Cintica Qumica Biolgica

Manual de Laboratorio
Rosa Mara Zavaleta Martnez.
 Manual de Laboratorio 2
Cintica Qumica Biolgica

NDICE

REGLAMENTO DE LABORATORIO 3

Construccin de una curva de calibracin 4

Comprobacin del principio de Le Chatelier 6

Velocidad de reaccin 10

Determinacin cualitativa de la actividad de -amilasa en Bacillus thuringiensis 13

Medicin de la actividad de Polifenoloxidasa extrada de manzana 15

Inhibidores de la actividad de Polifenoloxidasa extrada de manzana 18

Curva de crecimiento microbiano 20

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 Manual de Laboratorio 3
Cintica Qumica Biolgica

REGLAMENTO DE LABORATORIO

1. EL PRESENTE REGLAMENTO ES APLICABLE PARA LOS

LABORATORIOS DE INGENIERA BIOQUMICA, SU OBSERVANCIA
ES OBLIGATORIA PARA TODAS LAS PERSONAS INVOLUCRADAS
EN LAS PRCTICAS DE LABORATORIO.
2. MANTENER LA CORDIALIDAD Y RESPETO ENTRE ALUMNOS,
DOCENTE Y TCNICOS DE LABORATORIO.
3. QUEDA PROHIBIDA LA ENTRADA A PERSONAS AJENAS AL
LABORATORIO DURANTE EL DESARROLLO DE CADA UNA DE LAS
PRCTICAS.
4. ES OBLIGATORIO USAR GAFETE CON FOTOGRAFA Y BATA
BLANCA DE ALGODN, ABOTONADA, LIMPIA, DE MANGA LARGA Y
EQUIPO DE SEGURIDAD SI ASI LO REQUIERE LA PRCTICA.
5. PROHIBIDO USAR ZAPATO ABIERTO Y CON TACN, FALDA,
PANTALN CORTO, ARETES, PULSERAS Y CUALQUIER OTRO
TIPO DE ACCESORIO PERSONAL.
6. PROHIBIDO UTILIZAR EL TELFONO CELULAR, TABLETA
ELECTRNICA, AUDFONOS Y CUALQUIER DISPOSITIVO
ELECTRNICO DURANTE LA PRCTICA.
7. QUEDA PROHIBIDO FUMAR E INGERIR ALIMENTOS.
8. PROHIBIDO JUGAR DENTRO DEL LABORATORIO.
9. EN CASO DE SINIESTRO RESPETAR EL PLAN DE CONTINGENCIA
Y OBEDECER LAS INDICACIONES DEL TCNICO DE
LABORATORIO.
10. EL EMPLEO Y USO DE MATERIALES DE LABORATORIO SLO
PODR EFECTUARSE MEDIANTE LA ENTREGA DEL VALE
CORRESPONDIENTE (SOLICITARLO CON EL TCNICO).
11. ENTREGAR LIMPIO, SECO Y EN BUENAS CONDICIONES EL
MATERIAL AL TRMINO DE CADA PRCTICA.
12. CUALQUIER MUESTRA ALMACENADA EN LOS REFRIGERADORES
E INCUBADORAS Y CUARTO FRO DEBERN ESTAR
DEBIDAMENTE EMPAQUETADAS E IDENTIFICADAS CON NOMBRE
COMPLETO DEL ALUMNO, FECHA DE ENTRADA, TIPO DE
MUESTRA, NOMBRE DE LA ASIGNATURA, NOMBRE DEL
PROYECTO, NOMBRE DEL PROFESOR RESPONSABLE.
13. TODO RESIDUO TXICO PELIGROSO DEBER SER CONFINADO
EN CONTENEDORES ESPECIALES, ETIQUETADOS Y CERRADOS
HERMTICAMENTE PARA SU DISPOSICIN FINAL.
14. ANTES DE DESECHAR LOS MEDIOS DE CULTIVO DEBERN
PROCEDER A SU INACTIVACIN.
15. EL TCNICO, DOCENTE Y ALUMNOS DEBEN ASISTIR
PUNTUALMENTE Y PERMANECER EN EL LABORATORIO DURANTE
EL DESARROLLO DE LA PRCTICA.

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 Manual de Laboratorio 4
Cintica Qumica Biolgica

16. DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRCTICA EL ALUMNO DEBER

COLOCAR SUS TILES FUERA DEL REA DE TRABAJO Y
COLOCARLOS EN LOS ESPACIOS DESTINADOS.
17. EN CASO DE NO FINALIZAR LA PRCTICA, SE LE PODR DAR
CONTINUIDAD SI HAY DISPONIBILIDAD DE HORARIO Y
REGISTRARSE EN BITCORA.
18. TODO PROYECTO DE RESIDENCIA O INVESTIGACIN DEBE
REALIZARSE BAJO SUPERVISIN DE SU ASESOR Y CON LA
AUTORIZACIN NECESARIA.

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 Manual de Laboratorio 5
Cintica Qumica Biolgica

PRCTICA No. 1

CONSTRUCCIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN

FUNDAMENTO:

El espectrofotmetro puede usarse para la determinacin colorimtrica de la concentracin. El

proceso se basa en el hecho de que los iones coloreados absorben (y transmiten) luz en el
espectro visible. Mientras mayor sea la concentracin de los iones, mayor ser la absorbencia.

El espectrofotmetro debe estar ajustado a la longitud de onda de mxima absorbencia del

in, mientras se hacen las pruebas con los estndares. Una grfica que relaciona la
absorbencia ( el % de transmitancia) con las concentraciones de los estndares, nos da una
curva de calibracin. La absorbencia (% de T) puede ser entonces medida para una solucin
de concentracin desconocida y puede ser comparada con la curva para determinar su
concentracin. La concentracin del in cobalto (Co 2+) se determinar en ste experimento, la
absorbencia mxima para el Co2+ es a una longitud de onda de 510nm.

PROPSITO

Preparar una serie de soluciones de Co2+ y medir el %T de las soluciones y elaborar una curva
de calibracin. Con sta curva determinar experimentalmente la concentracin de una
solucin de molaridad desconocida.

MATERIALES REACTIVOS

2 pipetas graduadas de 10ml solucin estndar de Co(NO3)2 0.1M

1 probeta de 50ml agua destilada
2 vasos de precipitados de 50ml
5 tubos de ensayo de 15x125mm
1 gradilla
1 pizeta con agua destilada
2 jeringas con manguera

PROCEDIMIENTO
A. Preparacin de soluciones estndar.

1.-Rotular 5 tubos de ensayo con las siguientes diluciones: 2:10, 4:10, 6:10, 8:10 y
concentrado.

2.-Depositar 8, 6, 4, 2 y 0ml de H2O destilada respectivamente.

3.-Depositar 2, 4, 6, 8 y 10ml de Co(NO3)2 0.1M respectivamente en la misma serie de tubos.

4.-Leer el %T en el espectrofotmetro y registrar sus datos en una tabla como la siguiente:

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 Manual de Laboratorio 6
Cintica Qumica Biolgica

Soluciones estndares Sol.

desconocida
Tubo 1 2 3 4 5 6
Dilucin 2:10 4:10 6:10 8:10 10:10
Molaridad
%T

RESULTADOS

1.-Determinar matemticamente la molaridad de las soluciones 1-5 partiendo del dato de

concentracin de la solucin original.
2.-Construir una grfica en papel milimtrico, relacionando el %T (ordenadas) con la molaridad
(abscisas). Ajustar la recta por regresin lineal.
3.-A partir del dato de %T obtenido para el tubo 6, determinar la molaridad de la solucin.
4.-Buscar el significado de los trminos: absorbencia, transmitancia, Ley de Lambert-Beer.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

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 Manual de Laboratorio 7
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PRCTICA No. 2

COMPROBACIN DEL PRINCIPIO DE LeCHATELIER

FUNDAMENTO:

El movimiento de las molculas en los sistemas fsicos en sistemas de reaccin qumica

siempre es continuo y dinmico, y es influenciado por diferentes factores.
El principio de Le Chatelier indica que si un sistema qumico en equilibrio es sometido a una
condicin de estrs (cambio en la concentracin, temperatura, etc.), entonces el equilibrio se
desplaza en la direccin que minimiza el efecto de tal estrs.

PROPSITO
Comprobar el efecto de los cambios en la concentracin y la temperatura sobre la posicin de
equilibrio en diferentes sistemas qumicos.

MATERIALES REACTIVOS

2 pipetas graduadas de 1ml Na2CO3 0.1M

7 goteros AgNO3 0.1M
1 vaso de precipitados de 50ml HNO3 6M
5 tubos de ensayo de 15x125mm con tapn de rosca HCl 0.1M
1 pinzas para tubo de ensayo NH3 concentrado
1 gradilla KI 0.1M
1 pizeta con agua destilada Na2S 0.1M
1 hot plate HCl concentrado
1 vaso de precipitados de 250ml NH4Cl
CoCl2 1M

PROCEDIMIENTO
A. Equilibrio del in plata.

1.-Depositar 10 gotas de AgNO3 0.1M en un tubo de ensayo. Adicionar 10 gotas de Na2CO3

0.1M y registrar sus observaciones en una tabla.
El carbonato de plata precipita en presencia de un exceso de iones Ag+ y CO3-2 en solucin
acuosa para establecer un equilibrio dinmico entre el slido y los iones en solucin.
Ag2CO3(s) 2 Ag+(ac) + CO3-2(ac)

2.-Adicionar al mismo tubo algunas gotas de HNO3 6M hasta que no observe cambios en la
reaccin. Registrar sus observaciones en la tabla del paso anterior.

La adicin de HNO3 causa que el carbonato de plata slido se disuelva: los iones H+ del HNO3
reaccionan con los iones CO3-2, removiendo al CO3-2 del equilibrio. El sistema se desplaza hacia
la derecha para compensar la remocin de los iones carbonato, ocasionando que el carbonato
de plata se disuelva. El H+ y el CO3-2 se combinan para formar H2CO3, el cual debido a su
inestabilidad a presin y temperatura ambiente, se descompone en CO2 y H20.
3.-Adicionar al mismo tubo algunas gotas de HCl 0.1M, hasta que no observe cambios en la
reaccin. Registrar sus observaciones en la tabla del paso 1.

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 Manual de Laboratorio 8
Cintica Qumica Biolgica

4.-Permitir la formacin del precipitado y descartar aproximadamente la mitad del

sobrenadante con una pipeta y desecharlo. Agregar (EN CAMPANA DE EXTRACCIN DE
VAPORES) algunas gotas de NH3 concentrado (PRECAUCIN: evitar la inhalacin y el contacto
de la piel con el reactivo) hasta que el precipitado se disuelva y la solucin se aclare. Registrar
sus observaciones en la tabla del paso 1.

Al agregar el NH3, se forma el complejo inico diamina de plata, el cual permanece en solucin.

5.-Reacidificar la solucin con algunas gotas de HNO3 6M y registrar sus observaciones. Qu

sucede si se agrega un exceso de NH3 concentrado? Prubelo y Registrar sus observaciones en
la tabla del paso 1.

6.-Adicionar 10 gotas de KI 0.1M al mismo tubo y agitar. Registrar sus observaciones en la tabla
del paso 1.

7.-Adicionar 10 gotas de Na2S 0.1M. Registrar sus observaciones en la tabla del paso 1.

B. Solucin saturada de cloruro de amonio.

1.-Preparar una solucin saturada de cloruro de amonio con agua desionizada en un tubo de
ensayo. Tocar el fondo del tubo con la mano y registrar si se trata de una reaccin endotrmica
exotrmica.

2.-Transferir 10 gotas del sobrenadante concentrado a otro tubo y adicionarle de 2 a 3 gotas

de HCl concentrado hasta que ocurra un cambio en la apariencia de la solucin. Escribir una
ecuacin qumica para explicar lo ocurrido.

RESULTADOS

Elaborar una tabla de acuerdo a la secuencia de experimentos y escribir delante la ecuacin

para cada caso as como los cambios observados en apariencia, color, temperatura, etc.

Anotar los clculos para la preparacin de cada uno de los reactivos usados en la prctica.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

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 Manual de Laboratorio 9
Cintica Qumica Biolgica

PRCTICA No.3

VELOCIDADES DE REACCIN

FUNDAMENTO:

Existen varias condiciones que pueden alterar la velocidad de una reaccin qumica. Los
parmetros experimentales que nosotros podemos cambiar incluyen: temperatura,
concentracin, y presin (si se trata de gases), adems de la sustitucin de una sustancia por
otra ms reactiva, el estado de subdivisin de un reactivo (si es slido lquido), la inclusin
de un catalizador que pueda incrementar la velocidad de reaccin.

Un cambio en la temperatura incrementa la velocidad de reaccin debido a que incrementa el

promedio de energa cintica de las molculas reactantes. La distribucin de la energa
adicional entre los tomos en las molculas colindantes, incrementa la probabilidad de que los
enlaces se rompan. La subsecuente recombinacin de los fragmentos puede resultar en la
formacin de producto, obteniendo un incremento global en la velocidad de reaccin.

Un incremento en la concentracin de un reactivo, incrementa la probabilidad de colisin

entre las molculas reactantes ( iones). Como resultado, muchas velocidades de reaccin se
incrementan cuando las concentraciones de reactivo incrementan tambin, aunque hay
sistemas en los cuales hay un decremento no ocurre cambio en la velocidad de reaccin.

Ocurre ms rpidamente una reaccin cuyos reactantes tengan un tamao pequeo de

partcula; por otra parte, los catalizadores generalmente cambian el mecanismo de una
reaccin disminuyendo su energa de activacin y por lo tanto, haciendo que ocurra ms
rpidamente.

PROPSITO

Medir y comparar las velocidades de reaccin, considerando la influencia de variables como:

temperatura, concentracin y grado de subdivisin de los reactivos.

MATERIALES REACTIVOS

3 pipetas graduadas de 10ml solucin de Na2S2O3 0.1M

2 vidrios de reloj solucin de HCl 0.1M y 6M
3 vasos de precipitados de 50ml trozo de gis (CaCO3)
11 tubos de ensayo de 15x125mm polvo de gis
1 gradilla agua destilada
1 pizeta con agua destilada hielo molido
3 jeringas con manguera
cronmetro
hot plate
1 vaso de precipitados de 250ml
1 termmetro

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 Manual de Laboratorio 10
Cintica Qumica Biolgica

PROCEDIMIENTO

A. Influencia de la Concentracin de reactivo.

1.-Rotular 5 tubos de ensayo de 16x125mm con las siguientes diluciones: 1:2, 1:4, 1:5, 1:10 y
1:20 y colocarlos en una gradilla. Las diluciones se harn a partir de una solucin patrn de
tiosulfato de sodio 0.1M.

2.-Realizar los clculos respectivos (para preparar 5ml de cada dilucin) y proceder a preparar
las diluciones con agua destilada. El experimento se llevar a cabo a temperatura ambiente.

3.-Agregar al primer tubo 5ml de HCl 0.1M y enseguida tomar el tiempo que tarda en aparecer
una coloracin blanca en forma de nubosidad, lo cual est indicando la formacin de SO2,
como se indica en la siguiente reaccin:

2HCl (ac) + Na2S2O3 (ac) S (s) + SO2 (g) + 2 NaCl (ac) + H2O (l)

4.-Registrar los datos de tiempo de reaccin en una tabla como la siguiente y graficar tiempo
(en segundos) contra molaridad (M) de Na2S2O3 . Realizar el mismo procedimiento con los
otros 4 tubos.

Tubo 1 2 3 4 5
Dilucin 1:2 1:4 1:5 1:10 1:20
Molaridad
tiempo

B. Influencia de la Temperatura de reaccin.

1.-Rotular 3 tubos de ensayo de 16x125mm con las siguientes temperaturas: fro, ambiente,
35C y colocarlos en una gradilla. Pipetear 5ml de tiosulfato de sodio 0.1M en cada tubo.
Pipetear 5ml de HCl 0.1M en otra serie de 3 tubos de la misma medida.

2.-Llevar una pareja de tubos (1 con Na2S2O3 0.1M y otro con HCl 0.1M) al interior de un bao
de hielo y permitir que tomen la temperatura del mismo (aproximadamente 5 minutos).
Enseguida adicionar el HCl al tubo que contiene el tiosulfato de sodio y medir el tiempo que
tarda en aparecer una coloracin blanca en forma de nubosidad, lo cual est indicando la
formacin de SO2.

3.-Repetir el paso nmero 2, pero ahora hacerlo a temperatura ambiente.

4.-Repetir el paso nmero 2, pero a una temperatura de 35C.

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 Manual de Laboratorio 11
Cintica Qumica Biolgica

5.-Registrar los datos de tiempo de reaccin en una tabla como la indicada para la seccin A y
graficar tiempo (en segundos) contra temperatura (C) .

C. Grado de subdivisin.

1.-pesar aproximadamente 0.2g de gis (CaCO3) y depositarlo en un vidrio de reloj. Pesar la

misma cantidad pero sta vez usar polvo de gis y depositar en otro vidrio de reloj.

2.-Adicionar a la primera muestra algunas gotas de HCl 6M hasta que se haya disuelto todo el
gis. Registrar la cantidad de gotas de HCl que gast para tal efecto.

3.- Adicionar a la segunda muestra algunas gotas de HCl 6M hasta que se haya disuelto todo el
polvo de gis. Registrar la cantidad de gotas de HCl que gast para tal efecto.

RESULTADOS

1.-Determinar matemticamente la molaridad de las soluciones 1-5 de la seccin A, partiendo

del dato de concentracin de la solucin original.
2.-Construir una grfica en papel milimtrico, relacionando el tiempo vs la temperatura de
reaccin y en otra grfica el tiempo vs la concentracin de tiosulfato de sodio.
3.-A partir del dato de gotas gastadas en la seccin C, explicar sus observaciones de acuerdo al
fundamento de la prctica.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

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 Manual de Laboratorio 12
Cintica Qumica Biolgica

PRCTICA No. 4

DETERMINACIN CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE -AMILASA EN Bacillus thuringiensis

FUNDAMENTO

Las especies del gnero Bacillus crecen bien en medios definidos utilizando distintas fuentes de
carbono. Muchos producen enzimas extracelulares, que rompen polisacridos complejos,
cidos nucleicos cidos grasos hasta unidades asimilables por la clula. Otros producen
antibiticos como la bacitracina, polimixina, tirocidina, gramicidina y circulina. Algunas de sus
especies com B. popilliae y B. thuringiensis producen toxinas larvicidas de insectos.
El almidn es un polisacrido de glucosa que es catabolizado por la alfa amilasa, producida por
muchos hongos y bacterias, entre ellas, B. thuringiensis.
Las amilasas son de considerable utilidad en industrias donde debe digerirse almidn, tales
como en la industria textil, en lavanderas, y en las industrias papelera y alimentaria.

PROPSITO

Determinar a nivel cualitativo la actividad enzimtica de una exoenzima microbiana y

establecer la relacin existente entre cantidad de inculo bacteriano y actividad biolgica.

MATERIALES REACTIVOS

3 pipetas graduadas de 10ml peptona

1 matraz Erlenmeyer de 250ml extracto de levadura
1 matraz Erlenmeyer de 125ml NaCl
1 vaso de precipitados de 250ml almidn soluble
5 tubos de ensayo de 13x125mm agua destilada
1 probeta de 100ml K2HPO4
1 gradilla agar
1 hot plate
4 cajas Petri de vidrio
1 esptula
1 jeringa con manguera
4 pipetas de 1ml

PROCEDIMIENTO

1.-Preparar 100ml de agar almidn de acuerdo a las siguientes instrucciones: en 50ml de agua
destilada, disolver 0.3g de almidn soluble, calentar y agitar. Solubilizar los otros ingredientes
en el agua restante (peptona 0.5g, extracto de levadura 0.5g, K2HPO4 0.5g, agar 1.8g), mezclar
las 2 partes y esterilizar en autoclave durante 15min a 15lb/in2. Una vez tibio el agar, verter en
las cajas Petri, que debern esterilizarse junto con las pipetas y los tubos con medio LB.

3.-Preparar 50ml de caldo LB de acuerdo a las siguientes instrucciones: pesar 0.5g de peptona,
0.5g de NaCl y 0.25g de extracto de levadura, disolver en 50ml de agua destilada, adicionar
9.9ml de medio a los tubos y esterilizar bajo las mismas condiciones que en el caso anterior.

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 Manual de Laboratorio 13
Cintica Qumica Biolgica

4.-Rotular los tubos de ensayo con las siguientes preparaciones: muestra concentrada, 1:100,
1:10,000, 1:1,000,000 y control; colocarlos en una gradilla. Las diluciones se harn a partir de
un inculo concentrado de B. thuringiensis, usando como diluyente caldo LB.

5.-Inocular en el agar 0.02ml (o una gota) de cultivo bacteriano como se muestra en la Fig. 1

6.-Dejar secar las cajas en la campana de flujo laminar y posteriormente incubarlas a 35C
durante 24h.
7.-Una vez cumplido el tiempo de incubacin, retirar el crecimiento bacteriano con un
cubreobjeto limpio.

Fig.1 Divisin de la caja Petri para inocular

8.-Cubrir la caja con una capa lquida de lugol. Dejar reposar 1minuto y desechar el colorante.

9.-Realizar una medicin del halo de degradacin (dimetro) producido a causa de la actividad
de -amilasa.

RESULTADOS

Elaborar una grfica donde se relacione la medida del halo de degradacin vs la concentracin
de bacterias.
Proponer una explicacin de lo observado.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

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 Manual de Laboratorio 14
Cintica Qumica Biolgica

PRCTICA No. 5

MEDICIN DE LA ACTIVIDAD DE POLIFENOLOXIDASA EXTRADA DE MANZANA

FUNDAMENTO

Las polifenoloxidasas (PFO) que se encuentran en las plantas, son las responsables de las
reacciones de pardeamiento enzimtico que ocurren durante el almacenamiento,
manipulacin y procesamiento de frutas y vegetales. Las PFO tambin conocidas como
tirosinasas, fenoloxidasas, monofenoloxidasas o cresolasas, catalizan la hidroxilacin de
monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se
polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrn, rojo o negro, dependiendo
de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. Estas reacciones modifican
las caractersticas organolpticas y nutricionales del alimento, depreciando su calidad.
Ocasionalmente, este cambio de color es deseado.

PROPSITO

Obtener un extracto enzimtico a partir de manzana y medir la actividad polifenoloxidasa, as

como algunos parmetros cinticos como KM y Vmx.

MATERIALES REACTIVOS

1 balanza granataria Na2HPO4

1 licuadora HCl para ajustar pH
1 cuchillo NaOH para ajustar pH
1 tabla para picar Soluciones buffer de pH
1 vaso de precipitados de 250ml catecol
1 vaso de precipitados de 500ml
1 probeta de vidrio de 250ml
15 tubos Falcon de 15ml
1 hielera
1 potencimetro
Centrfuga
2 matraces Erlenmeyer de 50ml
1 pipeta graduada de 10ml
1 pipeta graduada de 5ml
1 probeta de 100ml
2 celdas para espectrofotmetro
tiras indicadoras de pH
1 gradilla
1 esptula
1 jeringa con manguera

PROCEDIMIENTO

I.-OBTENCIN DE EXTRACTO ENZIMTICO.

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 Manual de Laboratorio 15
Cintica Qumica Biolgica

1.-Pesar 300g de tejido vegetal, homogeneizar en una licuadora con 300ml de buffer 1 (fosfato
dibsico de sodio 50mM pH 6.5). Realizar ste paso en el menor tiempo posible y en fro.

2.-Mantener en hielo 10 tubos Falcon de 15ml, agregar el homogeneizado a los tubos y

pesarlos por pares para meterlos a centrifugar. Mantenerlos en hielo una vez que se ha
equilibrado el peso.

3.-Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 4000rpm. Colectar el lquido sobrenadante

en un nuevo tubo y mantenerlo en refrigeracin hasta su uso, en hielo si lo va a usar
inmediatamente.

II.-DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA.

1.-Preparar 30ml de catecol 50mM, usando como diluyente el buffer fosfato 50mM pH 6.5, y
mantener la mezcla a temperatura ambiente.

2.-En un matraz Erlenmeyer de 50ml, poner 1.5ml de buffer adicionado con catecol. Adicionar
12.5ml del extracto enzimtico e inmediatamente hacer lecturas de absorbancia a 400nm,
cada 10 segundos, durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Usar como blanco la solucin
preparada en el paso 1.

3.-Para determinar las unidades enzimticas (actividad enzimtica), considerar que una unidad
de actividad PFO (polifenoloxidasa) corresponde a un aumento de 0.001 unidades de
absorbancia por minuto y por ml de enzima.

4.-Hacer una tabla donde incluya los datos registrados de absorbancia y tiempo. Graficar sus
resultados (Absorbancia vs tiempo, actividad vs tiempo y actividad vs absorbancia).

III.-DETERMINACIN DEL EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD PFO.

1.-Incubar durante 20 minutos a 40C, 12.5ml del extracto enzimtico.

2.-Enfriar la mezcla en bao de hielo. Una vez alcanzada la temperatura ambiente, agregar
1.5ml de buffer + sustrato y determinar la actividad enzimtica repitiendo los pasos 2, 3 y 4 del
punto II.

IV.-DETERMINACIN DEL EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD PFO.

1.-Ajustar el pH al extracto enzimtico a un valor de 9.0.

2.-Agregar 1.5ml de buffer + sustrato y determinar la actividad enzimtica repitiendo los pasos
2, 3 y 4 del punto II.

V.-DETERMINACIN DE KM y Vmx.

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 Manual de Laboratorio 16
Cintica Qumica Biolgica

1.-Hacer una serie de reacciones a diferentes concentraciones de catecol en buffer fosfato pH

6.5: 20, 80, 110 y 140mM, con la misma cantidad de extracto enzimtico (12.5ml).

2.-Enseguida hacer las lecturas de absorbancia cada 10s durante 10 min. Tabular y graficar sus
resultados. Para encontrar los datos cinticos, KM y Vmx, determinar primero la actividad
enzimtica al inicio de la reaccin (velocidad inicial). Con los datos de concentracin de
sustrato y velocidad inicial, trazar la grfica de dobles inversos de Lineweaver-Burk para
determinar los valores de KM y Vmx.

RESULTADOS

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

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 Manual de Laboratorio 17
Cintica Qumica Biolgica

PRCTICA No. 6

INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE POLIFENOLOXIDASA EXTRADA DE MANZANA

FUNDAMENTO

La vida depende de la existencia de catalizadores poderosos y especficos: los enzimas.

Prcticamente cada reaccin bioqumica est catalizada por una enzima. Con la excepcin de
unos cuantos RNA catalticos (ribozimas), todos los enzimas son protenas.
Los enzimas se pueden inactivar por modificacin irreversible de un grupo funcional esencial
para la actividad cataltica. Tambin se pueden inhibir por molculas que se fijan
reversiblemente. Los inhibidores competitivos compiten reversiblemente con el sustrato para
fijarse en el sitio activo, pero no son transformados por el enzima. Los inhibidores
acompetitivos se fijan al complejo ES en un sitio diferente del centro activo. En la inhibicin
mixta, un inhibidor se fija a E a ES, tambin en un sitio distinto del que une el sustrato.

PROPSITO

El alumno(a) har una serie de experimentos en los que observar y cuantificar el efecto
inhibidor de diferentes sustancias sobre la actividad de la PFO extrada de manzana.

MATERIALES REACTIVOS

1 balanza granataria Na2HPO4

1 licuadora HCl para ajustar pH
1 cuchillo NaOH para ajustar pH
1 tabla para picar Soluciones buffer de pH
1 vaso de precipitados de 250ml catecol
1 vaso de precipitados de 500ml cido ascrbico
1 probeta de vidrio de 250ml cido benzoico
15 tubos Falcon de 15ml NaCl
1 hielera
1 potencimetro
Centrfuga
3 matraces Erlenmeyer de 50ml
1 pipeta graduada de 10ml
3 pipetas graduadas de 5ml
1 probeta de 100ml
2 celdas para espectrofotmetro
tiras indicadoras de pH
1 gradilla
1 esptula
1 jeringa con manguera

PROCEDIMIENTO
I.-OBTENCIN DE EXTRACTO ENZIMTICO.

1.-Pesar 300g de tejido vegetal, homogeneizar en una licuadora con 300ml de buffer 1 (fosfato
dibsico de sodio 50mM pH 6.5). Realizar ste paso en el menor tiempo posible y en fro.

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 Manual de Laboratorio 18
Cintica Qumica Biolgica

2.-Mantener en hielo 10 tubos Falcon de 15ml, agregar el homogeneizado a los tubos y

pesarlos por pares para meterlos a centrifugar. Mantenerlos en hielo una vez que se ha
equilibrado el peso.

3.-Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 4000rpm. Colectar el lquido sobrenadante

en un nuevo tubo y mantenerlo en refrigeracin hasta su uso, en hielo si lo va a usar
inmediatamente.

II.-DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA USANDO INHIBIDORES.

1.-Preparar 15ml de catecol 50mM, usando como diluyente el buffer fosfato 50mM pH 6.5, y
mantener la mezcla a temperatura ambiente.

2.-Tomar 5ml de la mezcla anterior y depositarlos en un tubo matraz. Agregar cido

ascrbico a una concentracin de 30mM en la mezcla. Mantener a temperatura ambiente.

3.-En un matraz Erlenmeyer de 50ml, poner 1.5ml de buffer adicionado con catecol y cido
ascrbico. Adicionar 12.5ml del extracto enzimtico e inmediatamente hacer lecturas de
absorbancia a 400nm, cada 10 segundos, durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Usar
como blanco la solucin preparada en el paso 1.

4.-Para determinar las unidades enzimticas (actividad enzimtica), considerar que una unidad
de actividad PFO (polifenoloxidasa) corresponde a un aumento de 0.001 unidades de
absorbancia por minuto y por ml de enzima.

5.-Hacer una tabla donde incluya los datos registrados de absorbancia y tiempo. Graficar sus
resultados (Absorbancia vs tiempo, actividad vs tiempo y actividad vs absorbancia).

6.-Repetir los pasos 2 a 5, pero ahora agregar cido benzoico a una concentracin 30mM en
lugar del cido ascrbico.

7.-Repetir los pasos 2 a 5, pero ahora agregar NaCl 30mM en lugar del cido ascrbico.

RESULTADOS

A partir de sus datos y grficas, determinar si alguna de las 3 sustancias usadas como
inhibidores realmente tuvieron esa funcin.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

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 Manual de Laboratorio 19
Cintica Qumica Biolgica

PRCTICA No. 7

CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

FUNDAMENTO

El crecimiento microbiano involucra un incremento en el nmero de clulas ms que el

aumento de tamao de las clulas individuales. El crecimiento es una funcin esencial de la
clula microbiana, ya que cada clula tiene un tiempo finito de vida.
La clula bacteriana es como una mquina sinttica capaz de reproducirse a s misma. Una
de las caractersticas del crecimiento exponencial es que la velocidad de incremento en el
nmero de clulas es inicialmente lenta, pero se incrementa con rapidez una vez superada la
fase lag.
Midiendo la absorbancia de una muestra de cultivo microbiano, es posible determinar la
concentracin de clulas a travs de una curva de calibracin, en la que se relacione la
cantidad de clulas y la absorbancia.

PROPSITO

El alumno(a) realizar la cintica de un cultivo bacteriano y relacionar la absorbancia con la

cantidad de clulas presentes en determinado momento para construir una curva de
crecimiento tpica.

MATERIALES REACTIVOS

2 matraces Erlenmeyer de 500ml Peptona de casena

1 asa bacteriolgica Extracto de levadura
1 matraz Erlenmeyer de 50ml NaCl
1 vaso de precipitados de 250ml agar bacteriolgico
1 vaso de precipitados de 125ml
1 probeta de vidrio de 250ml
1 balanza granataria
1 esptula
16 cajas Petri de vidrio
16 tubos de ensayo de 18x150mm con tapn de rosca
16 pipetas de vidrio de 1ml
1 pipeta de vidrio de 10ml
1 gradilla
1 jeringa con manguera
2 celdas para espectrofotmetro
1 pizeta con agua destilada
1 mechero Fisher
Incubadora con agitacin
Autoclave

PROCEDIMIENTO

I.-Preinoculacin

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Cintica Qumica Biolgica

1.-Preparar 25ml de caldo LB en un matraz Erlenmeyer de 50ml, aparte preparar otros 250ml
del mismo medio en un matraz Erlenmeyer de 500ml. Esterilizar en autoclave durante 15min a
15lb/in2. Mantener a 45C el agar hasta su uso.

2.-A partir de un cultivo fresco de E. coli, hacer un preinculo de la misma pasando una azada
de cultivo en el matraz que contiene los 25ml de caldo. Incubar toda la noche a 35-37C con
agitacin constante.

3.-Agregar el preinculo (los 25ml) al matraz que contiene los 250ml de medio, en condiciones
aspticas. Mantener el cultivo en agitacin a 35-37C durante 3h.

4.-Preparar 320ml de agar LB y esterilizar en autoclave junto con las cajas Petri y las pipetas de
1ml. Mantener el agar a 45C hasta su uso.

5.-Despus de transcurridas las 3 horas, hacer una lectura de absorbancia en el

espectrofotmetro, a 600nm, usando como blanco el medio LB sin inocular. Al mismo tiempo,
tomar 1ml de cultivo en condiciones aspticas y depositarlo en un tubo conteniendo 9ml de
medio lquido. A partir de sta dilucin, tomar 1ml y pasar al segundo tubo, as sucesivamente
hasta completar 4 diluciones.

5.-Sembrar en caja Petri por vertido, adicionando 1ml de cultivo y aproximadamente 20ml de
agar LB. Homogeneizar con movimientos rotatorios y dejar gelificar.

6.-Repetir la toma de muestra y lectura de absorbancia y siembra en agar otras 3 veces ms,
con un espacio entre muestra y muestra de 30 minutos.

7.-Incubar a 35-37C durante 18-24horas y contar el nmero de UFC/ml presentes en cada

dilucin.

8.-Trazar una grfica en la que muestre la relacin absorbancia vs tiempo y otra en la que
muestre concentracin de clulas (expresadas como UFC/ml) vs tiempo. Finalmente otra
grfica en la que relacione UFC/ml vs absorbancia.

RESULTADOS

En base a sus resultados, cul sera el tiempo de generacin para la bacteria utilizada?

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

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