I Curso sobre Bioindicacin en

EDARS de fango activo.

ESTUDIO DE:
CARACTERSTICAS MACRO- Y MICROSCPICAS,
BACTERIAS FILAMENTOSAS Y
MICROFAUNA DE UN FANGO ACTIVO.

Laura Isac, Eva Rodrguez y Natividad Fernndez

 ESTUDIO DE LAS CARACTERSTICAS MACRO- Y
MICROSCPICAS DE UN FANGO ACTIVO

Caractersticas macro- y microscpicas de un fango activo

1. Introduccin a la microbiologa en depuradoras de fangos activos
2. Evaluacin de las caractersticas macroscpicas y microscpicas de un
fango activo
2.1. Observacin macroscpica del fango activo
2.2. Observacin microscpica del fango activo
2.3. Preparacin de muestras para observacin microscpica
3. Relacin entre el estado estructural de un fango activo y los
rendimientos de depuracin en planta
Bacterias filamentosas en el fango activo
4. Estudio de las claves de identificacin de bacterias filamentosas:
principales caractersticas taxonmicas
5. Tcnicas de tincin de bacterias filamentosas
5.1. Tincin Gram (Mtodo Hcker modificado)
5.2. Tincin Neisser (Mtodo de Eikelboom y van Buijsen, 1981)
5.3. Procedimiento de observacin de muestras fijadas y teidas
6. Cuantificacin de bacterias filamentosas en una muestra
7. Protocolo para la identificacin de organismos filamentosos
Microfauna de un fango activo
8. Nociones bsicas en bioindicacin.
9. Conocimientos bsicos sobre Protistas.
10. ndice bitico de fangos (SBI, Sludge Biotic Index) o Mtodo
Madoni.
11. Instrucciones para la observacin microscpica.
12. Formatos de recogida de datos.
13. Bibliografa.

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Caractersticas macro- y microscpicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodrguez y N. Fernndez. 2
 Caractersticas macro- y microscpicas de un fango activo

1. Introduccin a la microbiologa en depuradoras de fangos activos.

Tradicionalmente, las observaciones microscpicas se han centrado en el

desarrollo de las tcnicas de bioindicacin, en las que los principales implicados son los
protozoos ciliados, importantes indicadores del desarrollo, eficiencia y nivel de
actividad del proceso de depuracin. Sin embargo, otro importante campo de
seguimiento de la marcha del proceso depurador es aquel que emplea tcnicas de
observacin microscpica dirigidas a evaluar las propiedades estructurales del flculo
de fango activo (Jimnez et al., 2001).
El flculo se define como un conglomerado de bacterias floculantes y bacterias
filamentosas sobre el que se agregan diminutas partculas minerales, polmeros
orgnicos e inorgnicos y excreciones metablicas, en un proceso de asociacin
facilitado por una matriz mucilaginosa que es aportada por la propia secrecin
microbiana (Figura 1). Es decir, las clulas microbianas producen sustancias
polimricas extracelulares, los EPS (extracellular polymeric substances), que permiten
la formacin del flculo al proporcionar una extensa superficie por unidad de volumen
para que los microorganismos se adhieran, facilitando la agregacin de las bacterias y
presentando tambin importantes implicaciones en las caractersticas de
sedimentabilidad del fango. En cualquier caso, la formacin de estos agregados o
flculos permite un hecho indispensable en el proceso de depuracin: el paso de los
contaminantes de la forma suspendida no sedimentable a la suspendida sedimentable,
circunstancia necesaria para que ocurra la separacin slido-lquido en el decantador
secundario.

Zoogloea sp.
Ciliado ssil

Figura 1. Flculo de fango activo (100x) en cuya estructura se observa al

organismo floculante Zoogloea sp., ampliado a 400x en el recuadro.

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 Algunos autores han sugerido que el flculo de fango activo presenta dos niveles
de estructura denominados microestructura y macroestructura (Jenkins et al., 1993).
La microestructura es el resultado de los procesos de adhesin microbiana, agregacin y
biofloculacin, constituyendo la base para la formacin del flculo. La macroestructura
est representada por los microorganismos filamentosos, que se agrupan formando un
armazn sobre el que se dispone la microestructura. La presencia de organismos
filamentosos en el flculo confiere una cierta consistencia que evita la rotura a causa de
la propia turbulencia en el tanque. Sin embargo, la presencia de filamentos condiciona
la morfologa del flculo. Es decir, el flculo de fango activo se desarrolla en la
direccin de crecimiento de las bacterias filamentosas, haciendo que predomine la
forma alargada sobre la forma esfrica propia de la microestructura, condicionando en
consecuencia las propiedades de sedimentabilidad. De hecho, los problemas de
decantabilidad en el clarificador se considera que son debidos a alteraciones en la
macro- o microestructura del flculo de fango activo (Jenkins et al., 1993).
En esta sesin terica abordaremos estos tres puntos claves en el estudio
microbiolgico de un fango activo:
- Caractersticas macro- y microscpicas,
- Bacterias filamentosas en el fango activo y
- Microfauna de un fango activo

2. Evaluacin de las caractersticas macroscpicas y microscpicas de un

fango activo.

2.1. Observacin macroscpica del fango activo.

La valoracin de las caractersticas macroscpicas del fango activado se realiza

principalmente a travs del ensayo de la V30, que determina la cantidad de fango
activado que decanta en una probeta o cono Imhoff, tras un periodo de 30 minutos. Este
ensayo es rutinario en todos los laboratorios de aguas residuales para obtener el ndice
de Mohlmann o ndice volumtrico de fangos (IVF), que bsicamente resulta de dividir
el valor obtenido en la V30 entre la concentracin de slidos en el reactor biolgico
(SSLM). El IVF se define como el volumen en mL ocupado por un gramo de slidos en
suspensin del licor mezcla e indica el grado de decantabilidad del fango. Valores
superiores a 300-400 mL/g, indican alteraciones en la sedimentabilidad del lecho de
fango de los decantadores secundarios.
En la sesin prctica comprobaremos que la V30 puede aportar informacin
adicional al volumen ocupado por el fango decantado, al valorar otros parmetros como
puedan ser la turbidez o los flculos en suspensin del clarificado. Se trata de analizar
las propiedades del proceso de decantacin y las caractersticas del clarificado.

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 Las caractersticas valoradas sobre este ensayo son:

Turbidez:
Alta: visibilidad clara a travs de la probeta
Media: situacin intermedia entre las categoras "alta" y "baja"
Baja: visibilidad muy baja a travs de la probeta
Flculos en suspensin:
Alta: abundancia de microflculos
Media: presencia de microflculos
Baja: prcticamente ausencia de microflculos
Sedimentabilidad:
Alta: la mayor parte del fango decanta en los 10 primeros minutos del ensayo
y el fango esta muy compactado
Media: la mayor parte del fango decanta entre 10-20 minutos y se observa un
ligero esponjamiento
Baja: la mayor parte del fango decanta despus de 20 minutos y se observa
un claro esponjamiento
Olor: caracterstica macroscpica del fango activado que se define como
correcto o incorrecto, indicando este ltimo situaciones como septicidad, presencia de
vertidos, etc.

2.2. Observacin microscpica del fango activo.

El informe biolgico de una muestra de fango activo est dirigido a aportar la

informacin necesaria sobre la calidad del fango, entendida sta como el compendio de
las caractersticas macroscpicas deducidas de la V30 (apartado anterior) y el conjunto
de caractersticas microscpicas recogidas durante la observacin al microscopio
ptico (presente apartado).
Tales caractersticas microscpicas se refieren al examen del estado morfolgico
y estructural del flculo de fango activo (forma, tamao, estructura, textura, cobertura,
etc.) y al examen del componente bitico del "ecosistema fango activo", representado
por las poblaciones de bacterias filamentosas y de protozoos (principalmente ciliados).
La evaluacin de estas caractersticas proporciona informacin sobre las
propiedades de decantacin y compactacin del fango activo durante la fase de
clarificacin del licor mezcla, as como del nivel y estado de colonizacin de la
microfauna, aludiendo, indirectamente, al grado de actividad biolgica del proceso de
depuracin.

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 Los parmetros caracterizados a nivel microscpico son:

Forma: caracterstica que define la morfologa externa del flculo como regular
si aparece de forma redondeada e irregular si difiere de esta configuracin.
Tamao:
Pequeo: tamao menor de 150 m
Medio: tamao entre 150 y 500 m
Grande: tamao mayor de 500 m
Estructura:
Compacto: no existen prcticamente huecos en la estructura interna del
flculo
Medio: se detectan algunos huecos
Abierta: existen bastantes huecos dentro del flculo que rompen la unidad
interna
Textura: caracterstica que alude al grado de cohesin entre las partculas que
forman el flculo, establecindose las categoras fuerte y dbil en funcin a la
ausencia o presencia de disgregacin de los flculos, respectivamente, tras puncin
sobre el cubreobjetos.
Cobertura: caracterstica que valora si la unin de todos los flculos presentes
en el ocular de 10X cubren menos del 10% de su superficie, del 10-50% o ms del 50%.
Filamentos en el flculo:
Menos de 5 filamentos por flculo
Entre 5-20 filamentos por flculo
Ms de 20 filamentos por flculo
Filamentos en disolucin: caracterstica que cuantifica la existencia de
filamentos libres entre los espacios interfloculares del licor mezcla. Si no son
observables ser baja, mientras que si se observan normalmente ser alta.
Diversidad de protozoos:
Menos de 4 especies
De 4-7 especies
Ms de 7 especies
Otras observaciones: presencia/ausencia de crecimiento disperso,
presencia/ausencia de fibras orgnicas, presencia/ausencia de partculas inorgnicas,
presencia/ausencia de bacterias helicoidales, presencia/ausencia de Zoogloea sp., etc.

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2.3. Preparacin de muestras para observacin microscpica:

Observacin microscpica de una muestra de fango activado a diferentes

aumentos (100x, 400x y 1.000x), empleando los dispositivos de contraste de fases y la
iluminacin en campo claro. Las observaciones a realizar se efectuarn sobre muestras
in vivo.
1. Agitar con suavidad la muestra para homogeneizar.
2. Tomar una gota con pipeta Pateur de boca ancha o entre 25 y 50 L con una
micropipeta y depositarlos en un portaobjetos (previamente limpiado y desengrasado).
3. Colocar encima de la gota un cubreobjetos.
4. Proceder al anlisis microscpico de la preparacin utilizando los distintos
objetivos. El de 100x u objetivo de inmersin emplea aceite y se utiliza para observar
estructuras en detalle.
5. Observar, al menos, 2-3 preparaciones de la muestra.
6. Se recomienda, como complemento, el anlisis de los MLSS, V30 e IVF.
Para observar la muestra sin alterar la estructura flocular y la disposicin del
entramado filamentoso, seguir el procedimiento anterior.
Para inmovilizar organismos y observar estructuras visibles sin necesidad de
tincin, colocar el cubreobjetos y prensar suavemente. Especialmente indicado para la
observacin cualitativa de protozoos ciliados.

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3. Relacin entre el estado estructural de un fango activo y los
rendimientos de depuracin en planta.

INTRODUCCIN.
El agua se cuenta como uno de los recursos ms preciados en el mundo, cuya
conservacin debe implicarnos a todos. En la legislacin medioambiental, un punto
importantsimo es el control de los vertidos de las zonas con riesgo de eutrofia. La
Urban Waste Water Treatment (organismo incluido en el Instituto Europeo de Polica
Ambiental, IEEP) ha clasificado todas las reas sensibles de los Estados miembros con
riesgo de eutrofia que necesitan la eliminacin de nitrgeno y fsforo (Mainstone y
Parr, 2002), siendo las aglomeraciones urbanas, los usos agrcolas y la deforestacin los
principales causantes de este fenmeno.
La descomposicin y el reciclado de la materia orgnica presentan
comportamientos semejantes en toda clase de sistemas. Sin embargo, factores
ambientales que han operado raramente y que no han sido internalizados por la
evolucin (metales pesados, plaguicidas, etc.) coinciden frecuentemente con la
contaminacin orgnica y complican la dinmica de los respectivos ecosistemas
(Margalef, 1983).
Los vertidos incontrolados pueden provocar el desarrollo masivo de algas, lo
que genera proliferaciones de organismos oportunistas que degradan el sistema.
Cambios en la comunidad vegetal, a su vez, pueden ser causa de severos dficits de
oxgeno disuelto que resultan mortales para los organismos ms sensibles (Mainstone y
Parr, 2002). Esta situacin provoca problemas colaterales como pueden ser los malos
olores y el deterioro sanitario y paisajstico de las aguas.
Desgraciadamente, la eutrofizacin de muchas zonas acucolas es patente,
presentando aumentos en los niveles de nutrientes consecuencia de la descarga de
aguas residuales (Stapleton et al., 2000). Esta situacin se est solventando con las
medidas legislativas recogidas en la Directiva 271/91 y con su incorporacin en Espaa
mediante el RDL 11/1995 y RD 509/1996 (Tabla I).
De hecho, en algunos estados de Europa dnde las medidas de saneamiento
empezaron a implantarse en los aos setenta, se ha producido la recuperacin de la
calidad fsico-qumica de las aguas (Prat, 1997).
Si tenemos en cuenta los datos aportados por el Ministerio de Medio Ambiente
(2001) sobre la depuracin, Andaluca presenta una poblacin equivalente de
13.694.385 con un porcentaje de depuracin correcto del 37 %, un 20 % en construccin
y un 43 % no depurado.
Las inversiones realizadas en Andaluca gracias a la financiacin en un 80 % de
los Fondos de Cohesin Europeos de las Obras de Saneamiento y Depuracin de aguas
residuales en ncleos de la red de Espacios Naturales de la Comunidad Autonmica de
Andaluca, asciende a 25.993.431 euros (Leal et al., 2002).
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Tabla I. Lmites de vertidos (limitaciones de nutrientes en zonas sensibles cuyas aguas sean eutrficas o
tengan tendencia a serlo en un futuro prximo).

PARMETRO CONCENTRACIN % RED. MNIMO

DBO5 25 mg/L 70-90%
DQO 125 mg/L 75%

35 mg/L (>10.000 h-eq)

SS 90%
60 mg/L (20.000-10.000 h-eq)

2 mg P/L (10.000-100.000 h-eq)

FSFORO TOTAL 80%
1 mg P/L (>100.000 h-eq)
15 mg N/L (10.000-100.000 h-eq)
NITRGENO TOTAL 70-80%
10 mg N/L (>100.000 h-eq)

Esta favorable evolucin choca en muchas ocasiones con procesos de

depuracin inadecuados en muchas ciudades, supeditados a las condiciones socio-
econmicas, niveles de vida y rentas per cpita imperantes (Leal et al., 2002), que no
permiten a los municipios el mantenimiento de la E.D.A.R. tras su puesta en marcha. Si
a esto le aadimos que durante los meses de verano en muchos lugares de la costa
mediterrnea el flujo de los ros consiste esencialmente en agua residual tratada o no
(Angelakis et al., 1999), es obvia la necesidad de una gestin ptima, en la que el
balance entre costes de mantenimiento y vertido depurado sea el menor posible.
Por ello es necesario disponer de medidas de control complementarias a los
parmetros fsico-qumicos. Estas medidas, en parte, podran estar representadas por el
control de la formacin flocular en el reactor biolgico, el cual aporta informacin
adicional sobre el proceso y permite con personal tcnico especializado controlar varias
estaciones depuradoras de fangos activos con una dotacin extra de laboratorio escasa
(microscopio ptico y material de tinciones). Sin embargo y como contrapartida, los
estudios de formacin flocular del fango activo requieren tiempo, personal
especializado y una ardua tarea de identificacin y anlisis de los resultados que
normalmente no estn al alcance de todos los laboratorios.
En este trabajo, se plantea la posibilidad de realizar un estudio simplificado del
fango activo que genere, en funcin de las caractersticas macroscpicas y
microscpicas de ste, un valor de ndice de fango que est directamente relacionado
con los porcentajes de reduccin de SS, DQO, DBO, Nitrgeno y Fsforo en la E.D.A.R.
Tal ndice de fango (IF), adems, proporciona la posibilidad de obtener un histrico de
valores de calidad biolgica de forma rpida, comparable y protocolo sencillo.
Este sistema de anlisis, cuyo resultado final es la evaluacin de la calidad de
un fango biolgico, en el desarrollo de su metodologa ha tomado como base
informacin especializada, de la que se destacara el " Manual de Laboratorio para el
anlisis de las aguas residuales y lodos de depuracin (Departamento de Agua y
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Saneamiento del Ayuntamiento de Madrid, 1997). A partir de la puntuacin de una
serie de caractersticas macroscpicas del fango (observables a travs de la V30) y
microscpicas (observables a travs de un objetivo de 10X), se obtiene un valor final
comprendido entre 0-100 con el que quedara definida la calidad de dicha suspensin
biolgica. Este valor se denomina ndice de Fango (IF) (Jimnez et al., 2001).

DESARROLLO INVESTIGADOR DEL NDICE DE FANGO Y RESULTADOS

La seleccin de los parmetros que definen y valoran las caractersticas del

fango activo, constituy uno de los pasos previos en la elaboracin del ndice. A
continuacin, se estableci un periodo de contraste de resultados de algo ms de un
ao, en el que se estudiarn diversas muestras de fangos activos de toda Andaluca, lo
que permiti someter a estudio el ndice elaborado as como la unificacin de criterios
para los componentes del grupo de trabajo, requisitos indispensables para la obtencin
de resultados representativos del estado del sistema, a la vez que comparables.
Los parmetros seleccionados para constituir el IF, denominados caractersticas
macro y microscpicas, se encuentran recogidos en la Tabla II junto con las distintas
variantes con las que dichas caractersticas quedaron definidas. Como caractersticas
macroscpicas se entienden aquellas observables a simple vista, extradas del aspecto
del fango activado y del clarificado de la V30. Como caractersticas microscpicas se
definen aquellas otras observables a travs del microscopio bajo un objetivo de 10x.
Respecto a estas ltimas, aclarar que las observaciones deben realizarse al menos por
duplicado y con la muestra viva (sin teir). sta, que ha de ser lo ms fresca posible, es
conveniente agitarla con suavidad previamente, para homogenizar evitando la rotura
de los flculos. Las identificaciones bacterianas se han realizado en base al manual
Microorganismos filamentosos en el fango activo (EMASESA, 1997) y apoyadas en
distintos artculos que tratan el tema (Eikelboom, 1975 y 1977; Rozhich, 1982; Surez,
1993; Laboratorio Central del Dep. de Saneamiento del Ayto de Madrid, 1996; Moro,
1998).

La suma de puntuaciones para ambos grupos de caractersticas se traduce en

un valor final de ndice de fango del que se definen cinco categoras, cada una de las
cuales alude a una calidad distinta del fango (Tabla III). Mientras que las caractersticas
macroscpicas presentan como valor mximo de puntuacin 30 unidades sobre el valor
del IF, las microscpicas presentan un mximo de puntuacin de 70 puntos, al
considerarse que son stas las que definen con mayor exactitud el IF.

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 Tabla II. Valoracin del IF.

CARACTERSTICAS MACROSCPICAS
Turbidez Alta 0
Media 4,5
Baja 9
Flculos en suspensin Alta 0
Media 4,5
Baja 9
Sedimentabilidad Alta 9
Media 4,5
Baja 0
Olor Agradable 3
Desagradable 0
CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
Forma Regular 4
Irregular 0
Tamao Grande 4
Medio 7
Pequeo 0
Estructura Compacta 18
Media 9
Abierta 0
Textura Fuerte 4
Dbil 0
Cobertura < 10% 0
10-50% 7
>50% 3,5
Filamentos en flculos >20 0
5-20 7
<5 14
Filamentos en disolucin Alta 0
Baja 3
Diversidad de Protozoos >7 especies 13
4-7 especies 7
<4 especies 0
NDICE DE FANGO TOTAL

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 Tabla III. Categoras de IF.
NDICE DE FANGOS:
0-19 psimo
20-39 malo
40-59 regular
60-79 bueno
80-100 ptimo

De los estudios realizados en distintas EDAR se obtuvieron distintos resultados

de IF que se relacionaron con los porcentajes de reduccin de SS, DQO, DBO, N y P.
Los anlisis de estos ltimos se realizaron segn los Mtodos Normalizados (APHA,
AWWA y WPCF, 1992).
Del periodo de estudio se obtuvieron 109 datos, los cuales aparecen reflejados
en la Tabla IV, y a los que se realiz un anlisis estadstico de correlaciones. En tal
estudio se pretenda buscar una posible relacin entre el valor del IF y los parmetros
que definen tanto el influente como la calidad del efluente (SS, DQO, DBO, N y P).

Tabla IV. Relacin de datos obtenidos en el estudio de cada uno de los participantes.
Total datos
Participante 1 10
Participante 2 38
Participante 3 13
Participante 4 19
Participante 5 29

El anlisis de los datos demostr la ausencia de una relacin directa entre el

ndice de fango y los SS, DQO, DBO, N y P tanto del agua de entrada como de salida.
Sin embargo, cuando los datos fueron agrupados segn la categora de IF, se encontr,
tal y como se muestra en la Figura 1, una relacin directa entre los porcentajes de
reduccin de SS y DQO respecto al IF, si bien esta relacin es ms clara para el caso de
los slidos en suspensin que para la DQO. Como se observa en esta misma figura, la
relacin establecida entre la DBO y el ndice de fango no es del todo clara, al no
detectarse diferencias significativas entre los porcentajes de reduccin una vez que los
ndices de fango superan la calidad psima. No se ha encontrado explicacin a esta
falta de proporcionalidad entre la calidad del fango estimada mediante el IF y el
porcentaje de reduccin de DBO. No obstante, la extrema variabilidad y escasa
reproducibilidad de esta determinacin (APHA, AWWA y WPCF, 1992), junto con la
inferioridad de datos aportados respecto a los SS y DQO, son razones suficientes para
que este resultado sea tomado con precaucin.

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 Reflexiones similares se pueden hacer con respecto a los datos de reduccin de
Nitrgeno y Fsforo (Figura 2), en los que los resultados obtenidos estn adscritos a
tres categoras de fango (malo, regular y bueno). Por lo tanto, si bien la
tendencia es a una mejora gradual de los porcentajes de reduccin de ambos nutrientes
frente al aumento de puntuacin del ndice, las diferencias ms claras se encuentran
entre la categora malo y el resto. Estos resultados, por tanto, habran de ser tomados
con reservas, ya que parece conveniente ampliar el banco de datos antes de determinar
la tendencia ms clara posible.

CONCLUSIONES

El parmetro IF ha resultado ser un buen sistema de control rpido con el que

obtener un ndice de formacin flocular, orientativo del estado del cultivo biolgico,
que nos aproxima a los rendimientos de depuracin en las E.D.A.R.s de fangos activos.
En general, podemos definir el ndice de Fango (IF) como un parmetro indicador del
estado de floculacin en el reactor biolgico, que nos aporta informacin para
modificar las condiciones del cultivo y de esta forma mejorar la eficacia de la reduccin
de la DQO y los SS en las E.D.A.R.s, tomndose con reserva las relaciones que
mantiene con la DBO, Nitrgeno y Fsforo. Una observacin general del fango
activado que puede durar unos veinte minutos, nos proporcionar idea del estado de
ste y de la respuesta esperable de la E.D.A.R. convencional.

100

95
% Reduccin SS, DQO y DBO

90

85

80
SS
75 DQO
DBO
70
20-40 40-60 60-80 80-100
Rango de IF

Figura 1. Relacin entre el rango de IF y el porcentaje de

reduccin de SS (n = 109), DQO (n = 109) y DBO (n =67).

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 45
40
35
30

% Reduccin N y P
25
20
15
P
10
N
5
0
20-40 40-60 60-80
Rango de IF
Figura 2. Relacin entre el rango de IF y el porcentaje de
reduccin de nitrgeno y fsforo (n=67).

Es necesario aumentar el nmero de datos y proseguir con el estudio antes de

poder definir claramente al IF respecto a los porcentajes de reduccin de DBO, N y P,
como un recurso para optimizar la reduccin de la emisin de nutrientes y materia
orgnica al cauce receptor.
El IF es un complemento analtico aplicable a plantas depuradoras de fangos
activos de grandes ncleos de poblacin, en las que a travs de la observacin del
estado de floculacin se podr valorar la calidad del proceso de depuracin, entendida
sta como rendimientos depuradores. En plantas pequeas se presenta como un
sistema idneo, dnde con reducidos costes un mismo especialista puede controlar las
condiciones de explotacin de varias E.D.A.R.s. Si a esto ltimo aadimos que muchas
de estas plantas pequeas se encuentran localizadas en zonas sensibles (Oron et al.,
2002), la aplicacin del IF como parmetro complementario sera muy deseable.
La valoracin del estado de floculacin de la materia orgnica permite tomar
medidas encaminadas a la mejora de este proceso para as obtener buenos clarificados
y reducir de esta forma la emisin de contaminantes. En determinadas situaciones,
alteraciones en la lnea de fango producen reboses a cabecera spticos que generan una
microfauna especializada para el metabolismo del azufre. Esta microfauna est
normalmente asociada a alteraciones en la decantabilidad de los fangos y por lo tanto a
la fuga de slidos al cauce receptor, lo que lleva aparejado el escape de organismos
(Bodo spp., Cercobodo spp., Sphaerotilus spp., Thiotrix spp....) que llegan al medio
acucola desarrollndose y alterando el ecosistema.
Por otra parte, es sabido que una gran proporcin de la estructura del flculo
de fango activo est compuesta por polmeros extracelulares (EPS, extracellular
exopolymers), los cuales son considerados como los principales responsables de la
adhesin de las clulas microbianas a la estructura flocular y de la cohesin del
conjunto. Las propiedades adsorbentes de los EPS han sido bien documentadas por
distintos autores en trminos de bioadsorcin de contaminantes y txicos (iones
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metlicos, por ejemplo). Sin embargo, el papel de los EPS en la eliminacin biolgica de
nutrientes como el nitrgeno o el fsforo no ha sido abordado hasta muy recientemente
debido a la falta de herramientas adecuadas. Cloete y Oosthuizen (2001) haciendo uso
del anlisis mediante EDS (Energy Dispersive Spectrometry) y microanlisis con rayos X,
han estimado que la proporcin de fsforo en los cmulos bacterianos de una muestra
de fango activo procedente de una planta en la que existe eliminacin biolgica de
fsforo, es de un 57-59% del total. Estos mismos autores encontraron que los EPS
aislados de muestras biolgicas de igual procedencia, retuvieron, por s solos, entre el
27-30% del total del fsforo estimado. Estos resultados sugieren que la eliminacin de
fsforo en el fango activo podra ser debida no slo a los organismos acumuladores de
fosfato, sino tambin al EPS como reservorio de este elemento. Con esta explicacin, lo
que quiere significarse es que la deteccin precoz mediante el IF de alteraciones en el
estado de floculacin, evitar en buena proporcin no slo la liberacin de slidos con
el efluente, sino tambin de nutrientes a los cauces receptores.
En definitiva, el IF se establece como un sistema prctico del control de la
formacin flocular en la E.D.A.R. y como un til complemento en la determinacin de
las condiciones de explotacin, repercutiendo positivamente sobre el medio ambiente.

BIBLIOGRAFA

Angelakis, A., Marecos do Monte, M. H. F., Bontoux, L., Asano, T. (1999). The status of wastewater reuse
practice in the Mediterranean basin: need for guidelines. Wat. Res. 33, 10, 2201-2217.

APHA, AWWA, WPCF (1992). Mtodos Normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales. Ed. Daz de
Santos, Madrid.

Cloete, T. E. y Oosthuizen, D. J. (2001). The role of extracellular exopolymers in the renoval of phosphorus
from activated sludge. Wat. Res. 35, 15, 3595-3598.

Departamento de Agua y Saneamiento del Ayuntamiento de Madrid (1997). Manual de laboratorio para el
anlisis de aguas residuales y lodos de depuracin. Publicacin del Exmo. Ayuntamiento de Madrid.

EMASESA, Departamento de Aguas Residuales (1997). Microorganismos filamentosos en el fango activo.

Publicacin de la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla, S.A.
(EMASESA).

Eikelboom, D. H. (1975). Filamentous organisms observed in activated sludge. Wat. Res. 9, 365-388.

Eikelboom, D. H. (1977). Identification of filamentous organisms in bulking activated sludge. Wat. Tech. 8.

Leal, A., Vias, L., Lpez, A. J., Navarro, M. y Martnez, M. (2002). Depuracin de aguas residuales en
espacios naturales protegidos de Andaluca. Junta de Andaluca. Consejera de Medio Ambiente.

Mainstone, C. y Parr, W. (2002). Phosphorus in rivers. Ecology and management. The Science of the total
Environment 282-283, 25-47.

Margalef, R. (1983). Limnologa. Ed. Omega. Barcelona.

Moro, P. (1998). Aparicin de organismos filamentosos en fangos activos. Ingeniera Qumica, Junio 1998,
97-106.
I CURSO SOBRE BIOINDICACIN EN EDARS DE FANGOS ACTIVOS

Caractersticas macro- y microscpicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodrguez y N. Fernndez. 15
Oron, G., Bicj, A. y Gillerman, L. (2002). Trends and opportunities for small-scale wastewater treatment
and reclamation plants in the Eastern Mediterranean Basin. Libro de ponencias principales del Congreso
Internacional de Tecnologas de Pequea Escala para la Depuracin y Gestin de aguas residuales en el mbito
Mediterrneo, 113-130. Sevilla, 20-22 de marzo, 2002.

Prat Fornells, N. (1997). Estado ecolgico de los ecosistemas acuticos en Espaa.

www.us.es/ciberico/narcisprat.pdf

Rozhich, F. (1982). Control of algal filamentous bulking at the southerly wastewater treatment plant.
Journal W.P.C.F. 54, 3.

Stapleton, C. M., Kay, D., Jackson, G. F. y Wyer, M. D. (2000). Estimated inorganic nutrient inputs to the
coastal waters of Jersey from catchment and waste water sources. Wat. Res. 34, 3, 787-796.

Surez, J., Llorente, V. y Mogolln, T. (1993). Microorganismos filamentosos en las E.D.A.R.s. Ingeniera
Qumica, Enero 1993, 146-151.

AUTORES:
Grupo Bioindicacin Sevilla
www.grupobioindicacionsevilla.com

DOCUMENTACIN DISPONIBLE EN:

http://www.ecoportal.net/content/view/full/32380

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 Bacterias filamentosas en el fango activo

4. Estudio de las claves de identificacin de bacterias filamentosas:

Principales caractersticas taxonmicas en bacterias filamentosas.

Crecimiento epiftico: consiste en el crecimiento de clulas bacterianas sobre la

superficie del filamento estudiado, utilizndolo como sustrato o soporte. Este tipo de
crecimiento suele darse sobre bacterias filamentosas que poseen vaina o cubierta y
normalmente ocurre de forma perpendicular al filamento utilizado como soporte.

Crecimiento epiftico abundante

Crecimiento epiftico moderado

Ausencia de crecimiento epiftico

Septos celulares: son los tabiques o separaciones que en algunas ocasiones son
observables entre las clulas contiguas del filamento. En otras ocasiones existen pero no
son observables con microscopa ptica.

SEPTOS CELULARES VISIBLES SEPTOS CELULARES NO VISIBLES

Constricciones celulares: implican la posibilidad de observar los septos celulares en el

filamento. Consiste en una discontinuidad en los bordes del filamento, coincidiendo con
los septos celulares.

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Vaina o cubierta: es una estructura tubular que acta como revestimiento del filamento
y del conjunto de clulas individuales que lo constituyen. La presencia o ausencia de
esta estructura puede observarse mediante la tincin especfica de vainas. Sin embargo,
en algunas ocasiones, la prdida de algunas clulas en el filamento pone de manifiesto
la presencia de vaina. El crecimiento epiftico abundante tambin es indicativo de la
presencia de vaina.

Vaina

Rosetas: algunas bacterias filamentosas (Thiothrix spp. y Tipo 021N) presentan la

capacidad de asociarse en estructuras llamadas rosetas, en las que se encuentran
agrupadas y unidas por sus clulas basales, radiando hacia el exterior desde un punto
comn.

Gonidios: son clulas ovales o bacilares localizadas en el extremo del filamento. La

morfologa de estas clulas se diferencia de las restantes. Se piensa que podran estar
relacionadas con la reproduccin del filamento.

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Ramificaciones: se entiende como ramificacin verdadera a la continuidad
citoplasmtica presente en los tricomas que se disponen formando una ramificacin.
Ramificacin falsa es aquella en la que no existe continuidad citoplasmtica, tan slo
una superposicin de tricomas a la altura media del filamento.

RAMIFICACIN FALSA
RAMIFICACIN VERDADERA

Morfologa del tricoma:

TRICOMA ENRROLLADO CADENA LIBRE DE CLULAS

TRICOMA RECTO, LIGERAMENTE CURVO

Morfologa celular:

ESFRICA, COCO-BACILAR

BACILAR

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En la siguiente tabla se presenta un resumen de las principales caractersticas
observables mediante microscopa ptica, empleadas en la identificacin de bacterias
filamentosas de un fango (Tabla 1).

Tabla 1. Caractersticas morfolgicas y reactiva a tinciones de bacterias filamentosas.

PRINCIPALES CARACTERSTICAS MORFOLGICAS Y REACTIVA A

TINCIONES EN BACTERIAS FILAMENTOSAS DEL FANGO ACTIVO

PRESENCIA DE RAMIFICACIN S, verdadera No

S, falsa

COLORACIN IN VIVO DEL Transparente, medio, oscuro

FILAMENTO
MORFOLOGA DEL Recto, ligeramente curvo, tricoma torcido, cadena
FILAMENTO (TRICOMA) irregular de clulas, tricoma enrrollado, tricoma
ramificado (micelial)
PRESENCIA DE VAINA Si No
LOCALIZACIN DEL TRICOMA Libre, extendindose del floculo, interior, todos sitios

CRECIMIENTO EPIFTICO Si No
MORFOLOGA CELULAR Cuadrada, oval, rectangular, bacilar, discoidal, tonel,
cocos
SEPTOS CELULARES VISIBLES Si No
CONSTRICCIONES EN LOS Si No
SEPTOS CELULARES
INCLUSIONES CELULARES: Si No
GRNULOS DE S (in situ)
INCLUSIONES CELULARES: Si No
GRNULOS DE S (in situ)

INCLUSIONES CELULARES: Si No
GRNULOS DE S (S-test)
INCLUSIONES CELULARES: Si No
GRNULOS DE PHB
REACCIN A GRAM Gram + Gram -
REACCIN A NEISSER Neisser +/- y grnulo Neisser +

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5. Tcnicas de tincin de bacterias filamentosas.

Las tinciones que se exponen a continuacin requieren de la preparacin de

frotis fijos en portaobjetos, en los que la muestra se ha distribuido homogneamente
dejndola caer cuidadosamente en forma de gotas sobre un portaobjetos. Una vez secos
y sin necesidad de fijar a la llama, los frotis son sometidos al protocolo que determine la
tincin.

5.1. Tincin Gram. Mtodo Hcker modificado (En: Jenkins et al., 1993).

Se trata de una tcnica de tincin diferencial que permite distinguir entre

bacterias Gram + y Gram -, en funcin del grado de permeabilidad de las paredes
celulares al disolvente aplicado durante la tincin. Los filamentos Gram + se observarn
de color azul y los Gram - de color rosado.

Reactivos
Solucin I (A+B)
Las soluciones A y B se mezclan en el momento de ser utilizadas y se desechan
a las 24 h. Por separado, la duracin mxima de cada una es de un mes.
A. Solucin de cristal violeta: 20 mL de cristal violeta al 10% (p/v) en etanol
95% (v/v).
B. Oxalato amnico: 80 mL de oxalato amnico al 1% (p/v) en agua destilada.
Solucin II
Preservar esta solucin de la luz y desecharla al mes.
Tomar 1 g de iodo y 2 g de ioduro potsico y enrasar hasta 300 mL con agua
destilada.
Solucin III
Solucin de safranina: 10 mL de safranina al 2,5% (p/v) en etanol 95% (v/v),
mezclados con 100 mL de agua destilada.

Procedimiento
Teir durante 1 min con la Solucin I y aclarar con agua destilada, goteando, en
ambos casos, desde un extremo del portaobjetos hacia el otro. Aplicar durante 1 min la
Solucin II y lavar con agua destilada. Decolorar con etanol 95% gota a gota durante
20-25 s y lavar posteriormente. Teir durante 1 min con la Solucin III, lavar y eliminar
el exceso de agua con papel secante. Dejar secar y observar bajo objetivo 100x y campo
claro.

Gram -

Gram +

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5.2. Tincin Neisser. Mtodo de Eikelboom y van Buijsen, 1981 (En: Jenkins
et al., 1993).

Esta tincin pone de manifiesto la presencia de grnulos de reserva de

polifosfato en el interior celular, observados con color negro-azulado. El azul de
metileno es catinico y se une a los sitios aninicos de las cadenas de polmeros de
polifosfato. En el caso de que todo el tricoma presente la coloracin azulada, se
considerar Neisser +. Si por el contrario el tricoma filamentoso presenta color marrn
claro y ausencia de grnulos, se considerar Neisser -. Si el tricoma es Neisser con
presencia de grnulos, ser grnulo Neisser +.

Reactivos
Solucin I (A+B)
Desechar al mes de ser preparada. Conservar A y B por separado.
A. Mezclar 0,2 g de azul de metileno con 10 mL de etanol 95% (v/v), 10 mL de
cido actico glacial y 100 mL de agua destilada.
B. Mezclar 3,3 mL de cristal violeta al 10% (p/v) en etanol 95% (v/v), con 6,7
mL de etanol 95% y 100 mL de agua destilada.
Solucin II
Tomar 33,3 mL de una solucin de marrn de Bismark al 1% (p/v) en solucin
acuosa y enrasar hasta 100 mL con agua destilada.

Procedimiento
Teir durante 30 s con la Solucin I y lavar con agua destilada. Teir durante 1
min con la Solucin II, aclarar y escurrir el exceso de agua. Dejar secar y observar al
microscopio ptico con el objetivo de 100x en campo claro.

Neisser +
Neisser -

5.3. Procedimiento de observacin de muestras fijadas y teidas (frotis fijos).

La respuesta de los organismos filamentosos a las Tinciones Gram, Neisser, PHB,

etc., realizadas sobre frotis fijos de fango activo permiten, junto con las caractersticas
morfolgicas y estructurales deducidas de la observacin in vivo, su identificacin. Para
la observacin de una muestra fijada y teida:
1. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el frotis, perfectamente seco,
que ha sido teido segn el protocolo convenido.
2. Seleccionar el objetivo de inmersin o 100X y proceder a la observacin.
3. Una vez concluido el anlisis microscpico, retirar el objetivo con cuidado y
limpiarlo con un pao suave impregnado en la solucin ter-etanol 3:1.
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6. Cuantificacin de bacterias filamentosas.

Un procedimiento til y de aplicacin sencilla en la cuantificacin de bacterias

filamentosas es el mtodo cualitativo presentado en Jenkins et al. (1993), basado en la
valoracin del analista que, tras sucesivas observaciones y una vez adquirida una cierta
prctica, establece su propio criterio de abundancia de los organismos filamentosos
presentes en una suspensin biolgica (Tabla 2).

Tabla 2. Estimacin cualitativa de la abundancia de bacterias filamentosas.

VALORACIN DE FILAMENTOS EN FUNCIN DE LA ABUNDANCIA RELATIVA

VALOR ABUNDANCIA SIGNIFICADO

NUMRICO
0 Ninguno

1 Pocos Hay filamentos pero se observan slo en algunos flculos

2 Alguno Se ven filamentos en los flculos, pero no en todos ellos

3 Comunes Se observan filamentos en todos los flculos pero en pequea

4 Muy comunes
5 Abundantes
6 Excesivos
cantidad (1-5 filamentos por flculo)
Se observan filamentos en todos los flculos, pero con una
densidad media (5-20 por flculo)
Hay filamentos en todos los flculos y con densidad alta
(>20/flculo)
Filamentos presentes en todos los flculos; hay ms filamentos que
flculos

Otros mtodos tienen su base en el cmputo de intersecciones de los filamentos

presentes en la suspensin biolgica con la cuadrcula de una cmara de recuento, el
contorno del ocular o del monitor de televisin conectado al microscopio, etc. Este es el
planteamiento de autores como Pipes, 1979 (En: Jenkins et al., 1993) o Arniz et al.
(2000), quienes emplearon la cmara de recuento Neubauer.

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 7. Protocolo para la identificacin de organismos filamentosos.

MUESTRA N:
LOCALIZACIN DE LA MUESTRA:
FECHA:
OBSERVACIONES:

CARACTERSTICAS
FSICO-QUMICAS
SSLM (mg/L)
SSVLM (mg/L)
V30 (mL/L)
IVF (mL/g)
FILAMENTO 1 2 3 4 5
Reaccin a Gram
Reaccin a Neisser (tricoma)
Reaccin a Neisser (grnulos)
Reaccin PHB
Grnulos de S in vivo
Grnulos de S (S-test)
Vaina
Morfologa celular
Septos celulares
Constricciones en los septos
celulares
Tamao celular (ancho/largo en
m)
Morfologa del tricoma
Crecimiento epiftico
Localizacin del filamento
Dimensiones del tricoma
(ancho/largo en m)
Otras observaciones (gonidos,
rosetas)
IDENTIFICACIN
ABUNDANCIA
EFECTO SOBRE EL FLCULO
OTRAS OBSERVACIONES
(FILAMENTOS EN
DISOLUCIN)

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