3 Dosage de la riboflavine

Ce facteur se dose habituellement laide de L. casi8).


15 Le
(
milieu est un ensemble de produits naturels que lon prive de ribofla-
vine :
-
la vitamine Bz est limine de la peptone par photolyse al-
caline.
-
elle est enleve de la levure par traitement avec une solution
alcaline dactate basique de plomb dont on se dbarrasse par un pas-
sage SH,.
Lextraction de cette vitamine est sensiblement pareille que celle
de la thiamine : rapide autoclavage en milieu C1H 0 1 N, puis di-
,
gestion enzymatique (takadiastase et papane) pH 4 ,5. Filtration et
neutralisation pH 7,0.
La filtration pH 4 5 est particulirement recommande dans ce
,
dosage ainsi que lextraction ). Dans les
des lipides ce mme pH (
3
6
1
analyses durine, lure peut jouer le rle dinhibiteur, et 2
o mg par
tube est le taux maximum compatible avec la technique microbio-
logique (77).
Cette mthode avec L. casei permet de doser jusqu 5
o my par ce,
mais il est possible de dterminer des concentrations beaucoup plus
faibles de riboflavine en utilisant Leuconostoc mesenteroides (ATCC
) qui est sensible 1
10100 0 m!! par ce dextrait (
, 2).
9
0
4 Dosage de la niacine

La mthode usuelle est celle de KR!HI, et coll. ( q.) base sur la


9
croissance du L. arabinosus 17/5. Le milieu de base est entirement
synthtique et ne pose pas de difficults si les produits employs sont
suffisamment purs.
Cette mthode dose jusqu 50 m Y par ce. dextrait.
La niacine est suffisamment rsistante aux bases ou aux acides
pour tre entirement extraite par voie chimique lautoclave. Pour
beaucoup de types dchantillons un traitement de 30 minutes 120 0
en milieu ClH N donne un rsultat comparable au mme traitement en
milieu NaOH N.
On amne ensuite le pH 4 5 on filtre et lextrait est neutralis.
,
Il est prfrable de faire lhydrolyse en milieu acide, la filtration pH 4
55
,
sen trouvant facilite.
Il est galement possible disoler lacide nicotinique chromato-
graphiquement sur papier, et de faire ce moment-l un test microbio-
logique pour mesurer la vitamine PP ( 8 a).
9

5 Dosage de lacide pantothnique


Il existe deux techniques courantes pour doser ce facteur :
-
la premire utilise L. a
abinosus 17/5 (6
y ,t5q.) dont le milieu est
9
synthtique,
-
la seconde emploie L. casi F
II9
(
) dont le milieu est naturel.
Lacide pantothnique est enlev de la peptone par traitement alcalin
froid, on llimine de la levure en faisant alterner les autoclavages en
milieu alcalin et en milieu neutre.
Personnellement nous optons pour la deuxime technique qui sest
rvle plus reproductible.
Ces deux mthodes offrent la mme sensibilit : io m y par cc dex-
trait. On titre dans les deux cas lacide lactique form.
Lextraction de cette vitamine ne peut se faire en milieu acide ou
alcalin. Aprs un rapide autoclavage pH lgrement acide, on pratique
une digestion enzymatique (mylase P) pH 4 5 (
, 23 a). Ensuite filtration
et neutralisation de lextrait.
Telle tait lhydrolyse classique jusqu ces dernires annes. Depuis,
on a propos des hydrolyses effectues laide denzymes varis , 115
(
8 a) ou lautolyse ,
14 100 io
( ) comme procds dhydrolyse. Ces mo-
5
difications font apparatre des quantits plus ou moins importantes
dacide pantothnique par rapport aux valeurs obtenues avec lhydrolyse
par la mylase P.
0
1; Dosage de la vitamine B(;

Une mthode utilisant une levure (Sacc7iavomyces carlsbergensis


ATCC ? 8) permet de doser les trois membres de la famille B6, la
422
pyridoxine, le pyridoxal et la pyridoxamine possdant une activit
gale vis--vis de cet organisme (
).
3
te milieu est beaucoup plus simple que ceux destins aux lactobacilles.
On mesure la nphlomtrie de ces cultures aprs 1 8 h dincubation.
Une autre mthode permet de doser le pyridoxal et la pyridoxamine
123 en employant le Streptococcus faecalis R. (ATCC ? 8oq.
(
) ). La pyri-
3
doxine est sans activit pour cette souche. Ce microorganisme utilise
un milieu synthtique voisin de celui de L. arabinosus, et on titre la

nphlomtrie des tubes aprs incubation. On peut galement doser


le pyridoxal laide de L. casei (i
6).
9
Lextraction de la vitamine B6 se fait gnralement en milieu sul-
5 N pendant i h lautoclave. Si lchantillon est un liquide
furique o,05
on ajuste son pH 1 ,8- avec de lacide sulfurique (
7
, ) ; il est galement
3
possible dextraire la pyridoxine par S0
4H 2 N
2 ).
2
6
1
(
On peut aussi utiliser un Neuropora sitophila pour le dosage de la
pyridoxine ( ), mais cette souche peut synthtiser la vitamine B6
2
6
1
partir de certains lments azots (z6i).
Par ailleurs, pour S. y l
ca
g be et N. sitophila la thiamine est
ensis
un facteur de croissance ou un inhibiteur. Pour les dosages utilisant

S. y
l
ca
g be il faut que la concentration en thiamine soit suprieure
ensis,
un seuil donn ) 125
( ; avec Neurospora on procde une destruction
de la thiamine par un traitement au sulfite qui respecte la pyridoxine.

0
7 Dosage de lacide folique
Deux mthodes microbiologiques classiques permettent la dter-
mination de lacide ptroylglutamique.
Une technique employant Streptococcus f aecalis R. fait appel un
milieu synthtique ( ) dans lequel on a propos dajouter les pu-
6, II2
3
rines afin dobtenir une croissance maximum (i5 ).
7
Un autre procd utilise L. casei et un milieu naturel ).131
(
Dans ce cas, on doit liminer lacide folique dun hydrolysat de ca-
sine laide de charbon actif. Cette mthode est la plus sensible : elle
dtermine des concentrations de 0 1 m y par ce dextrait.
,
Dans la premire technique on mesure la nphlomtrie des tubes,
dans la seconde on titre lacide lactique form.
Lextraction de lacide folique est assez dlicate car lhydrolyse
demande une Bc conjugase. On en trouve dans des prparations de rein
de porc )15 ou de pancras de poulet (
( 8).
9
La digestion enzymatique seffectue selon le mode habituel.
8

Dosage de la biotine

Plusieurs mthodes permettent de doser ce facteur, mais une des


plus courantes utilise L. a
abinosus 1715 (
y ). On emploie un milieu
0
6
1
synthtique, et on dose ainsi des extraits ayant des concentrations de
0,2 my par ce.
Cette mthode est intressante dans le dosage du blanc dceuf, car
abinosus ne peut pas utiliser la biotine combine lavidine. L. casei,
L. a
y
au contraire, offre la particularit de pouvoir hydrolyser le complexe
biotine-avidine. Mais ce dernier microorganisme demande un milieu plus
complexe dont on est oblig de retirer la biotine par action de leau
oxygne et par adsorption sur le charbon actif ). 153
(
Avec les deux mthodes le test est la titration de lacide lactique.
Lextraction de la biotine est trs simple dans le cas de loeuf, qui
demande seulement un autoclavage leau. Dans limmense majorit
des cas, il faut hydrolyser une heure 1200 en milieu S0 4H 2 6N. On
limine ensuite cet acide sous forme de sulfate de baryum (neutralisation
vers pH 5 ). On filtre et on neutralise lextrait.
3
,


9 Dosage de la vitamine B12

Les techniques microbiologiques du dosage de la vitamine Bi2


sont trs nombreuses et emploient diverses souches dont les plus fr-
quemment utilises sont Lactobacillus Lactis Dorner (ATCC N 8 ),
000
Lactobacillus Leichmann (ATCC N 31 ) et Escherichia coli II3/3
8 et 497 .
Les milieux sont gnralement plus simples que ceux utiliss pour les
Lactobacilles ordinaires.
On titre gnralement la nphlomtrie obtenue aprs une vingtaine
dheures dincubation.
Une des dernires techniques est base sur la croissance de Esche-
y 24 Elle tudie la composition du milieu et les conditions
ichia coli ).
(
dincubation. En plus, elle envisage divers types dextraction et retient
le suivant : ,hydrolyse en milieu aqueux tamponn pH 4 5 avec de
,
lactate de sodium et en protgeant la vitamine par addition de i mg de
cyanure de potassium par y de vitamine prsente dans lextrait.
omonas dose spcifiquement la vitamine B
Il faut noter que Och
y 12
et non les cobalamines comme Escherichia coli ). 50
(
Enfin, pour dceler les diverses vitamines B 12 et les dissocier
dautres facteurs de croissance on peut faire appel un procd mixte
utilisant la fois la chromatographie et la microbiologie : on mesure
microbiologiquement lactivit des vitamines Bi2 aprs les avoir isoles
chromatographiquement (65 a, 179
a, 1
18
a).
E. -
RSULTATS COMPARATIFS ET CONCLUSIONS

Aprs avoir pass en revue les trois grands types de dosages vitami-
niques, les techniques biologiques, chimiques et microbiologiques, la
question qui se pose est de savoir dans quelle mesure des rsultats obtenus
par des voies si diffrentes peuvent prsenter entre eux une bonne con-
cordance. Certains auteurs se sont poss la question et ont analys un
mme chantillon laide de techniques diverses. Nous allons donner le
fruit de leurs travaux dans les tableaux suivants.
Dans chacun deux nous avons calcul les valeurs relatives moyennes
en prenant a bitrairement une des techniques comme rfrence ; ceci
y
permet de mettre en lumire la similitude ou la divergence existant entre
les mthodes de dosages. Encore conviendra-t-il de remarquer que la nature
de lchantillon peut intervenir dans le rsultat dune analyse vitaminique.
Cest pourquoi, sil existe pour chaque vitamine un mode usuel dextrac-
tion, celui-ci ne peut tre considr comme valable dans tous les cas.
Il y a notamment deux humeurs biologiques dont le dosage vitaminique
offre des difficults particulires : le sang et lurine. Ces deux liquides
exigent souvent une hydrolyse ou une purification particulires.
Les tableaux I et II mettent en lumire une trs bonne concordance
entre les trois modes de dosages de la vitamine Bi.
Il faut noter que dans le tableau I les auteurs ont pris la prcau-
tion de calculer la valeur du blanc dans la technique de fermentation
de la Levure.
Par ailleurs, dans ces deux tableaux concernant la thiamine, on
observe une bonne harmonie entre les techniques quel que soit le type
dchantillon observ (crales, levure, productions animales, etc.). En
conclusion, le dosage de la thiamine semble parfaitement au point, et les
diverses techniques fournissent des rsultats dont les carts sont de
lordre deio p. 100
.

Le tableau III illustre bien la difficult rencontre dans le dosage


urinaire de la riboflavine. En purifiant lurine de plus en plus colonne
-

A colonne C - les rsultats baissent au fur et mesure, pour finale-


ment concider avec ceux obtenus laide de la technique microbio-

logique.
Les rsultats du tableau IV fournissant les teneurs en riboflavine de
divers types dchantillons montrent une concordance satisfaisante entre
les mthodes biologiques, microbiologiques et chimiques. Comme pour
la vitamine B, les carts moyens sont de lordre de 10 p. 100
I .

Le tableau V fait apparatre une trs forte diffrence entre les teneurs
en
niacine obtenues par voie microbiologique ou chimique ou par voie
biologique : les analyses faites laide danimaux suprieurs fournissant
des rsultatsen moyenne deux fois plus levs que ceux obtenus par les

autres techniques. Ces carts confirment parfaitement linfluence du


tryptophane de lchantillon comme facteur dpargne de la niacine.
Ce tableau V ainsi que le suivant font ressortir une harmonie rela-
tivement bonne entre les mthodes chimiques et les techniques micro-
biologiques : lcart moyen le plus lev est de 2
o p. ioo. Dans le tableau V
les rsultats chimiques sont plus levs, et dans le tableau VI ce sont
les valeurs provenant de la microbiologie qui sont les plus fortes : les
deux mthodes fournissent des rsultats qui se chevauchent.
Le tableau VII fait ressortir une certaine faiblesse des rsultats
microbiologiques concernant lacide pantothnique vis--vis des rsultats
des dosages biologiques. Ceci est surtout vrai pour certains extraits de
levure (colonne B et D).
Par la suite, on a constat quune extraction aqueuse ou laide
denzymes comme la mylase P nhydrolysait quune fraction seulement

de la vitamine, et cest pourquoi on pratiqua des extractions avec des


phosphatases intestinales et des enzymes hpatiques ) 115 ou des poudres
(
147 a). Mais, selon
de reins traits lactone ( les auteurs le bnfice de
ce nouveau type dextraction tait plus ou moins grand : certains voyaient
les teneurs du foie augmenter de cinq fois )115 tandis que dautres obte-
(
naient des rsultats voisins (q8).
De mme lautolyse du foie a fourni des rsultats levs , 100 105
( )
ou non )177 par rapport lextraction laide de la mylase P.
(
En ralit, il semble quun travail rcent dpartage assez bien les
divergences concernant lextraction et le dosage de lacide pantothnique :
le tableau VIII accorde lextraction laide de phosphatase et den-
zymes hpatiques une supriorit de lordre de 30 p. ioo par rapport
lhydrolyse effectue par la mylase P.
e tableau IX confirme cet cart et montre une excellente conci-
4
I
dence entre la mthode biologique et la mthode microbiologique (ex-
traction avec le mlange enzymatique).
Enfin, le tableau X fait apparatre une trs bonne concordance
entre les techniques chimique et bactriologique, mais ces chiffres portent
exclusivement sur des chantillons de crales, et il serait intressant
dtendre la comparaison dautres catgories de substances biologiques
ou alimentaires.

En conclusion, il parat sage de ramener de justes proportions la


divergence signale entre les divers modes dextraction de lacide panto-
thnique.
Nous navons pas trouv de tableaux comparatifs prsentant des
analyses en vitamines B6 et en biotine.
Le tableau XI permet de penser que le dosage de lacide folique est
pratiquement au point car on ne relve pas de
grandes divergences entre
les rsultats des mthodes chimique, microbiologique et biologique.
Il ne parat pas que les choses en soient l en ce qui concerne le dosage
de la vitamine Bi2. I,
r,rE et coll. (io2 a), viennent de consacrer une tude
W
la comparaison des mthodes biologiques et microbiologiques de dosage
de la vitamine . 12
B
Leurs rsultats sont groups dans les tableaux XII et XIII, ceux-ci
sont nettement diffrents lun de lautre : le premier donne des exemples
dchantillons qui offrent les mmes valeurs lorsquils sont traits par la
technique biologique ou par la mthode microbiologique, tandis que dans
le tableau XIII apparat une complte anarchie entre les deux techniques
analytiques. Il semble donc exister des cas despces, mais, ce qui surprend
est que lon trouve dans les deux tableaux des produits trs voisins et
mme identiques (farine de poisson). Par ailleurs toutes les mthodes
microbiologiques ne fournissent pas des rsultats comparables, ce qui fait
conclure qu lheure actuelle les techniques analytiques concernant la
vitamine B 12 ne sont pas encore satisfaisantes.
Par contre, tant donn lanciennet de la vitamine C et les trs
nombreux travaux quelle a suscits, son dosage est parfaitement mis au
point. Le tableau XIV en donne une preuve si besoin est.
En rsum, pour les facteurs vitaminiques dont les modalits analy-
tiques sont actuellement bien tudies, les diffrents modes de dosage
fournissent des rsultats identiques 10 p. 100 prs environ.
Que doit-on penser dune telle marge ?
Tout dabord quil est et sera impossible de la rduire : il existera
toujours une imprcision de cet ordre entre des laboratoires diffrents et
appliquant chacun des mthodes plus oumoins modifies dans leur
dtail. Par consquent, en considrant une imprcision de cet ordre de
grandeur, que peut-on attendre des rsultats analytiques concernant les
vitamines hydrosolubles ?
Il convient de distinguer ici deux sortes de travaux :
-
Dans un travail de physiologie, le but principal est la mise en
vidence dune diffrence entre un lot tmoin et des lots exprimentaux.
Dans ce cas, en choisissant une mthode analytique les risques dentraner
une erreur relative tout au long du travail ne sont pas trs importants,
en ce sens que cette erreur se retrouvant partout, elle ne faussera pas les
conclusions que lon tirera du travail.
-
Il nen va plus de mme dans un travail nutritionnel, o lon
doit arriver une valeur absolue. Il faut, par exemple, dterminer dans
quelle mesure une ration couvre les besoins vitaminiques dun organisme
donn.
Dans ce cas, il faut savoir
avec quelles difficults sont dtermins les
besoins vitaminiques de lHomme ou des animaux. Il est permis alors de
penser que limprcision de ces standards est gale ou suprieure celle
des dosages vitaminiques.
Cest pourquoi, nous conclurons que lorsque les modalits analytiques
sont bien tudies, la prcision des dosages est suffisante en regard de la
notion des besoins vitaminiques.

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