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Dosage de la vitamine D dans le lait, par

chromatographie liquide haute pression


L. Mouillet, F. M. Luquet, M. F. Gagnepain, Y. Sorgue

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L. Mouillet, F. M. Luquet, M. F. Gagnepain, Y. Sorgue. Dosage de la vitamine D dans le
lait, par chromatographie liquide haute pression. Le Lait, INRA Editions, 1982, 62 (611 612),
pp.44-54. <hal-00928916>

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Le Lait, (1982), 62, 4454

Dosage de la vitamine D dans le lait,


par chromatographie liquide haute pression"
par
L. MOUILLEr, F. M. LUQUET''', M. F. GAGNEPAIN*
et Y. SORGUE*

INTRODUCTION

La vitamine D est une vitamine liposoluble, forme par irradia-


tion ultraviolette de provitamines D. Les deux reprsentants les plus
importants sont l'ergocalcifrol ou vitamine D2 (synthtise partir
d'un prcurseur vgtal) et le cholcalcifrol ou vitamine D3 (syn-
thtise partir d'un prcurseur animal).
Chez les vgtaux, Ia vitamine D est peu rpandue : on trouve
de petites quantits de vitamine D2 dans les champignons. Dans le
rgne animal, on rencontre les formes D2 et D3 dans les huiles de
foie de poissons. La vitamine D3 est aussi prsente dans les tissus
adipeux, les ufs et les produits laitiers renfermant de la matire
grasse.
La provitamine D2 (ergostrol) se rencontre dans les levures et
dans les champignons, ainsi que dans l'uf de poule. La provitamine
D3 (7 dhydrocholestrol), importante pour l'homme et les mammi-
fres suprieurs, est concentre dans les tissus cutans de toutes les
espces animales, c'est ce niveau (croit-on) qu'elle se forme.
Les vitamines D2 et D3 se dgradent assez rapidement sous l'action
de l'oxygne de la lumire et des acides. En solution huileuse, il se
produit une isomrisation et un quilibre s'tablit entre le calcifrol
et le prcalcifrol.

L'Unit Internationale (U.I.) correspond l'activit de 1 mg d'une prparation


standard internationale de solution huileuse de vitamine D3 ou 0,025 ug de
vitamine D2 ou D3 cristallise.
* I.S.H.A., B.P. 138, rue du Chemin-Blanc, Champlan - 91163Longjumeau cedex.
Directeur: F. M. LUQUET.
** Etude ralise dans le cadre d'un contrat DGRST, n 7970062.
MMOIRES ORIGINAUX 45

Sur le plan des fonctions physiologiques, la vitamine D amliore


la rsorption du calcium travers la paroi intestinale et facilite
l'incorporation la fois du calcium et du phosphore dans le tissu
osseux. La vitamine D influence en outre l'limination des phosphates
par les reins, en augmentant leur rabsorption.
Une carence en vitamine D entrane donc des troubles de la
caLcification de la matrice osseuse et une augmentation de l'limi-
nation urinaire des phosphates.
L'O.M.S. situe les besoins journaliers de l'enfant vers 400 500
Units Internationales. Chez l'adulte la ration ncessaire peut tre
porte 1 000 U.l. dans certains cas (femmes enceintes, travailleurs
nocturnes).
En ce qui concerne la vitamine D dans le lait, les connaissances
restent encore actuellement limites, par manque de mthodes de
dosages suffisamment rapides et prcises. De plus, des enqutes
ralises dans certains pays europens (Allemagne, Angleterre, France)
ont permis de mettre en vidence quelques manifestations d'hypo-
vitaminose D, en particulier dans les populations urbaines.
En France, la question d'un ventuel enrichissement du lait en
vitamine D a t souleve (Conseil Suprieur d'Hygine Publique de
France, Section de l'Hygine Alimentaire et de la Nutrition, 25-9-1979).
Afin de pouvoir tudier ce problme d'enrichissement (addition ou
irradiation) il est ncessaire de connatre les teneurs relles des laits
franais la production. Une telle enqute ncessite l'emploi d'une
mthode d'analyse qui soit rapide et qui permette de dtecter avec
prcision des teneurs relativement faibles ~n vitamine D (D2 et D3).

1. GENERALITES SUR LES METHODES D'ANALYSE

Les mthodes de dosage de la vitamine D font appel soit des


techniques biologiques, soit des mthodes physico-chimiques,

1.1. Dosages biologiques


On utilise le test prophylactique et curatif du rachitisme chez
le rat. L'valuation du degr de rachitisme pouvant s'effectuer en
utilisant soit le line-test selon l'U.S.P. X V [16] soit l'examen
radiologique de la calcification des os, soit le dosage gravimtrique
des constituants minraux osseux.

1.2. Dosages physico-chimiques

1.2.1. RACTIONS COLORES

Cette mthode a t dcrite par EWINGet al. [7] et par NIELD


et al. [13]. Elle consiste dvelopper une coloration rose en mettant
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--------

en prsence la vitamine D et le ractif de NIELD(chlorure d'antimoine


dans le dichlorthane additionn de 2 p. 100 de chlorure d'actyle.
Ce complexe color absorbe 500 nm. Cette mthode doit comporter
des tapes de purification sur colonne et sur couche mince afin
d'liminer certaines substances interfrentes telles que la vitamine A
,et l'ensemble des carotnodes [13].
Cette mthode peut tre applique des chantillons dont la
concentration est suprieure 25000 V.Ljg [3, 11].
1.2.2. MTHODES
CHROMATOGRAPHIQUES
Chromatographie en phase gazeuse : Cette technique a t pro-
pose par diffrents auteurs [4, 5, 6, 9, 12]. Aprs saponification le
rsidu insaponifiable peut tre purifi par passages successifs sur
plusieurs colonnes (celite, alumines, etc.) ou par chromatographie
en couche mince. L'luat final est repris, silyl (bis trimthylsilyla-
ctamide), puis inject dans le chromatographe en phase gazeuse
muni d'un dtecteur ionisation de flamme. Les vitamines Da et
D3 subissent une hisomrisation thermique, d'o l'apparition pour
chacun des deux composs de deux isomres: Pyro et Iso-pyro ,
Le seuil de dtection de la vitamine D reste relativement lev
(400 V.L/lOO g d'chantillon). Compte tenu des teneurs naturelles
en vitamine D prsentes dans les produits alimentaires, Il est nces-
saire de mettre en uvre des prises d'essai importantes, d'o les
nombreuses difficults que l'on rencontre tous les stades de la
prparation .
Chromatographie en phase liquide haute pression (C.L.H.P.) :
Le dveloppement de cette technique chromatographique a permis,
ds 1972, WILLIAMSet al. [17J de dcrire une mthode de dosage
des vitamines liposolubles. D'autres auteurs [1, 2, 8, 10, 14, 15J ont
galement tudi cette nouvelle possibilit d'analyse. Les avantages
de' la C.L.H.P. sont pour l'essentiel :
- de pouvoir sparer les diffrents isomres de la vitamine D
possdant ou non des activits biologiques;
- de ne pas modifier la structure de la molcule, d'o une pos-
sibilit d'un contrle supplmentaire la sortie de la colonne;
- de possder un seuil de dtection (absorption mesure en
U.V. 254 nm) suffisamment bas, permettant de doser des quantits
de vitamine D de l'ordre de l'U.L/lOO g d'chantillon.
L'examen des diffrentes possibilits de dosages nous a conduit
ne retenir, pour l'analyse des laits, que la technique par CL.H.P.
En effet, seule cette mthode est compatible avec un degr de sen-
sibilit suffisant et une relative rapidit d'excution permettant une
enqute sur le plan national, concernant la teneur des laits crus en
vitamine D. Nous avons conserv certains principes analytiques
dcrits dans de rcentes publications [2, 3], tout en introduisant
MMOIRES ORIGINAUX 47

plusieurs modifications ayant pour but d'amliorer soit la prcision,


soit d'augmenter la rapidit de l'analyse.

Il. METHODE DE DOSAGE DE LA VITAMINE D DANS LE LAIT


PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PRESSION

Il.1. Objet
La mthode dcrite ci-aprs permet de doser la vitamine D3 et
D2 dans le lait jusqu' une valeur limite de 20 U.L/l.

Il.2. Principe
Aprs saponification de l'chantillon, I'insaponifiable est d'abord
extrait puis purifi, avant d'tre analys par C.L.H.P. : la dtection
s'effectuant en U.V. 254 nm.

11.3. Produits et matriel

11.3.1. PRODUITS

11.3.1.1. Ethanol absolu pour analyse.


2. Acide ascorbique.
3. Solution aqueuse d'hydroxyde de potassium 50 p. 100.
4. Azote R.
5. Ether de ptrole (40 Cj60 C).
6. Sulfate de sodium anhydre.
7. Alumine neutre d'activit 1 (Woelm type 02087) dsactive
15 p. 100 d'eau, 2 h avant utilisation.
8. Ether de ptrole (60 Cj80 C).
9. Mlange Ether thyliquejEther de ptrole (60 C-80 C) : 70 :
30 (VjV).
10. Digitonine (glucoside de la digitognine). Prparer une solu-
tion thanolique 0,16 p. 100 (PjV).
Il. Mthanol absolu pour analyse.
12. Mlange luant HPLC : Mthanol/eau 99,5 0,5 (VjV).
13. Vitamine D3 talon.

11.3.2. MATRIEL:

II.3.2.1. Bain-marie 90 C.
2. Evaporateur rotatif (temprature du bain-marie 60 C).
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3. Colonne de verre pour chromatographie (0 int : 1 cm, lon-


gueur : 20 cm), munie d'un rservoir solvant et d'un verre
fritt sa base. Introduire l'alumine (II.3.1.7.) jusqu' rem-
plir la colonne sur une hauteur de 10 cm, puis effectuer un
lavage avec 50 ml d'ther de ptrole (11.3. ).
4. Chromatograhe pour chromatographie liquide haute pres-
sion (Spectra-physics SP 8000) muni d'un dtecteur par absor-
bance 254 nm et d'un enregistreur.
5. Colonne HPLC en acier inox (0 int : 0,4 cm, longueur: 25 cm).
Remplie d'une phase stationnaire : lichrosorb RP 18 I-t,
(Merck).
6. Systme de filtration millipore (filtre: 0,45 um).
7. Centrifugeuse.
8. Agitateur d'ampoules dcanter (type: Agitelec).

Il.4. Mode opratoire

HA.1. SAPONIFICATION

Introduire dans un ballon de 500 ml


- 100 ml de lait;

fig. 1

Chromatographie liquide SP 8 000avec intgrateur.


MMOIRES ORIGINAUX 49

- 150 ml d'thanol;
- 1 g d'acide ascorbique;
- 60 ml de la solution de KOH (II.3.1.3.). Mettre au bain-marie
(11.3.2.1) sous rfrigrant reflux et sous atmosphre d'azote pen-
dant 30 mn.

11.4.2 EXTRACTION
DE L'INSAPONIFIABLE
Aprs refroidissement, entraner quantitativement la liqueur de
saponification dans une ampoule dcanter de 500 ml en utilisant
environ 50 ml d'eau distille. Ajouter environ 100 ml d'ther de
ptrole (11.3.1.5.) et agiter (II.3.2.8.) pendant 2 min.
Recommencer deux fois l'extraction en utilisant chaque fois
environ 100 ml d'ther de ptrole. Runir les extraits renfermant
I'insaponifiable.
Laver la phase thre avec de l'eau jusqu' neutralit la ph-
nolphtaline, et liminer les traces d'eau en effectuant une filtration
sur du sulfate de sodium (II.3.1.6.).
Eliminer compltement le solvant l'aide d'un vaporateur rota-
tif (II.3.2.2.).

II.4.3. PURIFICATIONDE L'EXTRAITINSAPONIFIABLE

Chromatographie sur alumine


Reprendre le rsidu avec 10 ml d'ther de ptrole (11.3.1.8.),
l'introduire dans la colonne (II.3.2.3.). Rincer avec 50 ml d'ther de
ptrole (II.3.1.8.), ce qui permet d'liminer la plupart des carot-
nodes. Effectuer l'lut ion des vitamines liposolubles l'aide de 70 ml
du mlange Ether thylique/Ether de ptrole (11.3.1.9.). Evaporer
sec l'luat.
Prcipitation d'une partie des strols par la igitonine
Les strols forment avec la digitonine des composs d'addition
quimolculaires peu solubles dans l'thanol. Cette proprit est uti-
lise pour liminer une fraction importante des strols, ce qui permet
d'obtenir des chromatogrammes plus facilement exploitables. Repren-
dre le rsidu sec avec 5 ml de la solution alcoolique de digitonine
(II.3.1.10). Mettre au froid -18 C pendant 15 min. Evaporer
sec et reprendre le rsidu avec 5 la ml de mthanol. Centrifuger
5 min 3 000 tours min, et recueillir le surnageant. Laver le culot
de centrifugation avec quelques ml d'ther de ptrole et effectuer
une deuxime centrifugation. Eliminer le culot de centrifugation,
runir les phases thres et vaporer sec.
Filtration sur membrane millipore (1[.3.2.6.)
Reprendre le rsidu sec avec environ 1 ml de mthanol. Filtrer
sur membrane millipore en effectuant plusieurs rinages en utilisant
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des fractions de 1 ml de mthanol. Evaporer sec et ajuster exac-


tement 1 ml avec du mthanol.

Remarques

1. Toutes les manipulations doivent tre faites l'abri de la


lumire directe.
2. Une purification supplmentaire peut tre ralise par chro-
matographie sur Clite/Magnsie telle qu'elle a t dcrite par ANTA-
LICK J. P. et al. [3]. Toutefois dans le cas du lait, cette purification
n'est pas ncessaire.

IIA.4. DOSAGE

L'analyse par CLHP de l'extrait purifi est ralise dans les condi-
tions suivantes :
- volume inject : 50 ul :
- colonne polarit de phase inverse (11.3.2.5.);
- phase mobile: mlange mthanol/eau (11.3.1.12.) dbit 1 ml/
min;
dtection U.V. 254 nm.
Dans ces conditions, le profil chromatographique obtenu est sem-
blable celui reprsent par la figure 2.
Effectuer sur 1 chantillon un ajout de vitamine D3 avant sapo-
nification, ce qui permet la fois d'identifier et de quantifier le pic
de vitamine D3.
Calculer la surface des pics, soit l'aide d'un intgrateur, soit
en effectuant le produit de la hauteur par la largeur mi-hauteur.
La teneur en vitamine D3 (U.L/I) est donne par la formule :
s
U.L/I = ---.A.10.
(S - s)

A quantit de vitamine D3 ajoute (U.L) dans 100 ml de lait.


s surface du pic sans ajout.
S surface du pic avec ajout.
Le calcul peut aussi tre effectu partir d'un talonnage externe
condition de connatre le taux de perte en vitamine D3 occasionn
par les diffrentes tapes de l'extraction et de la purification. Dans
les conditions opratoires dcrites ci-dessus, nous avons tabli que
le taux de rcupration de la vitamine D3 est de l'ordre de 80p. 100.
MMOIRES ORIGINAUX 51

Il
1
Il
l'

~~

_f
fig. 2

CLHP (profil chromatographique d'un lait cru


(conditions analytiques: Cf. 11-4-4).
52 LE LAIT / JANVIER-FVRIER 1982 / N 611-612

III. TENEURS EN VITAMINE D3 DE QUELQUES LAITS


FRANCAIS

Des analyses ont t ralises sur des chantillons de laits crus


de mlange, provenant de diffrentes rgions franaises. Les rsul-
tats indiqus reprsentent la moyenne de plusieurs dterminations,
effectues sur des ohantillons diffrents qui, pour une mme rgion,
ont t prlevs le mme jour. Tous les prlvements ont eu lieu
durant les mois de septembre et octobre 1980.
Rgion Nord : 29 V.L/l (M.G. : 40,25 g/l).
Rgion Normande :
a) 24 V.L/l {M.G.: 41,0 g/I).
b) 25 V.L/l (M.G.: 42,0 g/I).
c) 55 V.L/l (M.G.: 44,0 g/I).
Rgion Bretagne : 36 V.L/l (M.G. 41 g/l).
Rgion Ile-de-France :
a) 40 V.L/l (M.G.: 39,0 g/I).
b) 34 V.I./l (M.G.: 38,5 g/l).
Rgion Nord-Alpes : 25 V.L/l (M.G. 40,S g/I).
Rgion Yonne :
a) 50 V.L/l (M.G. 43,0 g/l).
b) 30 V.I./l (M.G. 40,5 g/I).

CONCLUSION

La recherche et le dosage de la vitamine D3 dans le lait nces-


sitent la mise en uvre de techniques analytiques trs sensibles. La
chromatographie liquide haute pression permet d'tre la fois suf-
fisamment sensible, reproductible et relativement rapide pour pou-
voir tre utilise comme mthode de routine. La ralisation d'une
pr-enqute sur la teneur en vitamine D de laits franais a permis
de constater que selon l'origine des chantillons, la vitamine D3 est
prsente dans les laits crus, dans des limites variant de 25 50 V.L/l.
Il serait intressant de pouvoir affiner ces chiffres en tudiant notam-
ment l'influence de certains paramtres zootechniques (races, alimen-
tation, etc.) ainsi que J'volution au cours de l'anne. Enfin, l'tude
de la vitamine D reste encore incomplte tant que l'on n'a pas sa
disposition une mthode de dosage suffisamment prcise de l'ester
sulfate de cholcalcifrol et de l'hydro 25 cholcalcifrol.
MMOIRES
ORIGINAUX 53

Remerciements

Nous remercions M. le professeur Raoul (professeur Facult de Pharmacie,


Paris), M. le professeur Pellerin (professeur Facult de Pharmacie, Chtenay-
Malabry), Mlle Le Boulch ([.N.S.E.R.M.) qui, grce leurs conseils et leurs
encouragements ont contribu la ralisation de cette tude.

Rsum

Aprs saponification et extraction de l'insaponifia:ble, la vitamine


D3 est dose dans le lait par chromatographie liquide haute pression.
La technique propose permet le dosage de la vitamine D jusqu'
une teneur limite de 20 V.L/l. Une pr-enqute ralise en automne
1980 a montr que les teneurs en vitamine D3 des diffrents laits
franais analyss varient de 25 50 V.L/l.

Summary

DETERMINATION OF VITAMIN D IN MILK BY HPLC


After saponification and extraction of unsaponifiable matter,
vitamin D3 is deterrnined in milk by high pressure Iiquid chroma-
tography. The technique we propose allows to proportion vitamin D
up to a Iirnited content of 20 V.L a liter. Preliminary investigations
realised during autumn 80 proved that vitamin D3 contents, in various
analysed french milks, differ from 25 to 50 V.L a liter.
Reu pour publication en juillet 1981.

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