172.

601 Biochemische Technologie

Allgemeine Biotechnologie
(Biochemical Engineering)
C. Upstream-Prozesse

Univ.Prof.Dr. W. Hampel
 Upstream -Prozesse

Nhrmedium
Technische Substrate
Rohstoffvorbehandlung
Reinigung
Sterilisation
Sicherheit
 Kulturmedium - Kriterien
Kosten und Verfgbarkeit der Komponenten: billig,
gleichbleibende Qualitt, Jahreszeit-unabhngige Verfgbarkeit
Problemfreie Handhabung in fester oder flssiger Form: bzw.
Kosten fr Transport und Lagerung
Erfordernisse zur Sterilisierung bzw. Denaturierungspotential
Rezeptur-, Mischungs-, Komplexierungs- und
Viskosittsverhalten: Einfluss auf Rhren, Belften,
Schaumbildung und Produktgewinnung
Konzentration der Zielprodukts; Bildungsrate und Ausbeute
Art und Menge von Verunreinigungen und das Patential
unerwnschte Nebenprodukte zu bilden
Sicherheits- und Entsorgungserfordernisse
 Kulturmedium - Komponenten
Substrat Hauptkomponente, C- und Energiequelle,
limitierend
Kohlenhydrate, Fette, Proteine, KW, R-OH; R-COOH
Nhrstoffe (Makroelemente) ergnzend
Stickstoffquelle (anorgan./organ.)
Mineralsalze (Phosphat, Sulfat, Chlorid)
Spurenelemente (Mikroelemente)
Metallionen [Fe, Mn, Zn, Co, Cu, Ni] komplexiert
Anionen (Borat, Vanadat, Molybdat, etc.)
Wuchsstoffe hitzeinstabil
Vitamine, Aminosuren, ungesttigte Fettsure, Sterole, ...
Effektoren Precursoren, Induktoren, Inhibitoren, etc.
Pufferstoffe Phosphate, Calciumcarbonat
 Technische Substrate
Pflanzliche Rohstoffe in Form von
Primre Rohstoffe (direkt) Getreide, Knollen, Bohnen, Holz, ...
Sekundre Rohstoffe (Nebenprodukte) Melasse, Biertrebern,
Presskuchen, .....
Abfallstoffe: Ablaugen (Sulfitablauge) - geringe Konzentration
Strkehaltige Rohstoffe Amylose/Amylopektin;
Getreide [50-70%], Knollen [20%]: mit Protein, Rohfasser, Fett, etc.
vergesellschaftet
Maniok (21 t Strke/ha.a); Kartoffel (7.5 t/ha.a); Getreide (3 t/ha.a)
Reinstrke
Malz: gekeimte Getreidesamen (enzymhaltig)
Inulin Polyfruktosan; Tobinambur, Artischoken [11 % Inulin;
30 t/ha.a]
Cellulosehaltige Rohstoffe
Lignocellulose (Cellulose/Lignin/Hemicellulosen ~ 4:3:3); Holz, Stroh,
Bagasse (Zuckerrohr), Altpapier
Cellulose: Viskose, Baumwolle
 Technische Substrate
Mono-/Disaccharide
Glucose/Fructose
Fruchtsfte (Trauben, pfel, etc.)10-30%
Strke/Cellulose-Hydrolysate (sirup) - 70 %
Glucosehydrat
Hydrol (Mutterlauge - Strkehydrolyse)
Saccharose (Sucrose)
Rbe, Rohr, Hirse, Ahorn [Extrakte/Sfte: 15-22%]
Grnsirup / Rohzucker / Raffinade
Melasse (Mutterlauge; 50% vergrb.Zucker;0.2-2,8 %N; Vitamine;
Rohr-/Rbe)
Malzextrakt: 80-85% vergrbare Zucker (Maltose, Glucose,
Oligosaccharide); 1% N; Vitamine
Laktose: Milch/Molke (3-8%) Naturform oder getrocknet
Reinlaktose
Sulfitablauge [8-10 t/t Plpe; 10-12% TS (30% Zucker {Glucose,
Mannose, Galaktose, Pentosen}]
 Technische Substrate
Fette/le Sojabohnenl, Palml, Sonneblumenl, etc.
Kohlenwasserstoffe (C1o-C20); geradkettig [Paraffinfraktion]
Alkohole
Methanol: Toxizitt; Verdampfung
Ethanol
Nhrstoffe: komplex zusammengesetzt, dienen als Quelle fr
N und als Quelle fr Mineralstoffe, Vitamine, Spurenelemente
Komponenten
Rckstnde der lgewinnung- vorwiegend N-Quelle;
komplex, 7-9%N, daneben Kohlenhydrat Fett, Rohfaser,
Vitamine
Baumwollsamenmehl [Pharmamedia; Proflo], Rapssamen/
Leinsamenmehl; Sojabohnen-/Erdnussmehl, Maissamen-
/Maisglutenmehl, Fisch-/Blutmehl
 Nhrstoffe
Proteinhydrolysate chemisch, enzymatisch (Peptone) -
Casein, Soja, Fleisch, Blut, Fisch, ..
Maisquellwasser [Corn Steep Liquor]
Abfallprodukt der Maisstrkegewinnung
3-5% N; Milchsure, Vitamine
Hefe/Hefeextrakt Extrakt nach Autolyse(50 55C)/Plasmolyse
8-11 % N; 8% Kohlenhydrat; 4 % Pi
Distillers Solubles Schlempen aus Getreidemaischen
(feststofffrei!); Mineralsalze, Vitamine
Anorganische Verbindungen N-Quelle, Mineralstoffe,
Puffersubstanzen (definierte Zusammensetzung)
Ammonsalze, Alkalinitrate, Alkaliphosphate, Alkalisulfate,
Alkalichloride
Organische Stoffe: definierte Verbindungen als N-Quelle,
Precursoren, Induktoren, Inhibitoren,Modifikatoren
Harnstoff, Aminosuren, Phenylessigsure (Plin), Anthranilsre (Try)
 Kostensituation
PREISSITUATION
Anteil an Gesamtkosten unter-
schiedlich
Antibiotika ca. 20 25 %; EtOH 40-55%,
SCP ca. 60 %, Citronensure 33%
Schwankungen des Zuckerpreises
am Weltmarkt
EU: 500.-- /t, Weltmarkt: 150,-- /t
BESP (break even substrate price) =
(Verkaufpreis[Produkt]
Herstellkosten) / notwendige
Substratrmenge
EtOH [0,11 /kg], Citronensure 0,53
/kg]; Milchsure [0,34 /kg];
Einzellerprotein [0,04 /kg]

Reismann (1988)
 Tierische Zellkultur - Medium
Grundmedium [Rezepturen: DME, Coon]
Energiequelle: Glucose, Glutamin
Mineralsalze
Puffersubstanzen (NaHCO3/Na2CO3); pH-Regelung
N-Quelle: essentielle AS bzw. Ala, Ser, Asp, Asn, Glu
Vitamine, N-Basen, Lipide, Cholin, Inosit, ..
Supplements zellspezifische Faktoren
Interleukine, Cytokinine, Anheftungsproteine, Transportprot.
Blutserum, Newborn Calf Serum, Fetal Bovine Serum (Gefahr
d. Virusinfektion)
Antioxidantien (Vit.C, E, Glutathion) Radikalfnger
Proteaseinhibitoren (Pepstatin, Leupeptin, ..)
Dextran, PEG, Methylcellulose mechan.Schutz
 Rohstoffvorbehandlung
Verdnnen/pH-Einstellung/Klren
Melasse, Sulfitablauge, etc.
 Rohstoffvorbehandlung
Verflssigung strkehaltiger Materialien
-Verkleisterung [Aufschluss/Gelbildung]
Henze-Dmpfer: 4 6 bar; 140-160C
Extrusionskocher kontinuierlich
Verflssigung: -Amylase-Zusatz
Maischbottich
 Rohstoffvorbehandlung
Vorbehandlung cellulose(lignocellulose)-haltiger Rohstoffe
(hochkristallin; Schutzschicht aus Lignin)
Quellung
Intermizellare Quellung (Wasser; Dampf)
Intramizellare Quellung (Alkali ( 8%); Amine, Metallsalze (Zn)
Vorhydrolyse Erleichterung eines nachfolgenden Abbaus
Mechanische Behandlung (Zerkleinern, Vermahlen)
Physikalische Behandlung (Dampfextrusion)
Chemische Behandlung
Lsen v. Cellulose (Cadoxen; CSMS)
Lsen v. Lignin (Sulfit; Hypochlorit, Peroxid/Ozon)
Hydrolyse Abbau zu Glucose
Surehydrolyse (Bergius-Rheinau (HCl 40%; RT); Scholler-Tornesch
(Schwefelsure 0.4%; 170 C) teilweise Zerstrung d.Glucose
Enzymatisch (mikrobielle Cellulasen) keine Zersetzung; hohe
Ausbeuten; langsamer Prozess (Pilot-Verfahren!)
 Rohstoffvorbehandlung
Vorbehandlung und Zuckerausbeute (Dale, 1987)
Rohstoff Vorbehandlung Ausbeute in 24h Hydr.
Weizenstroh Natronlauge 0,29 g/g
Roggenstroh Schwefelsure 0,30
Baumwollabflle Ozon 0,31
Weizenstroh Vermahlung (Kugelmhle) 0,26
Pappelholz Vermahlung 0,30
Espenholz Dampfexplosion 0,44
Espenholz Ammoniak-Explosion 0,45
 Reinigung
Entfernung von Rckstnden (Organismus, Medium)
Reinigungseffekte abhngig von
Scherkrfte (Fliegeschwindigkeit) / Temperatur / Chemikalien /
Dauer (Zeit)
Manuelle Reinigung
Splen mit Leitungswasser
Reinigungslsungen (0.1-1 M NaOH; 60-70oC, X hrs; 0.1 0.5 M
H3PO4 (HNO3), T<90oC, t< 1 hr; Lsung proteolyt. Enzyme, X hrs )
Splen mit Leitungswasser, entmineral. (pyrogenfreies) Wasser
Cleaning in Place (CIP) automatische Systeme
Waschkche mit Behlter f. Reinigungslsungen
Wrmeaustauscher und Verrohrung zum Reaktor
Sprheinrichtungen im Reaktor (Sprhkopf/Sprhventile)
Sprhmenge: ca. 30-40 L/min/m Umfang; keine Aerosolbildung
 Sterilisation
Definitionen:
Inaktivierung: vollstndige Zerstrung aller biolog.Aktivitten
(lebende Zellen, Viren, Prionen, Plasmide)
Sterilisation: vollstndige Zerstrung aller lebensfhiger
Organismen
Desinfektion: Keimzahlreduktion (pathogene Zellen) bis
unter die Gefhrdungsgrenze
Kontamination: Behaftung mit biologischer Aktivitt
Achtung: Es gibt kein universelles Verfahren !
Abhngig von
Eigenschaften des Sterilisationsgutes
(Temperaturbestndigkeit)
Art und Umfang der Kontamination
 Sterilisation
Sterilisationsmethoden:
Thermisch (Flamme, trockene Luft, Sattdampf)
Chemisch (Oxidationsmittel, Radikale, Alkohole, Formaldehyd)
Filtration
Energiereiche Strahlung ( , UV)
Desinfektionsmethoden:
Thermisch:
Pasteurisieren: 62C; 30 min
Kurzzeiterhitzung: 72-74C, 20 sec
Ultrahocherhitzung: 85C, 5 sec
Tyndallisieren: 100C; 30 min / 30C; 4 h (2x Wiederholung)
Chemisch:
EtOH (70%; brennbar! vegetat. Bakterien),
Natriumhypochlorid (pH 4-6.5, Bakterien, Sporen, Viren),
Peressigsure (pH 2-3.5; Bakterien, Sporen, Viren, Pilze)
 Hitzesterilisation
Kinetik: -dN/dt = k * N integriert
ln(N/No) = k*t
k .... abhngig von:
Art des Mikroorganismus /
physiologischer Zustand
Umgebungsbedingungen (pH,
Feststoffe im Medium, Dampfsttigung)
Temperatur:
k = A * e-E/R*T ln k = -E/R * 1/T + ln A
[Bac.stearotherm.: A = 4,9*1037 sec-1; E = 283.4
kJ/mol]
[Allgemein: E = 170 - 340 kJ/mol - feuchte Hitze
E= 50-100 kJ/mol trockene Hitze] bzw. A =
1035 1037 sec-1]
D-Wert (Destruktionswert/
Dezimalreduktionswert) N= No/10
D = -1/k * ln(1/10) = 2.303 / k
z.B. D121C = 1.5 min (Bac.stearotherm.)
 Hitzesterilisation
Sterilisationskriterium: SL = ln(N/No); ;No = ~ 106 Zellen/ml;
N = 1 Keim/1000 Sterilisationen (= 99.9 % Sicherheit) Technik
N = 1 Keim/1.000.000 Sterilisationen - Hygiene
SL = ln [ V * 106 * 103 / 10-3] = ln (V * 1012) [z.B. Behlter m. Volumen V]
Volumennderung: SL2 = SL1 + ln (V2/V1)
SL = D * log(No/N) =1/ k * ln(No/N) bei T = const.
SL = k(T) dt [Aufheizphase, Haltephase, Abkhlphase]
Resistenzstufen [No = 106; N = 10-6]
I pathogene Streptokokken, Listerien, Polioviren 61,5C 30 min
II vegetat.Bakterien,Hefen,Schimmelpilze, Viren 80C 30 min
III Hepatitis-B-Viren, Pilzsporen 100C 5-30 min
IV Bacillus anthracis-Sporen 105C 5 min
V Bacillus stearothermophilus-Clostriedien-Sporen 121C 15 min
VI Prionen 132C 60 min
 Hitzesterilisation
Gertesterilisation: (Reaktor / Leitungen / Filter)
Sattdampfsterilisation bei Temperaturbestndigkeit bzw.
Druckfestigkeit (Dichtungen!); Entfernung der Restluft!
(Vakuum/Verdrngung);Kondensatablauf vorsehen!
Totbereiche als Infektionsquellen!
Heiluftsterilisation (trocken): Kleingerte [150 - 250C; 30
180 min]
Mediensterilisation:
Sattdampfsterilisation bei 121C und 20 30 min Dauer
Nebenreaktionen: (Reaktionen in Nhrmedien)
Inaktivierung v. Vitaminen [Folsure, Thiamin*HCl; Riboflavin,
D-Panthothenyl-Alkohol; Cyanocobalamin) E = 70 100
kJ/Mol
Maillard-Reaktion (Brunungsreaktion; AS + red.Zucker))
Isomerisierung v. Sacchariden (Glucose Fructose)
Fllungen: 3 Ca2+ + 2 HPO42- Ca3(PO4)2 + 2 H+
 Mediensterilisation
Durchfhrung:
Absatzweise: (Medium und Reaktor) Reaktor
als Druckgef
Sterilisation im Autoklav: Laborreaktoren (3 15L);
Bruchgefahr beim Transfer zum Arbeitsplatz;
Entfernung von Restluft (Headspace) schwierig
(ev. Vakuum); langsamer Wrmebergang
lange Zeiten
Sterilisation in place (SIP): Medium und Reaktor
vor Ort sterilisiert; Wrmezufuhr ber Duplikat,
Heizschlangen (Heizdampf), elektr. Heizfinger,
Einblasen von Reindampf (Volumszunahme!);
kochendes Medium (100C) verdrngt Restluft;
anschlieend Schlieen der Abluftleitung.
[Tranferleitungen, Filter, etc. sind separat zu
sterilisieren]
Sterilisation des leeren Reaktors in place und
separate Sterilisation des Mediums: Kurze
Aufheiz-/Abkhlzeiten; Luft im Reaktor entfernen
(Vakuum!) Implosionsgefahr beim Abkhlen
(Zufuhr steriler Luft!). Fr empfindliche Medien
bzw. Groreaktoren [500 m3]
 Mediensterilisation
Kontinuierlich: kurze Haltezeiten und
hhere Temperaturen mglich
[>130C; ~90sec]
Wrmeaustauscher mit Heihaltestrecke;
Direktdampf/Entspannungskhlung alternativ
 Mediensterilisation
Filtration
Membranfilter (< 1 m); groe Flche, Vorfilter (Viren nicht
entfernt!) vorwiegend fr thermolabile
Mediumskomponenten
Chemikalien nach Einwirkung zu entfernen
-dN/dt = k(T)* ca * N ln(N/No) = -k(T) * ca * t
Oxirane (Ethylenoxid), Methyloxirane (Propylenoxid) [1%,
1h; 4C durch Erwrmen entfernt (Sp: 11C); explosiv
2-Oxethanon (-Propiolacton) [0.75%; 2 h; 37C rasche
Hydrolyse
Bei Inaktivierung des Mikroorganismus nach Ende der Kultivierung
knnen auch andere Mittel (Phenole, Chloroform, etc) eingesetzt
werden (Sicherheitsanforderung!)
 Luftsterilisation
Keimgehalt: 750-3000 Zellen/m3
Membranfiltration: Siebeffekt;
hydrophobes Material (Teflon); hohe
Flche, unabhngig v. Flussrate; mehrfach
verwendbar; leicht erneuerbar
Tiefenfilter Wirkung d. Stosseffekte,
Abfangeffekte u. Diffusionseffekte
Material: Glaswolle, Aktivkohle, Keramik (pors)
 Luftsterilisation
Tiefenfilter: Vorteil: einfach; billig
-dN/dL = K * N ln (N/No) = - K * L
L90 [Filterlnge f. eine Reduktion auf 1/10] L90 = 2,303 / K
K ist abhngig von
Filtermaterial (Partikeldurchmesser, -dichte, -oberflche)
Leervolumen Packung
Strmungsgeschwindigkeit (kritische Raten!) [m/sec]
Nachteile: Kondensat bewirkt Wirkungsverlust; Kanalbildung; schwierige Erneuerung
 Sicherheit
Keine Freisetzung von gefhrlichen biologischen
Material bei Pathogenitt fr Mensch, Tier oder
Pflanze
Risikoklassen (Sicherheitsstufen)
(1) kein oder vernachlssigbares Risiko: Sorgfalt, Hygiene
(GILSP [Good Industrial Large Scale Practises])
(2) geringes Risiko (Sicherheitsstufe 1):Emissionen
minimieren (e.g. Abluft Aerosol-frei [Cyclon])
(3) miges Risiko (Sicherheitsstufe 2): Emissionen
verhindern (e.g.Abluftsterilisation (Filter / Wrme))
(4) hohes Risiko (Sicherheitsstufe 3): Emissionen
unterbinden (e.g. Abluft: zweifache Filterung; aseptischer
Filtertausch)