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". -iNFORME FINAL
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CULTIVO DE LA MICROALGA HaematococcuS pluvialis
A NIVEL DE PLANTA PILOTO, PARA OBTENER
:. HARINA DE MICROALGA PIGMENTADA (ASTAXANTINA)
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Coordinador de Proyecto: Sr. M. Roberto Hernndez Codoceo
Jefe-Tcnico Investigador: Sra. Cecilia A. Carvajal Urizar

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Investigador de Proyecto: Sr. L. Alejandro Briceo Tapia.

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MINER CHAAR BLANCO S.A.
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PRESENTACIN
En el ltimo decenio, se constata que el pas ha sabido enfrentar con

xito el desafo impuesto por la poltica de apertura en los mercados
internacionales, alcanzando un crecimiento y desarrollo econmico
sustentable, con un sector empresarial dinmico. innovador \' capaz de
adaptarse rpidamente a las seales del mercado.
Sin embargo, nuestra estrategia de desarrollo, fundada en el mayor

esfuerzo exportador y en un esquema que principalmente hace uso de las
ventajas comparativas que dan los reCursos naturales y la abundancia relativa
de la mano de obra, tender a agotarse rpidamente como consecuencia del
propio progreso nacional. Por consiguiente, resulta determinante afrontar una
segunda fase exportadora que debe estar caracterizada por la incorporacin de
un mayor valor agregado de inteligencia, conocimientos y tecnologas a
nuestros productos, a fin de hacerlos ms competitivos.
Para abordar el proceso de modernizacin y reconverSlOn de la

estructura productiva del pas, reviste vital importancia el papel que cumplen
las innovaciones tecnolgicas, toda VeZ que ellas confieren sustentacin real a
la competitividad de nuestra oferta exportable. Para ello. el Gobierno ofrece
instrumentos financieros que promueven e incentivan la innovacin y el"
desarrollo tecnolgico de las empresas productoras de bienes y servicios.
El Fondo Nacional de Desarrollo Tecnolgic y Productivo FONTEC,

organismo creado por CORFO, cuenta con los recursos necesarios para
financiar Proyectos de Innovacin Tecnolgica, formulados por las empresas
. del sector privado nacional para la introduccin o adaptacin y desarrollo de
productos, procesos o de equipos.
Las Lneas de financiamiento de este Fondo incluyen, adems, el apoyo

a la ejecucin de proyectos de Inversin en Infraestructura Tecnolgica y de
Centros de Transferencia Tecnolgica a objeto que las empresas dispongan de
sus propias instalaciones de control de calidad y de investigacin y desarrollo
de nuevos productos o procesos.
De este modo se tiende a la incorporacin del concepto "Empresa -

Pas", en la comunidad nacional, donde no es slo una empresa aislada la que
compite con productos de calidad, sino que es la "Marca - Pas" la que se hace
presente en los mercados internacionales.
El Proyecto que se presenta, constituye un valioso aporte al

cumplimiento de los objetivos y metas anteriormente comentados.
FONTEC - CORFO
--.r
MINERA CHAAR BLANCO S.A.
mchanarb@entelchile.net
118-1581
PROYECTO DE INNOVACiN TECNOLGICA

CULTIVO DE LA MICROALGA Haemafoccocus pluvialis (VOLVOCAL) A NIVEL DE PLANTA
PILOTO EN REACTORES CERRADOS, PARA OBTENER HARINA DE MICROALGA
PIGMENTADA (ASTAXANTINA)
A.- RESUMEN EJECUTIVO.

l.-INTRODUCCIN.
El proyecto biotecnolgico desarrollado, consisti en la obtencin de biomasa a partir de una
. microalga conocida con el nombre de Haematoccocus pluvialis, productora de un pigmento natural
llamado astaxantina. Este pigmento se acumula en la clula debido a condiciones de estrs causado
generalmente por la carencia de algn nutriente o condiciones ambientales.

Este pigmento es utilizado como colorante para la musculatura del salmn criado en cautiverio. El
color en la carne es tpico en salmones silvestres, que es adquirido cuando ingieren crustceos y
flora acompaante que tienen naturalmente el pigmento. Sin embargo en el alimento artificial no es
agregado sino hasta aproximadamente 12-18 meses antes de la cosecha, para salmones y 8 a 14
semanas, para truchas y ambas concentraciones fluctan entre 40-80 ppm para ambos peces. Este
colorante sustituye el adquirido en ambiente natural y revaloriza el producto.
La potencialidad comercial del producto est dada por ser una microalga capaz de producir
astaxantina 100% natural. La astaxantina utilizada en estos momentos en Chile es sinttica cuyo
nombre comercial es Carophyll Pink 8% y es utilizada actualmente como aditivo en la preparacin

de alimento para salmones y truchas con el fin de aumentar e intensificar el color rojo anaranjado de
su carne y aumentar asi su valor comercial.

Este proyecto permitir desarrollar una tecnologia que haga posible la produccin de esta microalga
y la estabilizacin del producto para entrar al mercado, lo que implicar por una parte la sustitucin

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de la importacin y suplir de pigmento 100 % natural, considerando las restricciones para insumos
artificiales en estudio por el Ministerio de Salud en Chile e impuestas para el mercado exterior para el
2004.
La importancia de la produccin natural de pigmento es llenar un nicho econmico, que quedar
vacio al momento que el decreto sea publicado. No obstante, consideramos la idea de que grandes
esfuerzos se hacen para sobrellevar este cambio, con relacin a obtener pigmentos de fuentes
naturales. Pero an asi el mercado es muy amplio y los volmenes de produccin recin comienzan
a ser considerables.

Chile es el segundo exportador mundial de salmones, lo que implica un consumo altsimo de este
pigmento artificial. Sin embargo el laboratorio europeo determina slo una cuota por pais productor,
siendo sta insuficiente para el mercado nacional y adems de un alto costo de adquisicin.
Hasta fines de 1996 la produccin de dicho pigmento era 100% sinttico pero, el mercado
intemacional, cada vez esta siendo ms estricto con la utilizacin de aditivos sintticos en la
produccin y preparacin de alimentos para consumo humano. Esta tendencia y las exigencias del
mercado han motivado la bsqueda de pigmentos naturales.
Frente a esto, en Estados Unidos se ha iniciado hace algunos aos una empresa de cultivo de
microalgas que comercializa un producto natural con pigmento, el cual est entrando al mercado
como una altemativa al pigmento artificial.
11.- ANTECEDENTES DE LA EMPRESA.

11. a.- Historia de la Empresa
El desarrollo de este proyecto surge como respuesta al inters demostrado por los ejecutivos de la
Empresa en incursionar en el campo de la Biotecnologia y producir en Chile el pigmento astaxantina

MINERA CHAAR BLANCO SA
98-1561

en forma natural, en consideracin a las excelentes condiciones que ofrece el Valle de Elqui, IV

Regin y la posibilidad de ser pioneros en un rea an no desarrollada en Chile.
La empresa Minera Chaar Blanco S.A., es una agrupacin pequea de empresas que operan
principalmente en la Cuarta regin, abarcando los rubros minero, agricola, biotecnolgico e

inmobiliario.

11. a.1.-Agrcola y Biotecnologa.
Su politica es de diversificar sus inversiones privilegiando el desarrollo de proyectos pioneros e
innovadores. Frente a esto se puede mencionar que participa en un proyecto FONTEC de Innovacin
Tecnolgica con excelentes resultados, el que permite obtener la enzima papana de la papaya
(Carica candamarcencis) producido en sus propios campos. Esta empresa tiene el nombre de
Technologic Farm S.A., que desarrolla Biotecnologia de punta.
La Tecnoenzima (M) producida es un ablandador de carnes, con muy buena acogida en el mercado
nacional y esta comenzando a conocerse en pases del Cono Sur. Este producto es pionero en
Sudamrica y en Chile.
La empresa se encuentra en la etapa de dar a conocer el producto y creando la necesidad, por
medio de fichas tcnicas y muestras, adems se da el apoyo necesario para su incorporacin en las
diferentes lineas de produccin (cerveza, alimentos, todo tipo de carne, productos y subproductos).
En la parte agrcola, a travs de la Agrcola H.C. Ltda., es uno de los pioneros en el cultivo de
Productos Agrcola Orgnicos. Desarrollando cultivos de limn, papayas y chirimoyas, libres de

pesticidas y herbicidas agregando valor a las exportaciones.
En la temporada pasada de chirimoyas se export a travs de Vital Bemes Marketing, el 20% del
total de exportaciones a U.S.A., logrando consolidar un nuevo mercado. Se exporta adems a

Mxico e Inglaterra, obteniendo divisas importantes y una gran aceptacin.
--
98-1561
En el caso de los limones esta temporada, al igual que las tres anteriores, se export a Japn y
U.SA en los meses de inviemo.
El campo ubicado en el Fundo Corazn de Maria, tiene superficies y cultivos certificados
orgnicamente. Es decir, cumple con las normas de produccin orgnica que rigen en la Unin
Europea, USA e IFOAM, y que PROA asume y exige en Chile (Certificado W 328; de Corporacin
de Promocin Orgnica Agropecuaria).

VOLMENES DE EXPORTACiN (1999)
Chirimoyas: 35.000 cajas a U.SA, Mxico, Brasil e Inglaterra a travs de Vital Berries Marketing.
Limones : 180.000 kilos a Japn y U.S.A
11. a. 2.- Construccin e Inmobiliaria.

La Minera a travs de sus socios, es duea y administradora de un edificio en el centro de la Serena,
Edificio Maria Elena ubicado frente a la Plaza de Armas de La Serena y que cuenta con 9.500 mt2
construidos. Adems es duea y constructora del Loteo habitacional 'Las Perdices", a los pies del
Cerro Grande.

11. a. 3.- Minera.
Esta empresa en el rea minera, se desempea desarrollando mega proyectos sobre los cuales
evala Factibilidad, Cubica la mineralizacin y posteriormente vende el proyecto, manteniendo
regalas presealadas y un porcentaje de acciones.
11. a. 4.- Mercado Nacional de la Minera Chaar Blanco S.A., a travs de la Agrcola H.C. Limitada.

4
98-1561

La produccin a travs de la Agricola H.C. Ltda., la que produce hortalizas y frutales (chirimoyas,
uvas, limones, papayas), es canalizada a supermercados de la zona como DECA y Santa Isabel y en
Santiago a Supermercados ALMAC, Santa Isabel, EKONO, Multimarket y otros.
La venta internacional se realiza a travs de exportadoras como se seal anteriormente.
Producciones Ao 1999-2000.

LIMONES : 2.000.000 Kg.
PAPAYAS : 2.500.000 kg.

CHIRIMOYA: 800.000 Kg.

Mano de Obra.
Trabajan alrededor de 100 personas a ao corrido y en las temporadas altas se alcanza un nmero
mayor, que no sobrepasa 250 personas.

111. IMPACTO TCNICO-ECONMICO.
En la actualidad, el 100% del pigmento utilizado en Chile es sinttico, siendo el principal proveedor la
empresa Hoffmann LaRoche con su producto Carophyll Pnk 8%, que contiene 80 gramos de
astaxantina por kilo de producto. Existe otra empresa en Estados Unidos llamada Cyanotech
Corporaton, que produce biomasa de microalga pigmentada en un 1,5 a 2%., llamada NatuRose
La perspectiva de la empresa se bas en desarrollar una estrategia tecnolgica y con la finalidad de
ser mucho ms competitiva, sustituir la importacin de la materia y aumentar su produccin para
conquistar tanto el mercado nacional como extranjero, donde existe una demanda no satisfecha. Y

finalmente insertar un producto sustituto donde existe monopolio, captando el mercado del pigmento
orgnico para la nutricin de salmones.
MINERA CHA~AR BLANCO S.A.
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El proyecto consisti en la produccin a escala de planta piloto bajo una superficie de agua de 750

mtr2, de biomasa de la microalga Haematoccocus pluvialis, para obtener harina de microalgas con
pigmento de manera que pueda ser envasado y etiquetado para luego ser comercializado como

ingrediente para la fonmulacin de dietas para salmones.
B.- EXPOSICiN DEL PROBLEMA.
Se estima que entre un 30% y 40% del costo del alimento para estos peces est constituido por este
pigmento. Chile en los meses de enero-marzo de 1998 export aproximadamente 78.880 toneladas
de truchas y salmones en todas sus categorias. Esto es un aumento respecto al ao 1997 en un
86% para salmones y en un 57 % para truchas (Aquanoticias, a010. Junio-Julio 1998).
Las predicciones mundiales para la produccin de salmones, son muy alentadoras esperando el
aumento en la produccin y una disminucin en los costos, en la medida que se hagan efectivas la
conversin de alimento y la eficiencia del procesamiento. Estas predicciones son realizadas por el
economista Gunnar Knapp (Universidad de Alaska y Servicio de Infonmacin del Mercado del Salmn
del Instituto de Comercializacin de Productos del Mar de Alaska), quien adems seala que la
produccin mundial de salmones en el ao 1997, fueron de 706 mil toneladas (Aquanoticias, 1998).
Los volmenes de produccin de salmn consideran una cantidad de pigmento utilizado en la
elaboracin de alimento es de alrededor del 0,5% y 0.07% para pigmento natural y para pigmento
artificial. Esto implica un costo de US$ 289,46 millones y US$ 243,56 millones, para ambos
pigmentos respectivamente, considerando un costo de US$ 41 y US$ 230 el kilo de producto para
cada cual.
La alimentacin de salmones est basada en una dieta rica en protena animal, carbohidratos y
lpidos, tambin oligoelementos, vitaminas y pigmento. Este ltimo es entregado slo a aquellos
peces que van a ser cosechados. La dosis de alimento es de 2 kilogramos por kilo de pez,
considerando un 10% por prdida en la entrega de alimento.
w

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El pigmento astaxantina, tiene diversas fuentes, siendo al presente su origen sinttico el que se
encuentra en mayor proporcin en el mercado, sin embargo debido a la exigencia del mercado con
los cambios en los hbitos de consumo, donde la tendencia es consumir alimentos naturales, varias
empresas intemacionales buscan diferentes fuentes naturales del pigmento como la levadura Phaffia
rhodozyma, la flor Adonis aestiva/is y la microalga Haematococcus pluvia/is.
Resultados muy interesantes se han obtenido de la biomasa cosechada por Minera Chaar Blanco
SA y analizada por el INTA. Se encontr una concentracin del 1,69 % de astaxantina en la
biomasa analizada y de los carotenoides encontrados ms de un 80% corresponde a astaxantina.
Estos valores son muy buenos considerando los obtenidos en literatura (Choubert & Heinrich, 1993;
Sommer et al, 1992).

1.- PROYECTO TECNOL6GICO E INNOVACI6N.
La innovacin se basa fundamentalmente en que se desarroll una tecnologia de cultivo y de

proceso para este producto, que es nuevo en Chile, pasando a ser los nicos en latinoamrica.

En Estados Unidos se cultiva esta microalga produciendo volmenes industriales, los que no
satisfacen las necesidades del mercado mundial. Esta empresa norteamericana mantiene sus
cultivos (4 hectreas) en race-ways (piscinas largas de 100 por 4 metros de ancho y de poca
profundidad) expuestos. Es decir las condiciones climticas cualquiera que sea, influye directamente
sobre el cultivo.
La innovacin en el proceso de cultivo, es utilizar reactores cerrados que evitan la evaporacin del

agua, mantienen las condiciones intemas ms estables, en caso de lluvia las condiciones del medio
de cultivo no cambian, no caen objetos o sustancias extraas y lo mas importante, es que se pueden
controlar las variables mejorando la calidad y, se estandariza el proceso y el producto.

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El producto elegido no tiene competencia en Chile, pues an no se ha logrado desarrollar una
tecnologia de cultivo. La productividad se evalu respecto a la cantidad de biomasa cosechada por
reactor y la calidad y cantidad de pigmento que contiene. Todo esto manteniendo el patrn del
pigmento de Cyanotech Corporation, en Estados Unidos.

La nueva tecnologia que la empresa ha desarrollado permitir producir un producto sustituto que en
la actualidad se importa en un 100%, obtenindolo de una fuente natural como es la microalga
Haematoccocus pluvialis.
Existe tambin una justificacin cientifica a la utilizacin de polvo de microalgas pigmentadas como
fuente de pigmento, en la dieta de salmones, crustceos, truchas y peces omamentales. Estos
resultados entregan grandes aportes acerca de la incorporacin del componente dietario comparando
astaxantina sinttica y natural. Se refieren adems a la pureza y calidad del producto utilizado sin
aditivos, slo diluyendo las partes.

En Chile el mercado para el pigmento es del orden de 400 mil toneladas de alimento dentro del cual
1.200 toneladas corresponderian a biomasa seca de microalga pigmentada, y la tendencia del
mercado mundial para la astaxantina ha tenido en los ltimos aos una demanda creciente, puesto
que anualmente aumenta la produccin mundial de salmones y truchas, principales usuarios del
pigmento.
La implementacin de una planta industrial productora de harina de microalga pigmentada podria
tener otros efectos positivos asociados a la sustitucin de importaciones que se generara como es la
necesidad de contratacin de organismos investigadores y de mano de obra para su puesta en

marcha y funcionamiento.

Chile ha definido como la segunda fase de su politica de promocin de exportaciones, la
incorporacin de valor agregado a sus productos primarios. Este proyecto se enmarca precisamente
dentro de este concepto ya que se basa en la elaboracin de un producto de alto valor agregado a

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partir de microalgas, cuyo mercado podria extenderse al de exportacin. Por otro parte se generaria
una nueva altemativa para la produccin local de biomasa y astaxantina, crendose nuevas plazas
de trabajo y un incremento de las exportaciones de la regin.

Objetivos Tcnicos
El objetivo tcnico principal del proyecto es la validacin de una tecnolog ia desarrollada a nivel de
laboratorio a planta piloto. Esto involucra no slo al proceso de obtencin, sino a todas las dems
variables relacionadas con el proyecto, lo cual se traduce en los siguientes objetivos:

'Determinar las variables de proceso a escala de planta piloto, tales como temperatura, luminosidad
y otros asociados a la biologia de la especie cultivada.
'Determinar la calidad de la materia prima disponible y estandarizar la produccin final.
'Tipificar y di mencionar en forma ptima los biorreactores (sistema de cultivo).

'Determinacin de distintos tipos de proceso para cosecha la obtencin de biomasa.
'Determinacin de una tcnica de rompimiento celular para dejar biodisponible el pigmento.

'Determinar una tcnica de secado y mantencin del producto.
'Caracterizar el producto final, en base la cantidad de microelementos.

C.- METODOLOGA YPLAN DE TRABAJO.
C.1.- Desarrollo de Minera Chaar Blanco S.A.

Introduccin:
La microalga Haematococcus pluvialis como materia prima para obtencin de astaxantina.
Dentro de los procesos productivos ms importantes para la obtencin de microelementos, el cultivo

de microalgas es el ms complejo. Esto es debido a que son organismos unicelulares, generalmente

--
98-1561
mtiles, que requieren factores fisicos y quimicos como luminosidad, temperatura, oxigeno y
nutrientes permanentemente.
La microalga Haematococcus pluvialis es un alga verde (Cloroficea) biflagelada, que pertenece a las

Volvocales. Presenta etapas de desarrollo que van desde clula vegetativa verde, hasta una
aplanospora con pared celular gnuesa resistente a condiciones extemas severas, la cual contiene
astaxantina hasta en un 80% del total de los carotenoides.
Fase de desarrollo Total carotenoides Dimetro celular
Clula vegetativa (verde)

(pg*cel-1)
5.00.6
(u m)
23.3
Aplanospora 94.12.9 42.9
La reproduccin asexual ocurre con la divisin de clulas en dos o cuatro clulas iguales
(macrozoosporas). Mas frecuentemente desarrollan un akineto, el cual tiene un dimetro tres o

cuatro veces ms grande que la clula vegetativa. El protoplasto de los akinetos est completamente
oscurecido con su pigmento rojo. Este akineto es resultado de una condicin de estrs provocado
por falta de nutrientes, bajas temperaturas, exceso de clonuros, etc.
Cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis.
El cultivo de microalgas se realiz en tres procesos bsicos que fueron la obtencin y axenizacin de
las cepas, el crecimiento de la microalga en diferentes medios de cultivo para determinar cual era
ms eficiente hasta alcanzar una concentracin de biomasa esperada y finalmente est el proceso
de cosecha.

Posterior a esto est el rompimiento celular, el secado y caracterizado del producto final.
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MINERA CHAAR BLANCO SAo
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C.1.1.- Anlisis de los diferentes medios de cultivo de H. pluvialis en laboratorio.

C.1.1.a.-Criterio de seleccin.
Los medios utilizados se seleccionaron segn lo que sugera la literatura y se clasificaron por la
concentracin de nitrato y nitrito, fosfatos y sulfatos.
Los medios utilizados son M1 Y M2. Fueron modificados para adecuar los costos en insumas, los

volmenes a utilizar y el acceso a ellos.
Se utilizaron medios conocidos como el f!2 de Guillard utilizado generalmente en algas marinas y
medios de cultivo standard para volvocales, como por ejemplo para Chlorefla sp.
C.1.2- Limpieza de la microalga clasificada como cepa H2.

Se realiz la limpieza de la microalga utilizando para ello la tcnica de diseminacin en superficie y
estriado. De esta manera se logr aislar la microalga de algunas bacterias asociadas al cultivo (Fig.1)

Fig.1 : Placa de agar con medio de Cultivo para H. pluvialis.

11

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Tcnica de Estriamiento en placa de agar.
Para realizarlo se utiliz los medios de cultivo seleccionados y se le agreg Agar-Agar (Difco labs.)

en las cantidades sugeridas por los fabricantes.

C.1.3 .. - Crecimiento de la microalga Haematococcus pluvialis en condiciones de laboratorio.
Para esta etapa se utiliz botellines y matraces de 250 mi, con un volmen de 100 mi con
medio de cultivo. Tambin se utiliz para la etapa intermedia matraces de 1 litro, dentro del cual se
puso 900 mi de medio con un inculo (de concentracin conocida) de microalga. Se utilizaron slo
dos medios de cultivo, aquellos que presentaron un crecimiento celular mayor y un tiempo de estrs
menor, para obtener resultados en pigmentacin.
Procedimiento de Cultivo:
Etapa de CEPA:
Este es el comienzo del cultivo. Para esto se utiliz una estanteria, con divisiones por piso

en su interior (Fig.2).

Fig. 2: Estanterias para la mantencin y cultivos de cepas e Inter 1.

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mchanarb@en!elchile.net
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Las botellas para el mantenimiento de las cepas eran de vidrio de 250 mI. de capacidad. De
aqu eran llevados al autoclave por 15 minutos a una temperatura de 121 oC. El autoclave era una olla
a presn con espta (Fg.3).
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Fg. 3: Esterilizacin de medio para cepas en el autoclave.

Una vez que estaban listos y etiquetados se mantenian en un estante hasta su utilizacin.
Las rplicas de microalgas se realizaron cada 6 das. La temperatura para las cepas dentro del
cepario era de aproximadamente 23OC, y era proporcionada por los balats de los tubos fluorescentes
ubicados bajo cada cual, y las condiciones del lugar, durante el verano y en inviemo por un
termocalefactor elctrico
Etapa INTER 1:
El cultivo intermedio 1, se implement en la sala de microalgas en la misma que se mantuvieron las
cepas. Este consisti en la inoculacin de matraces de mayor volmen (900 mi) y se incluy la
aeracin (Fig.4).

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MINERA CHAAAR BLANCO S.A.
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Fig. 4: Repisa para cultivo INTER l.
La esterilizacin del ambiente de la sala donde se efectu el inoculo, se logr manteniendo el
mechero prendido durante 10 minutos. Los inculos se realizaron en tomo al mechero y se flamearon
las botellas (cepa e intermedio) para luego poner los capilares y los tapones (Fig.5 y 6).

Fig. 5 Y6: Proceso de siembra en ambiente estril.

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MINERA CHAAAR BLANCO SA.
mchanarb@en!elchile.net
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Las botellas de INTER 1, una vez que se les etiquet, se pusieron en el estante para esperar
su crecimiento. La temperatura de mantencin del cultivo era de 23C.
Una vez que la microalga alcanz una coloracin oscura (concentracin determinada por
conteo en cmara de Neubahuer), dependiendo del medio de cultivo y que ocurre generalmente al
10 da.

Etapa EST:
Para llevar a cabo esta etapa, se acondicion una sala de cultivo masivo fuera de las salas
del laboratorio. La temperatura ambiental que alcanzaba este "green house', en das soleados era de
32- 40C.
El tiempo de cultivo que se determin para la etapa CEPA es de 3 semanas
aproximadamente y para matraces (INTER 1) fueron dos (2) semanas y seis (6) semanas, para el

medio M1 y M2.
Los resultados enviados por el INTA, sealan una diferencia significativa dependiente del
tiempo de espera entre siembra y cosecha. Las concentraciones de carotenoides totales varan
respecto al tiempo de permanencia y el medio de cultivo (Tabla 1).

Muestra
M1
Carotenoide Total
0,98%
Porcentaje de Astaxantina
0,79%
M2 0,75% 0,61%

Tabla 1: Anlisis de Contenido de Carotenoides Total.

15

mchanarb@enlelchile.nel
93-1561
RESULTADOS:

En la etapa de matraces la acumulacin de pigmento ocurre alrededor de los 16 a 25 dias
despus de la siembra. La coloracin caf, el engrosamiento de la pared celular y la prdida del
flagelo son seales inequivocas del comienzo de la formacin de akinetos.
a. - Temperatura: Dentro del laboratorio las condiciones de luminosidad y aeracin

permanente, favorecen el control de las variables. La temperatura diaria promedio durante Febrero y
Abril era de 28C. Esta temperatura es alta considerando las condiciones en que mejor se desarrolla

la microalga.
b. - Iluminacin: La iluminacin del laboratorio era permanente y la luminosidad tuvo una
variacin da-noche de 200 lux.

c. - Evaporacin de Agua: La evaporacin de agua dentro del laboratorio, era de un 3% diario
en INTER l.
d. - Concentacin de nitritos y nitratos: La concentracin inicial de nitritos y nitratos disminuy
en un 99 % para ambos medios, cuando las clulas vegetativas pasaron a ser akinetos.
e.- Concentracin Celular: En la etapa de CEPA, la concentracin celular aument en un 800
y 685,7% para M1 y M2, respectivamente (Fig. 7).

Crecimiento Celular a 23"C. CEPA.
Comparacin entre dos Medios de Cultivo

300
A
250
l~
~
~
200
150 / /
:." 100
~~
JI
50
/.
___ MI
O
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
~M2
FIG. 7: Crecimento Celular CEPA.

Dla de Cultivo

16

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En la figura 8 se observan claramente las curvas de crecimiento para las etapas de INTER l.
Crecimiento Coiular a 23'C.INTER l.
Comparacin entre dos medios de Cultivo.
600
500
/" ../

400
I 300 //
//

:!! 200
100 //
O
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Da de Cultivo

___ Ml
____ M2
FIG. 8 Crecimiento Celular INTER l. Para dos medios de cultivo.

La Tasa Generacional (G) y el nmero de duplicaciones por dia (r) para M1 y M2, se
comparan con CEPA y cultivo INTER I en la Tabla 2.

Variables
n
Nmero de duplicaciones
G
Horas
Medio de Cult. M1 M2 M1 M2

Vol. De Cultivo
CEPA 2,676 2,531 98,651 85,351

INTER I 2,087 2,431 103,491 88,851

Tabla 2: Determinacin de variables asociadas al Crecimiento Celular. r y G.

17

98-1561

Estos indican una clara diferencia entre los medios de cultivo, siendo la tasa generacional

menor para M2 y el nmero de duplicaciones menor, para este mismo medio.
El medio M1, se diferencia en un tiempo de crecimiento celular mas lento que M2.
4.3." Crecimiento de la Microalga en Estanque Rectangular (ES7).

El estanque rectangular almacena un volmen total de 3000 litros y tiene agitacin mecnica
pennanente, mediante un sistema de paletas. Est ubicado en un "green house" al costado del
laboratorio. Los parmetros como temperatura y evaporacin se pueden medir y controlar debido a
que es un ambiente cerrado.
a." Temperatura: La temperatura diaria fu de una mxima de 38 oc y una minima de 22C,
durante el periodo Febrero-Marzo de 1999

b." Iluminacin: La luminosidad dentro del "green house" depende de las condiciones dia-
noche, es decir se mantienen con fotoperiodo, con el ciclo nonnal de la etapa de muestreo.
c. - Evaporacin de Agua: La evaporacin de agua dentro del "green house", no super el
10%, del total del volmen al final del proceso. Esto es a las 5 semanas de cultivo. No se repuso el
volumen ni el medio de cultivo durante el tiempo de cultivo
d.- Coneentacin de nitritos y nitratos: La concentracin de estos componentes, disminuy
en un 99% al final del proceso, cuando las clulas vegetativas pasaron a ser akinetos.e.-
Concentracin Celular.' En la etapa de EST, la concentracin celular aument en un 547% para M1 .

,
4.4. " Construccin del reactor y anlisis de factores que influyen en la puesta en
marcha del sistema.

La produccin de la microalga Haematococcus puvialis para la extraccin de pigmento se desarrolla
en reactores aerbicos de alta eficiencia fotosinttica. El reactor busca generar las condiciones
ambientales y de medio de cultivo ptimas para la reproduccin de estos organismos, lo que se

18
...

98-1561
conoce como "blooming", es decir, una reproduccin masiva acelerada. En estas unidades con las
condiciones ambientales generadas, se llega a tasas de reproduccin que podrian duplicar la
biomasa en un da.

Fig 11: Estanque de 3.000 Its. EST.
PRODUCCiN DE BIOMASA
Obtencin del Agua:
Uno de los factores de primera importancia para la instalacin de la experiencia es la que hace
referencia a la obtencin del recurso agua. Por ejemplo, es fundamental para obtener un producto
final de alta calidad que el agua tenga muy bajo contenido de metales pesados, siendo deseable la

ausencia de algunos de ellos como el Cadmio, Plomo, Mercurio y Cobre. Si existe presencia de
stos deben estar bajo la norma, la que para productos de consumo de Salmones es muy estricta.
Los parmetros obtenidos de las aguas de pozo profundo del Fundo Corazn de Maria cumplen con
todas las exigencias requeridas para esta actividad (Tabla 3).
Preparacin del Medio de Cultivo:

19
-
MINERA CHA~AR BLANCO SA
98-1561

El agua obtenida es enviada por bombas a travs de tubos de PVC hasta los dos estanques
cilindricos de fibra de vidrio 2m 3 ( Fig. 12)

Fig. 12: Estanques para preparacin de medios.
Estos contenedores estn diseados especialmente para mezclar y disolver todo los reactivos

necesarios para la preparacin de los medios de cultivos.
En esta etapa se requiere de toda la experiencia tcnica de los especialistas en cuanto a la adicin y
preparacin de los reactivos, ya que de esta operacin depende el xito de los medios de cultivo y
del posterior xito en la cosecha. Adems como toda mezcla quimica, la preparacin no es aleatoria,
sino que debe seguir una secuencia predeterminada. Luego de la preparacin y disolusin de las
sales este medio es enviado por gravedad al reactor.

20
-
rnchanarb@entelchile.net
98-1561

CUL TlVO MASIVO EN REACTORES INDUSTRIALES:
Los Reactores son sistemas de cultivo donde se realiza el proceso de fotosintesis en forma
acelerada, lo que permite que la reproduccin de las microalgas sea tan rpida que se duplica una
vez o ms la biomasa en un dia.
De acuerdo al diseo de los Reactores propuestos para este Proyecto, el tiempo de instalacion

desde el momento en que los materiales estuvieron dispuestos demor 47 dias en estar listo, sin
contar el llenado e inoculacin (siembra) del reactor. Este esta confeccionado de dos redes lineales
de madera (Fig. 13) ,

Fig 13: Estructuras de maderas. Redes lineales para reactor. REACT.

que tiene como finalidad el soporte estructural de los dos canales de laminas de polietileno (PEC.)
estos canales estan unidos en los extremos por dos cabezales de fibra de vidrio que cierran el
circuito (Fig. 14)

2\
-
98-1561

Fig. 14: Cabezales de Plstico reforzado en fbra de vidrio. REACT.
Este reactor tiene una capacidad de 40 m3 de cultivo con una superficie de exposicin a la luz de
130 m2 El medio es agitado por un eje con ruedas de paletas conectada a un motoreductor el cual
desarrolla la velocidad apropiada para una buena agitacion de mezcla (Fig. 15)

Fig. 15: Paletas de agitacin. REACT.
Este reactor se encuentra en el interior de un Green-House cubierto de polietileno UV, como se
observa en la Fig. 16.

22

..

mchanarb@entelchile.nel
98-1561

Fig. 16: Green-House
Esta estructura cubierta tiene 3 finalidades fundamentales:

Aumentar la ganancia de temperatura durante el da y conservarla durante la noche.
Reducir la prdida de agua por evaporacin.
Impedir el ingreso a los cultivos de insectos y otros organismos y partculas que pueden
contaminar.
Para conseguir la produccin de ms alto rendimiento, se realiza el seguimiento de mediciones de

los parmetros que inciden en la productividad como son: Temperatura, pH , Salinidad y Radiosidad
luminosa.
Para mantener el balance quimico y biolgico del medio de cultivo, se controlan los parmetros

limitantes, para lo cual se realizarn anlisis diarios de laboratorio y microscopia para detectar la falta
de nutrientes, componentes excedidos y/o contaminacin bolgica de tal forma poder obtener las
mejores muestras de cosechas
23


98-1561
RECUPERACION DE BIOMASA: COSECHA

Este es uno de los procesos criticas dentro del ciclo de produccin de cualquier microalga,
principalmente por el tamao tan reducido de ellas. Esto hace que el proceso de separacin
slido/lquido sea un proceso de filtracin complejo, ya que adems las clulas no soportan grandes
cambios de presin por la que pueden sufrir la ruptura de su pared celular destruyndose todas sus
cualidades. Sin embargo, para esta actividad se monto un sistema el que permite obtener estimadas
concentraciones de la pasta de cosecha. El medio proveniente del reactor es trasladador por una
bomba de accin rotatoria, la que produce caudal suficiente, adems de provocar poco estrs
mecnico a las clulas; el medio es enviado a una cama de filtrado la que esta confeccionada por

paos micrometricos de malla.(Fig. 17).

Fig. 17: Cama de filtrado o cosecha. Con malla monofilamento.

Luego de la recoleccin la biomasa (actividad que demora 5 hrs aproximadamente actividad
Que mejorara con sistemas centrifugas) es lavada con agua potable en forma profusa, para ser
envasada en bolsas de politileno con sellado a presin, y luego asi ser enviadas allNTA (Fig. 18).

24

98-1561

Fig. 18: Proceso final y envasado para el envo aIINTA, para anlisis.

RUPTURA CELULAR.
A cargo de Dr. Romilio Espejo. INTA, U. de Chile.
Introduccin

Haematoccocus pluvialis es una alga verde unicelular flagelada que en condiciones ambientales
definidas forma quistes y sintetiza una alta cantidad de un pigmento llamado Astaxantina, que les da
un color rojizo. A diferencia de Dunaliella, otra microalga salina productora de j3-caroteno, posee una
pared compuesta por una cubierta celulsica que contiene una gruesa capa de muclago
(polisacrido), por donde se extienden ramificaciones del citoplasma. La Astaxantina, principal
responsable de la pigmentacin, se encuentra ubicada intracelularmente en vesculas lipdicas en el
citoplasma y para que sea biodisponible es necesario romper la pared de los cistos. Por esta razn el
uso de esta alga para aumentar la pigmentacin requiere que se rompa el mayor porcentaje posible
de las clulas.

25
....
911-1561

El Objetivo Tcnico de esta etapa es detenninar la metodologia ms apropiada para la ruptura de la

pared celular.
PARTE 1. PRUEBA DE DIFERENTES MTODOS DE RUPTURA
De acuerdo a lo programado se probaron diferentes mtodos de ruptura. La eficiencia de
rompimiento se midi por las dos tcnicas siguientes:
a) Examen y recuento de clulas con pared nonnal al microscopio utilizando una cmara de
recuento.
b) Eficiencia de extraccin de carotenoides totales y medida por absorbancia a 470 nm.
Pruebas con el Bead-beater.

Inicialmente se detennin la eficiencia de ruptura por el Bead-beater. Este mtodo fue escogido
como patrn ya que se ha demostrado su efectividad con clulas muy diversas. Consiste en el
rompimiento mecnico, en un agitador reciproco llamado Bead-beater, de la suspensin del alga
junto con pequeas esferas de vidrio o acero. La Fig. 1 presenta los resultados obtenidos utilizando
esferas de vidrio de 0.5 mm.

Ruptura algas con perlas
~:j2
'"
'"
:;
';j
v
Z
.. ,...
]

O "-,""'" ~
O 50 100 150 200
Tiempo (seg) .'

Figura 1. Se detennin que el tiempo de agitacin necesario en Bead-beater para la ruptura total era
de 120 segundos, partiendo con un valor de 25000 clulas/mI. La rpida disminucin a los 20
26
-

98-1561
segundos de agitacin se observ en varias ocasiones y probablemente se debe a agregacin de las

clulas. Mayor agitacin disgregara los agregados ocasionando el aumento observado a los 40
segundos. Para esta experiencia se utiliz la muestra 1.

Posteriormente se compar la eficiencia de la agitacin utilizando el Bead-beater con perlas de vidrio
(Mtodo 1) vs. agitacin con bolitas de acero de 1/4 de pulgada de dimetro (Mtodo 2), midiendo

rompimiento de clulas (Fig.2) y extraccin por hexano. (fig. 3).

Figura 2. Rompimiento de Haematoccocus en Bead-beater a distintos tiempos de agitacin. Muestra
1.

27
---
98-1561

Extro,:"in pigmento mtodos 1 y 2

1---"'''"''''1
,o - editas acErO
TIempo agitacin (seg)
Figura 3. Rompimiento de Haematoccocus en Bead-beater a distintos tiempos de agitacin, medido
por la eficiencia de extraccin de carotenoides con hexano. Muestra 1.
Pruebas con el Tissue Tearor.

Posteriormente se prob otro disruptor mecnico, generalmente llamado Tissue Tearor (Model 985-
370, variable speed, 5000- 30000 r.p.m., Biospec products, Inc). Este disruptor funciona bsicamente
con el principio del rotor-stator y estas pruebas reemplazan aquellas originalmente propuesto con el
rotor-stator. Como se muestra en la Fig. 4, no result del todo apropiado.
Ruptur con mtodo 3
VI
:~ t
"
:
:;
'"
u
e

Z
O 20 40 60 80
Tiempo homogeneizacin (seg)

Fig. 4. Rompimiento de Haematoccocus a distintos tiempos de tratamiento en el Tissue tearor a
30.000 rev/min. Muestra 1.

28

MINERA CHARAR BLANCO SA
98-1561

Pruebas con licuadora.

Posteriormente se prob la eficiencia de una licuadora de alta velocidad. Se utiliz una velocidad de
22.000 r.p.m. con un rotor de tres hojas de 1.5 cm de largo. Este disruptor mostr una baja
potencialidad para romper Haematoccocus (Fig. 5).

Fig. 5. Rompimiento de Haematoccocus agitado en licuadora a 10.000 rev/min por diferentes
tiempos. Muestra 2.
Pruebas con el sonicador.

Se prob la capacidad de rompimiento por ultrasonicacin utilizando u equipo de 50 watt, con una
punta (tip) de 9.5 mm que sonicaba un volumen de 50 mi de suspensin de alga al 40%. Se
entregaron pulsos de 15 segundos a 40 watt con intervalos de igual tiempo para evitar calentamiento

de la muestra. Este tratamiento result altamente efectivo como se muestra en la figura 5.
Pruebas de Compresin y Descompresin rpida.

Esta experiencia no se realiz debido a la imposibilidad de contar con una celda para compresin

descompresin. Estas celdas no estn disponibles en el pas y su compra era injustificada por su alto
29

MINERA CHAAR BLANCO SA.
98-1561

costo, la dificultad para escalar el mtodo y la disponibilidad de algunos de los mtodos probados
(sealados anteriormente), que mostraban un escalamiento relativamente fcil.
TECNICAS DE SECADO.
A cargo de Dr. Saturnino de Pablo. INTA, U. de Chile.
Objetivo Tcnico.
Determinar las condiciones de procesamiento para la obtencin de un producto liofilizado seco derivado
de Hemafococcus pluvialis lisado con las mejores caractersticas posibles.
MATERIALES Y METODOS
Materiales
Siomasa. La biomasa de Haemafococcus pluvials para el estudio tecnolgico fue proporcionada por
Minera Chaar Blanco, lugar de produccin del alga. Se utilizaron 4 partidas diferentes las que, previo a
su envio fueron lisadas en las instalaciones de la Minera, luego envasadas en bolsas de polietileno,
congeladas y enviadas al INTA. De las cuatro partidas recepcionadas en eIINTA, la primera partida lleg
descongelada a 15C y las tres siguientes llegaron congeladas. Las fechas de recepcin de las partidas
fueron: 28 de noviembre de 1999, 30 de noviembre de 1999, 5 de enero de 2000 y 8 de marzo de 2000,
respectivamente. Una vez recibidas, las partidas se mantuvieron congeladas a -20C hasta su uso.
Antioxidantes. Etoxiquina (lquido) y AS-22 (polvo). Ambos aditivos fueron proporcionados por la empresa
PRINAL S.A. En el anexo I se incluye la ficha tcnica de AS-22 e informacin general sobre etoxiquina.
Mtodos
1.Preparacin de las muestras
1.1)Oescongelado. Para la utilizacin del producto lisado, ste fue descongelado a temperatura ambiente,
en ausencia de luz, en un recipiente cerrado, en agua a 12 oC aproximadamente.
30
...

98-1561

,
1.2)Homogenizacin. Una vez descongeladas, las muestras contenidas en los envases de polietileno se
traspasaron a una licuadora semi industrial de 7 litros de capacidad, marca SiemSen. La muestras se
homogenizaron durante 3 minutos a temperatura ambiente, bajo atmsfera de nitrgeno y protegidas de
la luz. Los homogenizados resultantes se denominaron homogenizados madre (SM) y de todos ellos se
tomaron alicuotas para determinar slidos totales y en algunos casos para anlisis microbiolgico y
determinacin del contenido de astaxantina segn fueran las necesidades del estudio.
1.3) Fraccionamiento del Homogenizado. El volumen restante de cada homogenizado se distribuy en

fracciones de 500 mi, las cuales se envasaron rotuladas en bolsas de polietileno de 0.1 mm, con cierre
deslizante.

1.4) Almacenamiento. Las fracciones rotuladas se almacenaron a - 20 oC en ausencia de luz hasta su
uso.
2. Definicin de las condiciones ptimas de liofilizacin

Uso de antioxidantes. El pigmento astaxantina es un carotenoide que se caracteriza por ser muy reactivo
e inestable en presencia de oxigeno, luz y metales. Por esta razn, la incorporacin de antioxidantes
previo al secado es una medida aconsejable y necesaria.
2.1. Ensayos con antioxidantes

Los homogenizados madre de las partidas 1 a 3 (SM1, SM2, SM3), fueron utilizados en experiencias con
antioxidantes para establecer rangos de concentraciones que aseguren una buena estabilidad del
producto seco. El homogenizado SM4 se trat con la concentracin de antioxidante que produjo una
mayor estabilidad en producto seco, luego se liofiliz y el polvo liofilizado se us para caracterizacin del
producto y como materia prima para el estudio toxicolgico en ratas (Etapa de estudio N 3).

31

93-1561

Para cada ensayo, el agregado de antioxidantes se realiz previo a la liofilizacin, a temperatura ambiente
y con proteccin de la luz, en balones individuales que contenian 100 mi de los homogenizados madre
descongelados. Luego las muestras se congelaron por capas a -50C en bao de alcohol para su
inmediata liofilizacin; ambos procesos se realizaron con las muestras protegidas de la luz.

En el caso de la muestra SM4, se tom un volumen suficiente de homogenizado madre en un vaso y se
le agreg bajo agitacin el total determinado de antioxidante. Luego se tomaron alcuotas de 100 mi que
se pusieron en 7 balones oscurecidos (capacidad mxima del liofilizador) y se congelaron para liofilizar.
La muestra restante se transfiri a una bolsa de polietileno con cierre deslizante y se guard congelada
sin aire a la espera de que se finalizara la liofilizacin en curso, momento en el cual se descongel y se
volvieron a tomar alcuotas de 100 mi en los balones oscurecidos. Esto se repiti las veces necesarias
hasta completar el volumen total de homogenizado a liofilizar.
La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del procedimiento descrito ms arriba.

32

mchanaro@enlelchile.nel
98.1561
Figura 1. Diagrama del procedimiento utilizado
Partidas congeladas

Descongelado

Homogenizacin / 8
Fraccionamiento

,

Almacenamiento
,
Descongelado y adicin de antioxidantes

Inspecciones visual~ ......
~cterizacin de P4
Liofilizacin de
SM1 SM2 SM3 y SM4
I

33

93-1561

La Tabla 1 resume las experiencias realizadas con antioxidantes. Estos fueron agregados en funcin
del porcentaje de slidos totales presentes en los homogenizados madre de cada partida. Etoxiquina
fu agregada de manera directa y AS-22 fue agregado como una solucin al 2% en agua.
Tabla 1. Diseo experimental con antioxidantes

Partida!
Homogenizado madre
Etoxiquina
(% de slidos totales)
AS-22
Etoxiquina + AS - 22
SMI O
0.3
O
0.30
O
0.15 +0.15
SM2 O O
0.1
0.2
0.1
0.2
0.4 0.3
0.5 0.4
0.5
SM3 O

0.15+0.2
0.15+0.3
0.15+0.4
0.15+0.5
0.2 +0.4
2.2. Secado por liofilizacin
Todas las experiencias de secado por liofilizacin se realizaron en un liofilizador para laboratorio, marca
EYELA modelo FD-1, en un rango de yacio entre 1.0 y 2.0 torro Tanto la congelacin como la liofilizacin
fueron realizadas en condiciones de oscuridad.

34
..

rnchana-b@entelchile.net
98-1561

2.3. Condiciones de almacenamiento

Con posterioridad al secado las muestras se almacenaron en algunas de las condiciones que, hasta
nuestro conocimiento, son equivalentes a las utilizadas para el producto comercial Naturose es
decir, sin luz, con nitrgeno y baja temperatura (4C). Semanalmente, se realizaron inspecciones
visuales para evaluar posibles cambios de color en los polvos
3. Mtodos de anlisis
La Tabla 2 muestra los anlisis realizados a los homogenizados madre (SM) y a los correspondientes

polvos liofilizados (P).
Las muestras de polvos analizadas, P1, P2 Y P3, se obtuvieron mezclando cantidades equivalentes
de los liofilizados correspondientes obtenidos en los tratamientos con antioxidantes de cada uno de
los homogenizados madre tal como se presenta en la Tabla 1.

A continuacin se indican las metodologas utilizadas y a menos que est indicado en parntesis, los

anlisis se realizaron en el Laboratorio de Anlisis Qumico de Alimentos deIINTA:
Determinacin de humedad: Mtodo gravimtrico. Medicin de la prdida de masa por

calentamiento en estufa a 60C.
Determinacin de cenizas totales: Mtodo gravimtrico. Medicin de la masa de residuo que queda
despus de calcinacin de muestra a 550C.
Determinacin de protenas: Mtodo Kjeldahl. Determinacin de nitrgeno total. Destruccin de
materia orgnica por accin de cido sulfrico y temperatura, reduccin de nitrgeno a in amonio y
medicin de ste por titulacin cido base.

Para la conversin de nitrgeno total a protenas se utiliz el factor 6,25.
Determinacin de minerales: Los cationes sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre y
manganeso se midieron por espectrofotometra de absorcin atmica, en condiciones estndar en
35

98-1561

las cenizas disueltas en cido. El fsforo se midi por espectrofotometra visible por formacin de
Fosfomolibdato de Vanadio.
Determinacin de metales pesados (Laboratorio ANALAB): Cadmio y plomo se determinaron por

espectrofotometria de absorcin atmica directa. Arsnico y mercurio se midieron por
espectrofotometra de absorcin atmica previa formacin del Hidruro correspondiente.
Determinacin de silicio (Laboratorio ANALAB): Mtodo gravimtrico

Determinacin de astaxantina (Laboratorio de Hormonas, INTA): Determinacin por cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC)
Anlisis Microbilogicos (Laboratorio Microbiologa, INTA) Se midi recuento de aerobos mesfilos,

hongos filamentosos, hongos levaduriformes, coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli,
segn tcnicas estndar AOAC.

Tabla 2: Anlisis realizados
SM 1 P1 SM2 P2 SM3 P3 SM4 P4
Slidos totales .. ..
..
..
..
..
..

Cenizas
Proximal' .. .. .. ..
Minerales b
Metales pesados'
..
..
Microbiolgicos d
Astaxantina
..
..
..
..
: Humedad, protenas (Nx6.25), cenizas, grasa total, fibra cruda, extracto no ntrogenado

b: Ca, Mg, Na, K, Zn, Fe, Cu, Mn, P, Si.
c: Cd, As, Hg, Pb
d : Recuento aerobios mesfilos, hongos filamentosos, hongos levaduriformes, coliformes
totales, coliformes fecales, E. coli

36
- MINERA CHAAR BLANCO SA

98-1561

RESULTADOS
1. Registro fotogrfico.

Algunos de los polvos resultantes de estos ensayos se presentan en las fotografias 1 a 4.
La Fotografa 1,

P1 P1 P1 Naturose
0,3 % Etox. 0,15 % Etox. Control
0,15 % AS 22
tomada a los 7 meses de almacenamiento, corresponde al ensayo SM1 liofilizado con distintas
relaciones de antioxidantes (Tabla 1). En dicha foto se presentan el polvo con 0,3% de etoxiquina, el
polvo con 0,5% de etoxiquina + 0,5% de AS-22, el control con 0% de antioxidantes y la referencia,
Naturose. Se observa que el liofilizado sin antioxidante presenta un color verde distinto al pardo-
rojizo de las muestras con antioxidante. Dicho color verde es causado por la destruccin oxidativa de

37

- MINERA CHAAR BLANCO S.A.
98-1561

los carotenoides presentes en el homogenizado original y es atribuible a clorofilas y sus productos de
degradacin. Este cambio de color se produjo en el transcurso de dos meses demostrando la
inestabilidad del pigmento rojo en el tiempo. Esto confirma la necesidad de agregar algn tipo de
antioxidante para evitar dicho fenmeno. Por otra parte, los dos polvos con agregado de antioxidante
presentaron un color pardo-rojizo durante todo el periodo de observacin. De ambos polvos el que
mantuvo la intensidad ms alta de color a travs del tiempo fue el proveniente del homogenizado con
0.3% de etoxiquina. Este polvo present un color pardo-rojizo intenso, que visualmente tiene una
apariencia semejante a la referencia (NatuRose).
La Fotografia 2,

Etoxiquina
P2
0%
P2
0,4 %
P2
0,2%
P2
0,1 %
Naturose

tomada a los 5 meses de almacenamiento, corresponde al ensayo realizado en SM2 con diferentes
concentraciones de etoxiquina (Tabla 1). En la fotografia se muestran el polvo control (0% de

etoxiquina) y los polvos con 0,4%,0,2% Y0,1% de etoxiquina adems de la referencia NatuRose.

38

98-1561

El control presenta un color pardo-verdoso que indica una degradacin del pigmento rojo presente en

el homogenizado original. Por su parte nuevamente los polvos con antioxidante agregado
presentaron una mayor estabilidad en su coloracin. Las muestras Clan antioxidante son de color
pardo-rojizo sin distinguirse a simple vista alguna diferencia entre las intensidades de este color, que
si es notoriamente menor a la referencia NatuRose.

La fotografia 3,

P2 P2 P2 P2 Naturose
Etoxiquina O% 0,4 % 0,2% 0,1 %
tomada a los 5 meses de almacenamiento, corresponde al ensayo realizado con diferentes

concentraciones de AS-22 en la muestra SM2 (Tabla 1). En la fotografia se muestran el polvo control
(0% de AS-22), los polvos con 0,5%; 0,3% Y0,1% de AS-22 y la referencia, NatuRose. La muestra
con 0,1% de AS-22 present un comportamiento semejante al control sin antioxidante y se puede
observar que ambas tienen un color pardo-verdoso que indica la degradacin del pigmento rojo
presente en el homogenizado original. Por otra parte no se aprecian diferencias a simple vista, en

39

98-1581

(las intensidades del color pardo-rojizo de los otros liofilizados (0,5% y 0,3% de AS-22) los que
presentan una intensidad mucho menor que la referencia Naturose.
La fotografa 4,

P3
%
P3 P3 P3 Naturose
Etoxiquina
AS-22 0%
0,15%
0,2 %
0,15 %
0,4%
0,2%
0,4%

tomada a los 5 meses de almacenamiento, corresponde al ensayo realizado con mezclas a
diferentes concentraciones de etoxiquina y AS-22 en la muestra SM3 (Tabla 1). En la fotografia se
muestran el polvo control (0% de etoxiquina y 0% de AS-22), los polvos con 0,15% de etoxiquina +
0,2% de AS-22, con 0,15% de etoxiquina + 0,4% de AS-22 y con 0,2% de etoxiquina + 0,4 de AS-
22 y la referencia Naturose. A la vista el control presenta nuevamente un color pardo-verdoso que
indica una degradacin del pigmento rojo. Las muestras tratadas con antioxidantes no presentan

40

98-1561

diferencias notorias en las intensidades del color pardo-rojizo siendo dichas intensidades mucho
menores que la referencia NatuRose
2. Resultados analticos

2.1 Composicin proximal
Los resultados de composicin qumica se muestran en la Tabla 3. La composicin de polvo ms
semejante a la de NatuRose correspondi al liofilizado P1. Al expresar la composicin de ambos
como peso seco se aprecia incluso una mayor similitud (Tabla 4). En esta forma de expresin, la
diferencias mayores entre ambos se observan en el contenido de cenizas y extracto no nitrogenado,
siendo el extracto etreo prcticamente igual.

Al comparar el polvo P1 con los correspondientes a P2, P3 Y P4 se observa que la composicin
proximal de estos ltimos difiere ampliamente en todos los parmetros analizados. Todos se
encuentran disminuidos a excepcin del contenido de cenizas que se presenta muy elevado y que en
P4 alcanza un valor de 62.57% lo que imposibilita cualquier comparacin con NatuRose (9.69% de
cenizas). Esto se refleja tambin a nivel de los homogenizados madre donde SM2, SM3 y SM4,
comparativamente, presentan valores de cenizas muy por encima del contenido de SM1 (0,86%),
llegando incluso en SM4 a superar en ms de diez veces dicho valor (9,46%).
La caracterizacin de la muestra P4 en contenido de minerales revel un alto contenido de calcio

(20,47%) y de silicio (11,43%). Esta situacin, sumada al elevado valor de cenizas (62.57%), ndica
un gran contenido de residuo mineral insoluble causado por presencia de arena y otros residuos

particulados.

41

98-1561

Tabla 3, Resultados de anlisis quimicos realizados a las muestras estudiadas

Anlisis NaluRose SMI PI SM2 P2 SM3 P3 SM4 P4
(g/100g)
S, totales
Cenizas
6.44
0.86
-~-~~ .
9,71
_._-_._------~.
4.69
-_...........
8.17
_- _.. _---_._-
3.46
14.90
--- _. _._-_.- --------.-
9.46
_._--~-
base
hmeda
Cenizas 13.4 48.3 42.4 63.50
base seca
Proximal
(g/lOO g)
Humedad 9.66 2.71 2.25 5.56 2.88

Proteinas 25.54 26.30 14.85 19.32 10.78
E. etreo 20.91 22.54 17.38 17.52 10.25
F. cruda 7.10 7.82 3.46 2.79
Cenizas 9.69 13.43 48.35 39,6 62.57
E.N.N:
CHO.
27.10
34.20
27.19
35.01 17.17
14.54
18.00
10.73
13.52
fofales'
Minerales
(g/100g)
Ca 0.45 20.47
Mg
Na
0.85 2.00
0.11

K 0.25
Zn 0.48
Fe
Si
0.82 0.82
11.43
(mg/100g)
Cu
Mn
16.98
82.53

42

"- MINERA CHAAR BLANCO S.A.
98-1561

P 154.39
M.
Pesados
(mglkg)

Cd
As
<0.1
0.26
Hg <0.05

Pb 1.0 0.9
+ E.N.N.: Extracto no nitrogenado' CHO total: suma de fibra cruda y extracto no nitrogenado
Tabla 4. Composicin proximal de polvos liofilizados expresada como peso seco

Anlisis NatuRose Pl P2 P3 P4
Proteinas 28.27 27.03 15.19 20.46 11.10

E. etreo 23.15 23.17 17.78 18.55 10.55
F. cruda 7.86 8.04 3.66 2.87

Cenizas 10.73 13.80 49.46 41.93 64.43
E.N.N: 30.00 27.95 15.40 10.84
CHO.Total' 37.84 35.99 17.57 16.31 13.92
+ E.N.N.: Extracto no nitrogenado

CHO total: suma de fibra cruda y extracto no nitrogenado
Las diferencias observadas en la composicin quimica de los polvos obtenidos en las partidas SM2,
SM3 y SM4 indican que existen diferentes calidades de materia prima entre partida y partida lo que
dificulta la obtencin de un producto estndar y el anlisis de los resultados

2.2 Astaxantina
La tabla 5 muestra el contenido de astaxantina y carotenoides totales de las muestras en base seca.
En general los valores de astaxantina estn en el rango de 4.3 a 5.2 con excepcin de las muestras
3 y 4. Estas muestras fueron deshidratadas mayor tiempo durante la etapa de secado que se realiza
como parte de la detenminacin.
43

MINERA CHAAR BLANCO SA.
98-1561

Los valores obtenidos no guardan relacin con lo esperado. Por ejemplo, al comparar el contenido de

astaxantina de las muestras 1 y 2 cabra esperar que los valores fueran guales o una disminucin en
el contenido de la muestra 2 -si es que la manipulacin afecta-o No obstante lo anterior, si se
compara el contenido de astaxantina de las mismas muestras 1 y 2 con su liofilizado (muestra 5)

permite concluir que proceso de liofilizado bajo las condiciones descritas, no degrada astaxantina.
Con respecto al efecto del antioxidante, las muestras 5 y 6 se pueden considerar semejantes en el
contenido de astaxantina, a pesar que presentan una diferencia que no parece lgica (ms
astaxantina en la muestra sin antioxidante) porque ambas corresponden a anlisis realizados
prcticamente a tiempo cero despus de su obtencin. En este caso, una explicacin plausible para
la diferencia encontrada radicara en la variabilidad metodolgica sumada al posible efecto del

proceso de agregado del antioxidante. Sin embargo, esta situacin de semejanza cambia al
comparar la muestra 5 con la muestra 46 la cual corresponde a la misma muestra 5 expuesta al aire
durante siete dias. Por lo tanto, se podra concluir que la presencia del antioxidante, etoxiquina en
particular, protege al pigmento de la oxidacin durante el almacenamiento. La estabilidad del
pigmento es independiente de la presencia o ausencia de etoxiquina bajo las condiciones de
liofilizacin utilizadas. Sin embargo, sto no es extrapolable a otros procesos de secado, en los
cuales habra que estudiar el grado de proteccin de ste u otro antioxidante durante dicho proceso.
Es el caso del secado por atomizacin, estudio que qued pendiente, por parte de INTA.
El contenido de astaxantina que declara NatuRose es de 15 a 20 mg/g en base hmeda lo que
implica 16.1 a 21.5 mg/g en base seca (ajuste hecho considerando 7% de humedad ya que se
declara una humedad de 6 a 9%).
44
MINERA CHA~AR BLANCO SA.
98-1561

Tabla 5. Contenido de astaxantina y carotenoides totales en peso seco en muestras SM4 y P4
Clave MUESTRA Aslaxantina Carotenoides totales

mg/g mg/g
1 SM4 inicial' sin etoxiquina 4,30 6,24
2 SM4 final' sin etoxiquina 5,12 6,32
3
4
SM4 inicial' con etoxiquina
SM4 final' con etoxiquina
2,48
2,84
6,76
4,40
5 SM4 sin etoxiquina 5,24 5,92
46 SM4 sin etoxiquina (color pardo verdoso)

expuesto al aire
2.60 4.82
6
..
P4 con etoxiquina 4,64
..
6,52
, Imclal indica muestra correspondiente a la primera alicuota de hofihzaclon, con slo un proceso de
descongelacin
+ Final indica muestra correspondiente a la ltima alicuota de liofilizacin, con dos o ms procesos de
descongelacin.
Tcnica de Secado por Atomizacin (Secador Spray).
Considerando que el sistema de secado produce como resultado un producto estndar de alta
calidad (Premium), es que se realiz el siguiente procedimiento.
Se tom una muestra de 379 gr de biomasa lisada hmeda para homogenizar mediante un equipo de
agitacin 'Ultraturrax' a 13.000 rpm durante 5 minutos, para luego es sometida a secado.
Este secador es de marca Buchi 190, con una temperatura de entrada de 89C, la cual baja a 68C
en la salida. Los tiempos de residencia de la microalga fue de 30 minutos aproximadamente.

45

98-1561

Resultados

Producto de que la biomasa llevada al homogenizador precipit rapidamente y que el precipitado
tapaba la boquilla glic se decidi utilizar el percolado en el secador. Esto dio como producto final
un polvo homogneo de buena apariencia organolptica, es decir buena granulometria, buen color,
sabor y olor aceptable.
CARACTERIZACIN YANLISIS DE LA HARINA DE MICROALGAS, y PROPIEDADES DE LA

ASTAXANTINA.
A cargo de Dr. Luis Valladares B., INTA. Universidad de Chile.

CARACTERIZACiN Y ANLISIS DEL PRODUCTO SECO (HARINA DE MICROALGAS) y
PROPIEDADES DE LA ASTAXANTINA EN LA BIOMASA HMEDA y SECA.

ESTUDIO DE TOXICIDAD ORAL AGUDA DE ASTAXANTINA.
El estudio de toxicidad oral aguda fue realizado en el vivero dellNTA con ratas de 64 dias de edad
de la cepa Sprague-Dawley, tratadas de acuerdo al protocolo que se describe a continuacin (Figura

1) .
Protocolo.
Para la prueba de toxicidad oral aguda fueron utilizadas 12 ratas, distribuidas al azar en 4 grupos
experimentales de 3 animales del mismo sexo. Constituyndose as, un grupo control y otro bajo
tratamento para cada sexo (n=3). Las ratas fueron mantendas en jaulas en forma individual con
rgimen de alimentacin ad libitum.
En todos los grupos experimentales los animales fueron sometidos a una canulacin gastro-
esofgica para la administracin de una dosis de biomasa seca del alga de 5g/Kg de peso
corporal en una solucin acuosa de carboximetil-celulosa al 0,5% (grupos tratados) o de un

volumen de la solucin de carboximetil-celulosa (grupos controles).

46

MINERA CHANAR BLANCO S.A.

98-1561
Grupo N1:
Hembras Controles
Grupo N2:
Hembras Tratadas
Grupo N3:
Machos Controles
Grupo N"3:
Machos Tratados
-
GL GL
-
- - -

Solucin acuosa de Biomasa seca en solucin acuosa
carboKimetil-celulosa 0,5% de carOOximetil-celulosa 0,5%
14dlas
ft
ft
Mortalidad
Anlisis de Parmetros de Toxicidad:
..,
ft
Consumo de Alimento

Morbilidad Peso Corporal
ft Alteracin de la Conducta ft Morfologia y Peso Visceral
ft Letargia

Figura 1.- Esquema Protocolo de Toxicidad Oral Aguda.
Los animales estuvieron bajo observacin durante los 14 das del ensayo de toxicidad,
evaluando parmetros tales como el peso corporal, letargia, alteracin de la conducta, consumo

del alimento, la mortalidad y morbilidad.
El da catorce los animales fueron sacrificados observando la morfologia de tejidos internos
como el hgado, corazn, bazo, riones, grasa visceral y gnadas, adems de registrar su peso y
el peso corporal para su posterior anlisis cuantitativo y estadstico.

Resultados.
Morbilidad y Mortalidad.
Durante el estudio no se registr muerte alguna, no observndose siquiera indicios de patologas

en desarrollo tanto en los grupos tratados y controles.

47

-

911-1561

Letargia y Alteraciones Conductuales.
Los animales fueron evaluados diariamente de acuerdo a su comportamiento en los distintos
grupos experimentales, no presentando cambios observables en los patrones habituales de

conducta ni de actividad locomotora.
Consumo de Alimento.
Los animales experimentales tuvieron un consumo nonmal de agua y alimento no registrndose
diferencias entre animales tratados y controles.
Peso Corporal.
El peso corporal de los animales fue registrado peridicamente desde el inicio del ensayo hasta
su tnmino, observndose un progresivo y paulatino incremento durante dicho lapso de tiempo.

De esta manera se obtuvieron los pesos iniciales y finales indicados en la tabla 1, mostrando una
homogeneidad en las condiciones iniciales entre los distintos grupos de cada sexo, y que bajo las
condiciones del ensayo, no arrojaron diferencias estadisticamente significativas (p<O,05) al final
del tratamiento entre ellos. Asi entonces, la administracin aguda del particulado algal con
astaxantina no alter los condicionantes metablicos relacionados con el aumento de peso tanto

en machos como en hembras.
Tabla 1.- Peso Corporal Inicial y Final.
Grupos n
"', f~sq.~[p,?r~llni9i.~19,fr;,
, "":""_,,,,,_,l
,.,,:, ,' ;.,;'_ > ""'""
Promedio S.D.
,;P~~'~9rp,QWlfi~~"I(gr); "
"_"""~,,,_ ..' ,;". __"_' ",,';;-,_.:",.;,
Promedio S.D,
,:J;'~,,'j., /,",.. '..,.-,/',' .:', v, ,
Hembras Controles 3 263,333 36,638 298,000 32,909
Hembras Tratadas
Machos Controles
3
3
274,667 11,060
383,667 27,737
307,333 9,292
444,667 25,146
Machos Tratados 3 361,000 26,627 413,667 21,362

48

98-1561

Caractersticas Morfolgicas Externas y Peso de los Tejidos Muestreados.

Luego del sacrificio de los animales, se disectaron los tejidos internos considerados como
importantes para este estudio: hgado, corazn, bazo, riones, gnadas y grasa abdominal,
evaluando sus caractersticas externas como tambin el peso. Debe mencionarse que en primera
instancia, los distintos tejidos no mostraron diferencias observables en cuanto a su forma, color y
consistencia.
En la tabla 2 se muestran los valores registrados para el peso de los distintos tejidos evaluados al
final de este estudio. Estos valores son mostrados como la relacin entre el peso del tejido
versus el peso corporal del animal al momento de la medicin.

El anlisis estadstico de los datos, mediante los tests de Student (!-test) y Mann-Whitney,
demostraron que no hay diferencia significativa (p<O,05) entre los grupos de animales tratados
con los controles para ninguno de los parmetros de peso estudiados
Tabla 2.- Relacin Peso de los Tejidos Internos/Peso Corporal.

Peso Higado '
' . "j.
,Jgr) ir
Grupos
Promedio Promedio Promedio
Promedio S.D.
Promedio
Promedio S.D.
Hembras
, S.D. S.D.
0,0036
S.D.
0,0019 0,0069
S.D.
0,00056

0,037 0,0028 0,0521 0,0175
Controles 0,00062 0,000052 0,00097 0,000055
Hembras 0,0036 0,0028 0,0070 0,0012

0,034 0,0034 0,217 0,270
Tratadas 0,00037 0,00079 0,00035 0,00064

Machos 0,0041 0,0017 0,0069 0,0083
0,036 0,0018 0,04190,0127
Controles 0,00049 0,00030 0,00035 0,00056
Machos
Tratados
0,036 0,0041
0,0037
0,00023
0,0019
0,00019
0,0074
0,000077
0,0083
0,00026
0,0327 0,0050

49

98-1561

A continuacin se adjuntan los grficos (Figuras 2-9) construidos a partir de los datos mostrados en
la tabla 2. El siguiente cuadro seala el significado de las abreviaciones utilizadas y su

correspondencia con los colores asignados a las barras para todos los grficos.

_ HC: Hembras Control
I!i!iiii!l HT: Hembras Tratadas

_ MC: Machos Control
C=:::J MT: Machos Tratados

Peso corporal al momento del inicio
del protocolo experimental.
Peso corporal al momento final
del protocolo experimental.
~,------------------------.
Fig.2
~,------------------------.
400

!!300
1
~

200
100 100
o
HC.bodyw i HT. boyw.i Me. bodyw i MT. bodyw.i
Grupos experimentales.
o
HC.bwl HT.bwf MC.bwf MT.bwf

Grupos experimentales

50
- MINERA CHAAR BLANCO S.A.
98-1561

Peso heptico al final del
protocolo experimental.
Peso de las gnadas al final del
protocolo experimental.
0,05 0,010
Flg.4 Flg.5
. 0,008

0,04
~
g
= 0,006
~
o 0,03

u 9
~
o
~
~
o

0,02 ~ 0,004
o
L

0,01 0.002
0,00
HC. hw HT. hw MC.h....
Orupo5 Experimentales
"'l. hw
0.000
He. gw HT. gw Me. gw
Grupos EXp4!rlmentales
!.Ir.gw
Peso de los rlfiones al final

Peso del bazo al final del
protocolo experimental. del protocolo experimental.
0.004 0,010
Flg.6 Flg.7
;:;
g
0.003
.=
~
o,ooa

o
2
~ 0,006

~
o
0,002
..

L
~
o
O,C04

0,001
L
0,002
O,Cloa
HG. &W HT. sw Me. SW MT. SW
0,000
HG. kw HI. kw Me. kw MT.kw
Grupos Experimentales Grupos Experimentales

Peso del corazn al final del Peso de la grasa abdominal al final
protocolo experimental. del protocolo experimental.
0.005
Flg.8 '" Flg.9
g
0.004 ;:;
g
;;
O.'
O.,
..
o
U
0.003
~
E
o
~ 0.3
~
o 0.002

L
"=
~
o 0.2
0.001
O,
0.000
HC,h rt .... HT.h rt .... MC.he.rI ... , MT.heart ...
Grupos experlmentales
0.0
HC.ab.lal .... HT,.b.fal .... MC,lb.fll ...
Grupos experlmentales
MT,.b.fal ...

51

98-1561

CONCLUSIONES GENERALES
*Las diferentes pruebas realizadas durante el desarrollo de la etapa de ruptura celular para dejar
biodisponible el pigmento, indican que el rompimiento por frotacin utilizando bolitas de acero y

agitacin recproca (Bead-Beater) es efectivo y podra escalarse para procesamiento de cantidades
mayores.

*En base a estos resultados se trabaj en definir las bases del rompimiento utilizando bolitas de
acero, como dependencia de la agitacin (revoluciones por minuto y tipo de agitacin, tamao de
esferas, etc) y en los potenciales materiales y equipos mas adecuados.

*Las condiciones de rompimiento dependen de la energa entregada por masa a tratar ( Masa de
bolitas x Revoluciones por Minuto x Tiempo I Volmen). Esta relacin pemitir escalar el equipo para
tratamiento de los volmenes apropiados de produccin.

*Para el rompimiento en volmenes mayores hasta 50 mi, se realiza por 20 minutos a 1100 rpm.
*De acuerdo a los resultados obtenidos en la etapa de secado y adicin de antioxidantes se concluye
que es imprescindible el uso de antioxidantes para la estabilidad del color, de acuerdo a lo

visualizado en las fotografas.
*EI polvo liofilizado que present una coloracin a simple vista mas semejante al patrn (NatuRose)
y con buena estabilidad en el tiempo (7 meses), fue el proveniente de SM1 con agregado de 0,3% de
etoxiquina. Este nivel se utiliz para preparar P4 tanto para las pruebas de caracterizacin como
para el estudio de toxicidad en ratas.

*La diferencia encontrada en la intensidad del color en el tiempo entre SM1 con 0,3% etoxiquina y
SM2 con 0,4 etoxiquina (nivel al cual se podra esperar una estabilidad igualo mayor), permite
suponer que ambas partidas no son semejantes. Esto tambin se podra inferir de las distintas

52

MINERA CHAflAR BLANCO SAo
mchanarb@enlelchile.nel
98-1581
intensidades de color verde que mostraron los controles de P2 y P3 en comparacin con P1. La
produccin de partidas semejantes en aspectos tales como composicin es de importancia

fundamental a nivel industrial.
'La fotografa 5 pretende comparar visualmente la referencia NatuRose con P1 y P4, polvos
liofilizados la mejor condicin de antioxidante (0,3% de etoxiquina), al cabo de 7 y 5 meses de

almacenamiento, respectivamente.

'La tcnica de secado por atomizacin (secador spray), utilizando un secador marca Buchi 190,
result poco ptima, debido a que la boquilla del secador se tapaba con los restos de pared celular
no rota y slo se pudo utilizar el percolado, una vez que precipitaron los slidos. Producto de esto se
debe volver a la molienda y optimizarla para luego centrifugar y utilizar el nadante en el secador,y
eliminar los restos de pared celular. Si bien esto es un detalle mecnico (existen otras boquillas
adaptables, no accesible en ese momento), se determin desarrollar esta parte como anexo por su
alto costo.

'En la tcnica de secado por atomizacin se utilizaron dos solventes orgnicos, etanol y acetona,
resultando ambos acertados para esta microalga.
'Respecto al estudio de toxicidad, obtenidos en la diferencia de peso corporal y otras caractersticas
de los organismos en estudio antes y despus de los tratamientos, se puede ratificar adicionalmente
lo mencionado en relacin con el consumo de agua y alimento, ya que en los distintos grupos
evaluados no existieron indicios de ingesta diferencial alguna.
'El comportamiento de los animales al no existir cambios aparentes en el grado de irritabilidad de
stos asociados a respuestas de estrs, no se gatillarran los mecanismos fisiolgicos que

modificarian la conducta alimentaria y metablica que regularan en forma diferencial la
incorporacin y mobilizacin de nutrientes.
52

..
MINERA CHAAR BLANCO SAo
98-1581
'Los medios de cultivo M1 y M2 utilizados en el cultivo de Haematoccocus p/uvialis corresponden a

los que arrojan mejores resultados en crecimiento celular, utilizados en el estudio. Estos
corresponden a f/2 modificado para agua dulce y el medio para eh/orella sp, modificado para las
necesidades de H. P/uvia/is.
'La metodologa estandar para cultivo de microalgas de agua dulce, permiti cultivar la microalga H.
p/uvialis tanto en laboratorio como en el cultivo intensivo en "race-ways".
'EI tiempo de cultivo dentro del laboratorio fue de tres semanas a 22C, que permiti el desarrollo
completo de la microalga hasta el momento de inicio de acumulacin de pigmento producto del
estrs celular (color caf).
'En la etapa de matraces (mayor volmen de cultivo) de un litro de capacidad el inicio de la

acumulacin de pigmento (carotenognesis) ocurri entre el da 16 a 25 despus de la siembra.

'La coloracin caf (observada a simple vista), el engrosamiento de la pared celular y la prdida del
flagelo, son seales inequvocas del comienzo de la formacin de akinetos.
'Las condiciones climticas de la IV Regin, con un clima templado en verano y poca variacin
diaria de temperatura en invierno, se concluye que es factible el desarrollo del cultivo masivo e
industrial de la microalga H. p/uvialis.

'Los reactores del tipo "race-ways" demostraron ser eficientes debido a su diseo simple y
econmico, de fcil manejo en cuanto a cosecha limpieza y reparaciones. Cabe sealar que se debe
mejorar el sistema de agitacin agregando unos deflectores estticos en puntos estratgicos del
reactor para optimizar el recorrido del cuerpo de agua.
'La cosecha debe optimizarse con elementos mecnicos como bombas, centrfugas y/o clivas
elctricas.

53

98-1561

'Los tiempos estimados en la construccin e instalacin de los reactores, inoculacin y cosecha
fueron mejorados en un alto porcentaje a lo programado. Dando como resultado una metodologia
clara y confiable, para la extrapolacin de datos a emplear en el desarrollo del proyecto productivo.

55

Proyecto FONTEC: Microalgas
Minera Chaar Blanoo S.A.

98-1561
RESMEN DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS

IFECHA IAgosto, 30.2000 I

1.- ANTECEDENTES GENERALES.
CODIGO DEL PROYECTO 98-1561

trTULO DEL PROYECTO Cultivo de la Microalga Haematococcus pluvialis a nivel de
planta piloto para obtener harina de microalga pigmentada
EMPRESA
lastaxantinal
Minera Chanar Blanco SA
INFORME
TOTAL INFORMES DE AVANCE
INFORME FINAL
27dosT
2.- CUADRO RESMEN DE ACTIVIDADES.
2.1.- ACTIVIDADES PROGRAMADAS
Minera Chaar Blanco S.A.:

Recopilacin de Antecedentes Previos: Se utiliz literatura de difusin, papers, revistas e internet,
para obtener mayor informacin.
Anlisis y Detenninacin de Variables de Escalamiento: Desarrollo de meteodologa de cultivo en
reactores. Estandarizacin de metodologa de siembra, cosecha y proceso de pigmentacin
(acumulacin de carotenoides).
Pruebas de Funcionamiento, ajuste de varliables de proceso: Repeticin exitosa de siembras en
reactor, cosecha, rompimiento de la microalga y lectura de carotenoides en espectrofotmetro,
siguiendo la metodologa desarrollada por MCHB e INTA.
INTA:
Desarrollo de etapa 2 y 3. Caracterizacin y cuantificacin de astaxantina, secado de biomasa en
estufa y secador Spray. Liofilizado de muestras. Adcin de antioxidantes.
2.2.- ACTIVIDADES EFECTIVAMENTE DESARROLLADAS

Minera Chaar Blanco S.A.:
Recopilacin de Antecedentes Previos: Se recopil literatura al respecto, informacin obtenida a
travs de internet. y de textos publicados.

Anlisis y Detenninacin de Variables de Escalamiento: Se desarroll una metodologa para el
cultivo de la microalga en los reactores y estandariz la siembra, cosecha y el proceso de

pigmentacin.
Pruebas de Funcionamiento, aiuste de variables de oroceso: Se escal a nivel oiloto el oroceso de

.

Minera Chaar Blanco S.A.

98-1561
rompimiento de pared celular. La microalga fue enviada congelada a INTA para el desarrollo de las
actividades. Los volmenes de envo superaban 20 kg.

Se aument el tamao de produccin del sistema de cultivo en laboratorio, ya que se hizo pequeo
para los volmenes que se manejan en el exterior.

Se realizaron pruebas de induccin a la pigmentacin para mantener constante el producto final.
INTA:
Realizacin de estudio 2 y 3. Rompimiento celular, adicin de antioxidantes, pruebas de toxicidad.

Pruebas microbiolgicas, perfil de carotenoides y cuantificacin de astaxantina.
Tcnicas de secado utilizando estufa. Uofilizado de muestras.
...

Minera Chaar Blanco S.A

98-1561
CUADRO RESMEN GASTOS REALES

1 FECHA 1 Agosto, 30. 2000 1
1.- ANTECEDENTES GENERALES.
CODIGODELPROYECTO'
TITULO.D~L.PRoyrO.
98-1561 ./
Cultivo de la Microalga Haematococus pluvialis a nivel de planta
piloto para obtener harina de microalga pigmentada
'1 (aslaxantina)
EMPRESA ':: . . . . . ' Minera Chaar Blanco S.A.
INFORME ..:,;> :'... :.' .'.." INFORME FINAL
TOTAL INFORMES DE AVANCE 2 (dos)
2.- CUADRO DE RESMEN DE GASTOS.

IPARTIDASDECOSTOS-:C PROGRAMADOS ..'l':.: "C;ASTOSREALES>
.... ...... ......
.........: ' .... 1< .GASTOS
. . . MILES ($) . '. ..........:.: . . I . '. ". ACUMULADOS.. ..........
PERSONAL DE . . ':> :_..
INVESTIGACIN .' ......: '.

. . 29.214,50 38.050,15
eERSONAL. ... / \ ' .....
DEAPOYO': . 5.016,00 7.942,00
SERVlCIOS,MATERIALESY
OTROS': ........ :............... :..:..............: ...' 15.614,61 18.442,44
USO DE BIENES f :.:. :.......... '.' .
DECAPITAL-;:-- . ;., .............:.. 9.849,00 7.238,78
ADQU1SICINDEB.lENESDE
CAPITAL . . . . . , ...... ': .... ':. 650,00 670,00

TOTAL
..
......:
60.341,00 72.343,37
. .... .. ' .....

Revisar Tabla 4 (anexo de la estructura de Costos Totales).

-
Proyecto FONTEC: Micraa/gas

98-1561
DETALLE DE GASTOS DEL PROYECTO

,r::F=EC=H""'A""TI-:-Ag-o-sto-,:::-30:-.=20:::-00"1
- ANTECEDENTES GENERALES
.CODIGO DEL PROYECTO 98-1561
TITULO DEL PROYECTO

.......
Cultivo de la Microalga Haemaiococus pluvialis a nivel de planta piloto para
obtener harina de microalga pigmentada (astaxantina) .
EMPRESA .. :
' ..
INFORME ...: ...... INFORME FINAL
TOTAL INFORMES DEAVANCE 2 (dos)

.{ ....
2.- CUADRO DE RESMEN DE GASTOS.

i
'Jefe-Tcnico
11.856,00
5.763,33

'Inves!. Cultivo 7.093,33
'INTA 1

'Ser, mat.l NTA 8.623,61 7.561,07 1.361,00 8.922,07
'Mat.vidrio 200,00 328,50 59,13 387,63
. 'Reactivos lab 470,00 2.136,27 384,89 2.523,16
..
'Insumas agri
' ArriendoCentr.
'Energa Elec.
380,00
1.500,00
991,00
352,87
1.184,30
991,00
63,51
213,17
178,38
416,38
1.397,47
1.169,38
...
'Reactor
'Ser. Anlisis
1.950,00
1.500,00
2.038,99
2.111,87
367,01
220,56
2.406,00
2.332,53
'Varios
'Otros Anlisis
0,00 1.588,34
147
274,06 1.862,40
'Ma!. Lab.
'Laboratorio
'INTA
'Blowers
'Bombas

ndez Codaceo
..&1$'""1'" esentante Legal

..


98-1561
IMPLEMENTACiN DE LOS RESULTADOS DEL PROYECTO
IFECHA IAgosto, 30.2000 I

CODlGO DEL PROYECTO
TITULO DEL PROYECTO
98-1561
Cultivo de la Microalga Haematococcus pluvialis a nivel de
planta piloto para obtener harina de microalga pigmentada
I(astaxantina)
EMPRESA
IMPLEMENTACION DE LOS RESULTADOS DEL PROYECTO

Los principales resultados obtenidos en el proyecto son:
Desarrollo de una metodologa estndar de cultivo para la microalga tanto en reactores como en
laboratorio, sin prdida de producto y optimizacin de nutrientes. As mismo una metodologa de
cosecha para estos volmenes (30 kg/reactor) y de induccin a la carotenognesis.
Utilizacin de un antioxidante permitido, para evitar la prdida de astaxantina una vez que est
bodisponible.
Utilizacin de secador Spray a nivel de planta piloto (200 a 300 grl hora), sin embargo debe
optimizarse el mtodo de molienda, ya que el tamao de las particulas a secar impide el paso
por la boquilla utilizado para este secado (secado Spray).
El mtodo de ruptura celular, permite la liberacin de la astaxantina desde los cistos de
proteccin formado por las micoalgas en el proceso de carotenognesis. Este mtodo utilzando
bolitas de acero es completamente escalable, ya que la temperatura no sobrepasa a los 20 oC,
lo que no provoca daos al pigmento ni a otras elementos presentes en la microalga.
Los niveles de carotenoides totales y astaxantina, permiten obtener un producto de estndar y
de calidad. Si bien los niveles no son tan altos como el producto patr6n,si permiten obtener un
producto con una actividad pigmentante considerablemente atractiva.
ACCIONES PARA SU IMPLEMENTACiN PRODUCTIVA:
Como consecuencia del xito del proyecto de innovacin, se desarrollar un sistema de molienda a
mayor escala (min. 20 Kg por llenado), para el secado industrial y poder obtener el producto
suficiente para entregar a salmoneras que estan dispuestas a probar el producto. Esta etapa es
fundamental, pues en el proyecto se determinaron todas las variables escalables a planta industrial,
para manejar volmenes mayores.
La prueba en salmones y la durabilidad del producto obtenido son importantisimas. Ya que si bin es
conocida la efectividad de esta harina en la pigmentacin del msculo de los salmonideos, es

fundamental probar el producto aQui obtenido.
Minera Chaar Blanco S.A

98-1561

Los contactos con salmoneras est definidos yel desarrollo de esta etapa es a corto plazo (1 ao),y
en forma simultnea de realizar el estudio de preinversin, para posteriormente implementar la
planta industrial.
Respecto a la calidad del producto, impurezas, cenizas y porcentaje de aslaxantina pura, dependen
claramente de la disponibilidad de filtros y otros equipos para limpiar el agua de pozo. La calidad del
agua es buena, sin embargo la flora permanente dentro de los tubos de canalizacin no permiten un
monocultivo.
Por otra parte, la utilizacin de equipos ms eficientes en la cosecha, evitarn la exposicin de la
biomasa cosechada, a contaminacin ambiental.
Todas estas alternativas se manejarn en la inversin para la planta industrial.

98-1561 If

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,.t.

Jefe-Tcnico Investigador: Sra. Cecilia A. Carvajal Urizar

Investigador de Proyecto: Sr. L. Alejandro Briceo Tapia.

En el ltimo decenio, se constata que el pas ha sabido enfrentar con

Sin embargo, nuestra estrategia de desarrollo, fundada en el mayor

Para abordar el proceso de modernizacin y reconverSlOn de la

El Fondo Nacional de Desarrollo Tecnolgic y Productivo FONTEC,

Las Lneas de financiamiento de este Fondo incluyen, adems, el apoyo

De este modo se tiende a la incorporacin del concepto "Empresa -

El Proyecto que se presenta, constituye un valioso aporte al

PROYECTO DE INNOVACiN TECNOLGICA

PILOTO EN REACTORES CERRADOS, PARA OBTENER HARINA DE MICROALGA

A.- RESUMEN EJECUTIVO.

El proyecto biotecnolgico desarrollado, consisti en la obtencin de biomasa a partir de una

. microalga conocida con el nombre de Haematoccocus pluvialis, productora de un pigmento natural

colorante sustituye el adquirido en ambiente natural y revaloriza el producto.

nombre comercial es Carophyll Pink 8% y es utilizada actualmente como aditivo en la preparacin

La importancia de la produccin natural de pigmento es llenar un nicho econmico, que quedar

mercado han motivado la bsqueda de pigmentos naturales.

como una altemativa al pigmento artificial.

11.- ANTECEDENTES DE LA EMPRESA.

Empresa en incursionar en el campo de la Biotecnologia y producir en Chile el pigmento astaxantina

principalmente en la Cuarta regin, abarcando los rubros minero, agricola, biotecnolgico e

Su politica es de diversificar sus inversiones privilegiando el desarrollo de proyectos pioneros e

Technologic Farm S.A., que desarrolla Biotecnologia de punta.

La empresa se encuentra en la etapa de dar a conocer el producto y creando la necesidad, por

total de exportaciones a U.S.A., logrando consolidar un nuevo mercado. Se exporta adems a

U.SA en los meses de inviemo.

El campo ubicado en el Fundo Corazn de Maria, tiene superficies y cultivos certificados

Limones : 180.000 kilos a Japn y U.S.A

11. a. 2.- Construccin e Inmobiliaria.

regalas presealadas y un porcentaje de acciones.

MINERA CHAAR BLANCO S.A.

Santiago a Supermercados ALMAC, Santa Isabel, EKONO, Multimarket y otros.

La venta internacional se realiza a travs de exportadoras como se seal anteriormente.

PAPAYAS : 2.500.000 kg.

La perspectiva de la empresa se bas en desarrollar una estrategia tecnolgica y con la finalidad de

ser mucho ms competitiva, sustituir la importacin de la materia y aumentar su produccin para

MINERA CHA~AR BLANCO S.A.

B.- EXPOSICiN DEL PROBLEMA.

86% para salmones y en un 57 % para truchas (Aquanoticias, a010. Junio-Julio 1998).

Los volmenes de produccin de salmn consideran una cantidad de pigmento utilizado en la

biomasa analizada y de los carotenoides encontrados ms de un 80% corresponde a astaxantina.

La innovacin se basa fundamentalmente en que se desarroll una tecnologia de cultivo y de

controlar las variables mejorando la calidad y, se estandariza el proceso y el producto.

fuente de pigmento, en la dieta de salmones, crustceos, truchas y peces omamentales. Estos

La implementacin de una planta industrial productora de harina de microalga pigmentada podria

necesidad de contratacin de organismos investigadores y de mano de obra para su puesta en

MINERA CHAAR BLANCO S.A.

'Determinar la calidad de la materia prima disponible y estandarizar la produccin final.

'Tipificar y di mencionar en forma ptima los biorreactores (sistema de cultivo).

'Determinacin de una tcnica de rompimiento celular para dejar biodisponible el pigmento.

C.1.- Desarrollo de Minera Chaar Blanco S.A.

La microalga Haematococcus pluvialis como materia prima para obtencin de astaxantina.

Dentro de los procesos productivos ms importantes para la obtencin de microelementos, el cultivo

astaxantina hasta en un 80% del total de los carotenoides.

Fase de desarrollo Total carotenoides Dimetro celular

Clula vegetativa (verde)

(macrozoosporas). Mas frecuentemente desarrollan un akineto, el cual tiene un dimetro tres o

por falta de nutrientes, bajas temperaturas, exceso de clonuros, etc.

Cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis.

MINERA CHAAR BLANCO SAo

concentracin de nitrato y nitrito, fosfatos y sulfatos.