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TEORA CELULAR

ORIGEN Y EVOLUCIN DE LA CLULA


Cuando an no exista el microscopio se crea que los seres vivos estaban constitudos por una sustancia especial que slo ellos
podan elaborar y que tena diferente consistencia en los distintos tejidos. En 1665 Robert Hooke observ por primera vez celdillas en el
corcho. El corcho es un tejido muerto cuyas clulas han muerto porque la pared se ha impregnado de sber (corcho) y el citoplasma se ha
reabsorbido. Les llam a esas estructuras celdillas (cells).
En 1835 Schleiden y Schwann emitieron la teora celular, segn la cual todos los seres vivos, animales y vegetales, estaban
constitudos por clulas, es decir, las clulas son las unidades morfolgicas y fisiolgicas de los seres vivos. En 1859 Wirchow propone
que cada clula proviene de otra clula "Omnis cellula e cellula" y sugiere que todas las enfermedades son alteraciones de las clulas.
Como la membrana plasmtica no es visible al microscopio ptico, durante mucho tiempo persisti la Teora del reticularismo en los
animales: "Un animal es una comunidad de citoplasmas y nucleo sin compartimentar". Ms tarde la Teora del reticularismo qued
restringida al sistema nervioso hasta que Ramn y Cajal demostr que tambin el tejido estaba formado por clulas individuales. Hoy en
da salvo algunas excepciones se admite el individualismo celular.

La teora celular, emitida por Schleiden y Schwann expresa que todos los seres vivos
a excepcin de los virus estn formados por clulas. Las formas ms simples de vida son
las clulas libres que se reproducen multiplicndose (o dividindose) por dos. Algunas de
ellas son procariotas (sin verdadero ncleo). Los organismos superiores estn formados por
un gran nmero de clulas que realizan funciones especializadas y que se comunican
mediante sistemas muy complejos. Se cree que todos los organismos celulares descienden
de una clula ancestral (primaria) comn. A partir de ah han evolucionado todos los seres
vivos. La evolucin implica 2 procesos esenciales:
* La aparicin de una variacin producida por el azar de una informacin gentica
que se transmita de un individuo a sus descendientes.
* Que se seleccione esa informacin gentica porque es beneficiosa para su portador.
Si tenemos en cuenta los orgenes de la primera clula en la tierra, tenemos que
estudiar cmo se replican ciertos tipos de grandes molculas (como los cidos nucleicos),
replicacin que permita que haya una variante en la informacin gentica y por lo tanto que
se seleccione una o otra variante de esa informacin gentica.

DESDE LAS MOLCULAS A LAS PRIMERAS CLULAS


Se supone que la tierra en sus orgenes era un lugar violento con gran cantidad de
erupciones volcnicas, lluvias torrenciales, no haba oxgeno molecular, no exista la capa
de ozono y se supone que la tierra estaba formada por amonaco y metano. Es probable que
en esas condiciones se produjeran molculas orgnicas, es decir, molculas ricas en
carbono. En experimentos de Laboratorio se ha conseguido, y esto pone de manifiesto el
hecho de que la formacin de molculas es extraordinariamente fcil, ms si se tiene en
cuenta que se puede considerar a la Tierra como un gigantesco laboratorio y que adems el
proceso se realiz durante cientos de millones de aos. De esta forma se supone que se
generaron las 4 clases de molculas que se encuentran en las clulas: aminocidos,
nucletidos, azcares de bajo peso molecular y cidos grasos. Se supone que estas molculas
orgnicas simples se acumularon en concentraciones elevadas en algn lugar y en algn
momento.

Una vez que tenemos molculas pequeas, se pueden polimerizar y se pueden obtener
polipptidos a partir de los aminocidos y polinucletidos (DNAs y RNAs) a partir de los
nucletidos. Hoy en da sabemos que se necesitan enzimas para que se produzcan estas
polimerizaciones. Entonces, en el caldo prebitico (primitivo) no deban existir estos enzimas
proteicos, pero probablemente existan iones metlicos, minerales, que podran haber actuado
como catalizadores. El aumento de la temperatura tambin pudo beneficiar la sntesis de
polmeros de longitud variable y secuencia aleatoria. Una vez formados, algunos de estos
Introduccin a la clula 1
polmeros podran influir sobre la formacin de otros polmeros, Por ej. Los polinucletidos
pueden especificar la secuencia de nucletidos de otros polinucletidos, actuando como
patrones para las reacciones de polimerizacin.
En estas condiciones es probable que la reproduccin de los nucletidos se hiciera con
mucha lentitud y que se produjeran errores en el proceso de copiado. Adems, no todos los
polinucletidos tienen igual capacidad de replicacin, de modo que, al cabo de un tiempo (y
esto sucede tambin en el laboratorio) llegan a predominar varias secuencias favorables. Un
polinucletido, como una molcula de RNA, tiene dos caractersticas importantes:
1. Transporta informacin codificada y su secuencia de nucletidos se transmite por el
proceso de replicacin (informacin). La secuencia de nucletidos es anloga a la
informacin hereditaria o genotipo.
2. Tiene una estructura plegada nica que determina como funcionar y responder a
las condiciones externas (funcin). La estructura tridimensional plegada es anloga al
fenotipo, la expresin de la informacin hereditaria sobre la que acta la seleccin
natural.
Se admite la idea de que hace unos 4000 millones de aos, los sistemas capaces de
producir la autorreplicacin de polinucletidos, iniciaron el proceso de la evolucin. Estos
polinucletidos pudieron empezar a dirigir la sntesis de polipptidos a partir de aminocidos y
entre estos polipptidos habra protenas enzimticas que catalizaran multitud de reacciones.
este proceso sera similar en aquel entonces al ciclo vital de algunos virus que conocemos hoy
en da.
El segundo acontecimiento importante en esa evolucin debe haber sido probablemente
el desarrollo de una membrana externa. Todas las clulas, actualmente, estn rodeadas de
una membrana plasmtica. Se supone que la primera clula se form cuando las molculas de
fosfolpidos de aquel caldo primitivo se ensamblaron espontneamente y formaron estructuras
membranosas que incluyeron en su interior cidos nucleicos y molculas de protenas.

REVISIN HISTRICA SOBRE EL CONCEPTO DE CLULA

El conocimiento de la existencia de clulas nace con el microscopio ptico. Lo que


se sabe hoy en da se debe a la acumulacin de observaciones y al desarrollo de tcnicas
cada vez ms precisas.
Los primeros conocimientos de la estructura celular datan de 1665, cuando Robert
HOOKE, observando al MO una laminilla de corcho, vio unas cavidades parecidas a las
celdillas de un panal y las denomin clulas, en ingls cell (celda). Estas celdillas eran
en realidad las paredes celulares, fuertemente engrosadas por suberina, de clulas muertas
del corcho (corteza del alcornoque, Quercus suber).
En 1673 LEEUWENHOEK, con un microscopio de su invencin, observ y dibuj
organismos unicelulares de aguas estancadas.
En 1774 CORTII seal la presencia de un medio interno intracelular.
En 1781 BROWN descubri en clulas animales un corpsculo al que denomin
ncleo.
En 1833 DUJARDIN describi el contenido celular como una sustancia
gelatinosa, homognea, elstica y sin trazas de organizacin.
En 1838 PURKINJE dio el nombre de protoplasma a ese medio y defini la clula
como un grumito de protoplasma, en cuyo interior se encuentra el ncleo.
En 1838 SCHLEIDEN integr todos los conocimientos anteriores y afirm que
todos los vegetales estaban constituidos por clulas.
Introduccin a la clula 2
Clulas de corcho (corteza del alcornoque Quercus suber), con la pared
suberificada y muertas, tal como las pudo haber visto Robert Hooke, x400. Bueno, l las
vera un poco peor porque no tena nuestros microscopios. Y adems no poda
fotografiarlas. Fotografa: Geni lvarez.

2. TEORA CELULAR

En 1839 SCHWANN extendi los postulados de SCHLEIDEN a los animales


empleando por primera vez el trmino teora celular que expresa que:
1. Todos los seres vivos estn constituidos por clulas.
En 1855 WIRCHOW aade al postulado anterior los siguientes que completan
la teora celular:
2. Toda clula procede de otra clula por divisin de esta ltima.
3. Existen seres unicelulares y pluricelulares.
4. Los grmenes de la reproduccin (gametos) son tambin clulas.

RESUMEN: La Teora celular de SCHLEIDEN, SCHWANN y WIRCHOW expresa


que:
1. Todos los seres vivos estn constituidos por clulas.
2. Toda clula procede de otra clula por divisin de esta ltima.
3. Existen seres unicelulares y pluricelulares.
4. Los grmenes de la reproduccin (gametos) son tambin clulas.

Esta teora condujo a la definicin de clula: es la unidad morfolgica y


fisiolgica de los seres vivos. Unidad morfolgica porque todos los seres vivos estn
constituidos por clulas y unidad fisiolgica porque las clulas poseen los mecanismos
bioqumicos necesarios para que se de la vida.
Introduccin a la clula 3
FORMA Y TAMAO DE LAS CLULAS.

Recordad las unidades de medida en citologa:


1m= 103 mm
1mm = 103 m (micras o micrmetros)
1m = 103 nm (nanmetros o milimicras m)
1 nm = 10 (Angstroms)

Forma
Aunque es un poco pronto y abstracto hablar ahora de la forma de las clulas, porque
lo detallaremos cuando expliquemos la clula procaritica y eucaritica, si podemos decir
que las clulas son cuerpos tridimensionales, algo que, a veces, a los alumnos les cuesta
reconocer, porque en realidad ven casi siempre cortes de clulas.
En general las clulas tienen formas esfricas (o globosas) o prsmticas, pero hay
casi tantas formas como tipos celulares:
Clulas procariticas: cocos (redondeadas), bacilos (alargadas) espirilos (alargadas
y retorcidas como un sacacorchos), en forma de coma (vibrios).
Clulas eucariticas vegetales: casi siempre son globosas o prismticas, al menos en
vegetales superiores. Las clulas reproductoras masculinas en vegetales inferiores suelen
ser algo alargadas y poseer flagelos. Las femeninas tienden a ser esfricas, ms grandes y
en menor nmero.
Clulas eucariticas animales: planas, cbicas o prismticas (tambin llamadas
cilndricas) en los epitelios; fusiformes (con forma de huso), estrelladas en el tejido
conjuntivo; fusiformes tambin en el tejido muscular, discos bicncavos (eritrocitos) o
redondeadas en la sangre, redondeadas o esfricas en muchos tejidos. Qu forma tienen las
neuronas?. Las clulas reproductoras femeninas tienden a ser esfricas y las masculinas
alargadas y flageladas.
Si hablamos de las formas de los Protozoos (animales unicelulares) tendramos que
describir muchos tipos, porque son las clulas ms complejas que se conocen, son
autnticos organismos unicelulares, es decir, poseen autnticos rganos dentro de la
clula. Son las amebas (forma irregular y cambiante), los paramecios (forma de zapatilla),
las vorticelas (forma de embudo), los tripanosomas (alargados y flagelados) etc.

Tamao
Es tambin muy variado, en general menor en las clulas procariticas (1-2 m).
Entre los eucariticas el tamao es muy dispar, los Protozoos presentan a veces clulas de
gran tamao, un paramecio puede medir ms de 500 m.
Si nos centramos en los Metazoos (animales pluricelulares), Vertebrados (con
esqueleto) y Mamferos (con glndulas mamarias y pelo) y concretamente en el hombre, las
clulas ms pequeas de nuestro organismo son los glbulos rojos (con forma de disco
bicnvavo de 2 x 7 m) y las mayores son las neuronas de Purkinje, con 200 m. A veces
las neuronas tienen axones de varios metros de longitud (cetceos marinos). Otros tamaos
de clulas en el hombre son los siguientes:
Hepatocito o clula heptica: 20 m.
Espermatozoides: 53 m incluido el flagelo.
vulo humano 150 m.
Las clulas ms grandes de la naturaleza son probablemente los huevos de las aves y
los reptiles.
Introduccin a la clula 4
SERES UNICELULARES Y PLURICELULARES

Repasar la Introduccin a la Biologa de principios de curso y las clasificaciones de


los seres vivos.

Nivel unicelular: muchos organismos son unicelulares (estn constituidos por una
nica clula). En algunos casos las clulas se asocian formando colonias, pero no se
establecen relaciones fisiolgicas entre las clulas, no existen tejidos ni distribucin de
funciones entre los distintos tipos de clulas. Los individuos unicelulares pueden ser a su
vez
-procariontes, sin verdadero ncleo (pro=antes, carion=ncleo, ontes=ser). Son
procariontes las bacterias, las algas cianoficeas (o cianobacterias) y los micoplasmas.
-eucariontes, (eu=verdadero, carion=ncleo, ontes=ser). Son eucariontes
unicelulares algunas algas (en todos los grupos de algas hay especies unicelulares), algunos
hongos, todos los protozoos.
Es decir, son organismos unicelulares todos los procariotas y algunos eucariotas.

Nivel pluricelular: Comprende aquellos individuos constituidos por muchas clulas


que se agrupan para formar tejidos. Aunque no haya verdaderos tejidos (vegetales
inferiores y metazoos primitivos) o no estn bien diferenciados, se establecen ya relaciones
fisiolgicas entre las clulas y aparece al menos una divisin entre clulas vegetativas y
clulas reproductoras. En la mayora de los casos aparecen tejidos bien desarrollados.
Los tejidos son conjuntos de clulas que realizan una misma actividad y que tienen el
mismo origen. Los tejidos se agrupan en rganos y los rganos en aparatos o sistemas. Una
aparato consta de tejidos y rganos variados, mientras que en un sistema predomina
fundamentalmente un solo tipo de tejido (se habla de sistema nervioso, sistema muscular,
sist. endocrino, sist. seo y de aparatos digestivo, respiratorio, excretor etc.).
Los pluricelulares, por supuesto, son siempre eucariotas.

DIFERENCIACIN Y ESPECIALIZACIN CELULAR

En la mayora de los organismos pluricelulares aparecen tejidos originados por


diferenciacin y especializacin de las clulas.

En los animales superiores y, tomando como ejemplo el hombre, todas las clulas
se originan a partir de una sola: el huevo fecundado (diploide, con 2n cromosomas, n
procedentes de un progenitor y n del otro). Durante el desarrollo embrionario se va
dividiendo y las clulas se van diferenciando especializndose para formar los tejidos
(apartado anterior). Los principales tejidos son: epitelial, conjuntivo, seo, cartilaginoso,
muscular y nervioso con gran cantidad de tipos celulares.

Recordad que los animales se clasifican en dos grandes grupos: los Protozoos (unicelulares) y los Metazoos
(pluricelulares). Los Metazoos a su vez pueden ser Invertebrados, que poseen tejidos ms o menos diferenciados
dependiendo de su grado de evolucin y los Vertebrados que poseen tejidos similares a los de hombre.

Introduccin a la clula 5
En los vegetales los individuos se pueden desarrollar a tambin a partir de un huevo
o cigoto, pero los ciclos biolgicos son ms complicados (ver meosis) y en muchas
ocasiones hay individuos haploides (con n cromosomas) que no se forman a partir de un
huevo fecundado, sino a partir de una espora haploide. En cualquier caso se produce
tambin la diferenciacin y especializacin de las clulas para formar tejidos, al menos en
los vegetales superiores: tejidos absorbentes (especializados en la captacin del agua del
sustrato), tejidos conductores como el xilema y el floema (encargados de la distribucin del
agua por el vegetal), tejidos de sostn como el colnquima y el esclernquima (dan solidez
al vegetal y el permiten mantenerse erguido fuera del agua) y tejidos epidrmicos que
protegen superficialmente y limitan las prdidas de agua.

En los vegetales se distinguen tres niveles de organizacin dependiendo de su grado de evolucin y de la


presencia o no de tejidos:
Nivel protfito (protos= primera, fiton= planta). La unidad morfolgica y fisiolgica es unicelular. La nica
clula realiza funciones vegetativas y reproductoras al dividirse por mitosis. A veces las clulas se agrupan entre si por
medio de muclagos, pero no llegan a tenr relaciones fisiolgicas. Son las algas azules (cianobacterias, que ademas son
procariotas), las diatomeas, algunas algas verdes y ciertos hongos.
Nivel talfito. Son vegetales pluricelulares cuyas clulas constituyen una unidad fisiolgica porque estn
relacionadas entres si. Esa unidad fisiolgica es el talo. Pero los talfitos son totalmente dependientes del agua o de una
atmsfera saturada de humedad, poeque carecen de tejidos especializados capaces de regular el contenido hdrico. En los
ms primitivos todas las clulas realizan funciones vegetativas y de reproduccin, pero en los ms evolucionados
aparecen grupos de clulas con dos funciones, unas se dedican a realizar la fotosntesis y almacenar reservas (funciones
vegetativas) y otras a la reproduccin.
Son las algas rojas, las pardas, muchas verdes, gran parte de los hongos y los Briophytos (Musgos y Hepticas),
si bien en este grupo ya se observa cierta diferenciacin de tejidos.
Nivel traquefito o cormfito. Los vegetales que alcanzan este nivel son capaces de vivir en el medio areo y
son solo parcialmente dependientes del agua. Pueden mantener y retener el agua en su cuerpo vegetativo, porque adquiren
los tejidos especializados citados antes: tejidos absorbentes (especializados en la captacin del agua del sustrato), tejidos
conductores como el xilema y el floema (encargados de la distribucin del agua por el vegetal), tejidos de sostn como el
colnquima y el esclernquima (dan solidez al vegetal y el permiten mantenerse erguido fuera del agua) y tejidos
epidrmicos que protegen superficialmente y limitan las prdidas de agua.
Son traquefitos los Pteridophytos (helechos) y las Espermaphytas (Gimnospermas y Angiospermas).

TIPOS DE ORGANIZACIN EN LOS SERES VIVOS

Repasar la clasificacin de los seres vivos que se os dio en la Introduccin a la


Biologa de principios de curso.

SERES ACELULARES. VIRUS. Como decimos son organismos acelulares (no son
clulas). Consisten nicamente en un filamento de cido nucleico que puede ser DNA
o RNA, y una cpsula de naturaleza protenica.

SERES CELULARES
PROCARIONTES: seres vivos con clulas procariotas (sin verdadero ncleo). Tienen
una regin nuclear en la que se encuentra el DNA. Son las bacterias, las
cianoficeas y los mycoplasmas.
EUCARIONTES: tienen verdadero ncleo. En l se aloja el DNA. Son todos los animales
y todos los vegetales a excepcin de las cianoficeas.

*Atencin: procarionte y eucariontes son siempre sustantivos. Procariota y eucariota


pueden ser sustantivos o adjetivos. No se puede decir los seres eucariontes, solo los eucariontes.

Introduccin a la clula 6
MTODOS DE ESTUDIO DE LAS CLULAS

ESTUDIO MICROSCPICO

TIPOS DE MICROSCOPIOS: LMITE DE RESOLUCION

En citologa se estudian formaciones de tamao muy variado. Por ejemplo: el dimetro


de una mitocondria es de 0,5 micras. Muchas bacterias tienen una micra de largo y una
clula de mamfero, como el hombre, oscila entre 5 y 50 micras. Cualquier clula animal,
en general, tiene un tamao de 10 a 20 micras. Las clulas vegetales suelen ser mayores.
Para el estudio de todas estas clulas se ha usado tradicionalmente el microscopio:
Microscopio ptico (de luz): usa luz visible (blanca).
Microscopio electrnico: utiliza una radiacin de electrones para iluminar los
objetos. Puede ser de dos tipos:
- de transmisin (TEM, de Transmission Electron Microscope).
- de barrido (SEM, de Scanning Electron Microscope)

El MO (microscopios ptico o de luz), consta de:


Un sistema de lentes, ocular (generalmente x10) y tres o cuatro objetivos (x4, x10, x40 y x100).
Una platina para colocar los portas, con pinzas o nonius.
Una fuente de luz con condensador y diafragma.
Un sistema de enfoque (micromtrico y macromtrico)

El TEM es un microscopio de mayor tamao que el ptico. La fuente de iluminacin es un filamento (suele ser de tungsteno) o
ctodo situado en la parte superior de una columna cilndrica de unos 2 m de altura que emite electrones, en esa columna se hace el vaco
para que el aire no disperse los electrones. Los electrones son acelerados y obligados a formar un haz que se dirige a la parte inferior de la
columna hacia la muestra a estudiar. Las regiones densas (en las que hay gran densidad de tomos de la clula) no permiten ser
atravesadas por elos electrones y aparecen como zonas oscuras o densas a los electrones en la pantalla de televisin en la que se ve la
imagen.
El SEM suele ser ms sencillo y ms pequeo que el TEM. En este caso los electrones no atraviesan la muestra sino que inciden
sobre su superficie. Ello permite tener imgenes tridimensionales de las estructuras.

Como vemos, los microscopios son un sistema de lentes de amplificacin que


permiten al ojo humano ver estructuras que sin ellos no se podran ver.

Se llama "poder de resolucin" a la capacidad que tiene el ojo humano, solo o


ayudado por aparatos, para distinguir dos objetos muy prximos.
El lmite de resolucin del ojo humano desnudo es de 0,2 mm.
" " del Microscopio de Luz es de 0,2 m. (0,2-1,1 mm).
" " " Electrnico es de 2,5 (1 -10 )

El lmite de resolucin depende de la luz con la que se iluminan los objetos. Se ha


demostrado que dos objetos muy prximos solo pueden observarse como distintos
cuando la distancia entre ellos es mayor que la mitad de la longitud de onda de la luz
empleada.

* Ejercicio:
La longitud de onda de la luz blanca es de 550 nm. Sabiendo que el microscopio
ptico funciona con luz blanca, cul es su lmite de resolucin?

Introduccin a la clula 7
El microscopio electrnico se introdujo entre la dcada de los 40 y los 50, y funciona
con electrones. Los electrones pueden considerarse como una variedad de radiacin de
pequesima longitud de onda. Esto permite que su lmite de resolucin est entre 1 y 5 .
Se suele decir de 2,5 , es decir, unas 100 veces mayor que el microscopio ptico. El
microscopio electrnico permite distinguir incluso macromolculas. Por ejemplo: una
protena puede tener entre 50 y 100 .

Los lmites del poder de resolucin establecen los lmites de amplificacin. La


amplificacin se refiere al tamao aparente de los objetos. La resolucin se refiere a la
nitidez de la imagen. Las imgenes microscpicas pueden ampliarse casi sin lmites por
medios pticos o fotogrficos, pero a partir de cierto punto la imagen es cada vez ms
borrosa y no se consigue nada con la amplificacin.

Solucin al ejercicio de la pgina anterior: 550/2=275nm Al menos debe ser 275 nm, es decir, de 0,275 m.

PREPARACIN DE MUESTRAS: TCNICAS MICROSCPICAS

Antes de su observacin al microscopio los materiales deber ser preparados.


Describimos unas tcnicas estandarizadas, aunque luego cada material biolgico tiene su
tcnica especfica.

Microscopio de Luz.
1. Fijacin.
La fijacin consiste en la utilizacin de distintas sustancias que precipitan las
macromolculas. Se emplea el formol o el glutaraldehdo para el microscopio ptico. Se
trata de matar las clulas pero conservando las estructuras.

2. Embebido en sustancias duras. Una vez fijado se hace lo siguiente: el material se


deshidrata y se empapa en cera de parafina derretida que se endurece cuando se enfra.
Luego el tejido incluido en sustancias duras se secciona con microtomos que poseen
navajas de acero y que permiten cortes de 2 a 10 micras de espesor. A veces, en vez de
incluirse en parafina se congelan y se seccionan las muestras congeladas, pero la
congelacin produce dao tisular.
Estos cortes se montan en el portaobjetos.

3. Tincin. se tien con colorantes adecuados, a veces selectivos para un tipo de


orgnulo o de sustancia. Por ejemplo, la hematosilina eosina es una tincin especfica para
el DNA (es un colorante bsico). Se observa al microscopio tras ponerle (montar el cubre)
el cubreobjetos.
A veces se sellan las preparaciones (los cubres) para facilitar su conservacin.

Introduccin a la clula 8
Microscopio Electrnico de Transmisin (TEM)
1. Fijacin.
La fijacin consiste en la utilizacin de distintas sustancias que precipitan las
macromolculas. Para el microscopio electrnico se emplea el tetraxido de osmio, que
reacciona con lpidos y otros componentes pero no se sabe bien cmo acta.
2. Embebido. Para el microscopio electrnico los cortes han de ser mucho ms finos
para que puedan ser atravesados por los electrones. Adems no se pueden emplear vidrios
porque detienen totalmente los electrones. Entonces, una vez fijados los tejidos, se incluyen
en plsticos no polimerizados que se polimerizan mediante un catalizador. Estos plsticos
permiten obtener cortes de 500 a 1000 Angstroms () de espesor. Se emplean cuchillas
finas de vidrio o de diamante. En lugar de montarse sobre portaobjetos de vidrio se montan
sobre mallas metlicas y la observacin se hace en los agujeros de la malla.
3. Tincin. Para la tincin al microscopio electrnico no se emplean colorantes sino
soluciones que contienen tomos pesados como plomo, uranio. Estos tomos se combinan
con grupos qumicos de ciertas estructuras celulares e impiden el paso de electrones en
mayor o menor medida de modo que las zonas "teidas" aparecen ms oscuras que las
zonas no "teidas". Por conveccin en microscopa electrnica se dice que una formacin
oscura es densa u opaca a los electrones (osmifila) y quiere decir que hay una gran
densidad de molculas.

Microscopio Electrnico de Barrido (SEM)


La microscopa de barrido permite una observacin de superficie en muestras
relativamente gruesas. La muestra se fija, se seca y se recubre de una capa delgada de un
metal conductor (oro, paladio, o carbono que tambin conduce en caliente). El SEM da una
gran profundidad de campo, pero no permite ver el interior de las clulas o de las
estructuras. No se suelen emplear aumentos de ms de x20000, porque la resolucin no es
muy elevada.

PREPARACIN DE FRACCIONES CELULARES (FRACCIONAMIENTO


CELULAR). CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL

Es una tcnica muy importante y muy til para el estudio de los orgnulos celulares.
Primero se homogeinizan las clulas rompindolas en medios que preserven los
orgnulos. Luego se separan los orgnulos por centrifugacin selectiva.
Generalmente, las clulas se rompen sumergindose en disoluciones de sacarosa o de
otros azcares que sean hipotnicas respecto al medio intracelular (Choque hipotnico).

Muchos orgnulos como las mitocondrias, los cloroplastos o los ncleos no resultan
daados.
El retculo endoplasmtico, que son cavidades limitadas por membranas, se rompe en
fragmentos y tiende a formar vesculas esfricas (microsomas).
La membrana plasmtica tambin se rompe en fragmentos de tamao variable.

Introduccin a la clula 9
Cuando se somete a estos homogenizados a centrifugacin diferencial en un campo
gravitacional las distintas partculas se van a mover a mayor o menor velocidad
dependiendo de su tamao, de su densidad y de su forma. Se hace una centrifugacin
diferencial sometiendo a la suspensin de orgnulos a fuerzas de la gravedad
progresivamente mayores.
Ejemplo:

Introduccin a la clula 10
1. Tubo de ensayo con orgnulos completos: mitocondrias, ncleos, ribosomas, RER,
fragmentos de membranas, lisosomas, peroxisomas etc.
Centrifugamos a 1000 g durante 10 minutos.
2. Se forma un precipitado que contiene ncleos, fragmentos grandes de membrana
plasmtica y algunas mitocondrias. En el sobrenadante se encuentran orgnulos ms
pequeos, como peroxisomas y de mitocondrias.
Centrifugamos a 10000 g durante 20 minutos.
3. Se forma un precipitado de lisosomas peroxisomas y mitocondrias y un
sobrenadante.
Centrifugamos a 100000 g durante 1 2 horas.
4. Obtenemos un precipitado de microsomas y fragmentos de RE. En el sobrenadante
tendramos ribosomas libres (no unidos a membranas) y molculas solubles.

Para lograr precipitar orgnulos ms pequeos como los ribosomas tendramos que
centrifugar a ms de 100000 g durante mucho tiempo o bien se puede suspender ese
sobrenadante o cualquiera de los precipitados anteriores en un gradiente de densidad. Por
ejemplo: una disolucin de sacarosa de concentracin creciente de abajo a arriba. Los
orgnulos se sitan en el nivel del tubo en el cual la densidad de la solucin es parecida a la
suya propia. Esto permite separar orgnulos se similar forma y tamao pero de distinta
densidad.

LOCALIZACIN DE MOLCULAS CELULARES

RADIOAUTOGRAFA.

Es muy til para el estudio de fenmenos intracelulares.


Consiste en convertir en radiactivas por incorporacin de tomos radiactivos
pequeas molculas que la clula utilizar como precursores para formar macromolculas.
El istopo ms utilizado es el tritio, H3, variedad radiactiva del hidrgeno. Tambin se usa
el C14, el P32, y el S35.
Uno de los precursores radiactivo ms usado ha sido la timidina tritiada (timina +
desoxirribosa) que se ha hecho radiactiva por sustitucin de algunos tomos de Hidrgeno
por otros de tritio. Lgicamente se ha empleado en el estudio del DNA.

Este precursor se le presenta a las clulas, se cultivan con l, y luego stas se fijan a
intervalos conocidos. Se cortan y los cortes se cubren con una emulsin o pelcula
fotogrfica. Cuando se expone a la luz una pelcula fotogrfica y luego se revela se reducen
las sales metlicas de la pelcula y aparecen granos de plata metlica, que constituyen el
negativo de la pelcula. De igual manera una pelcula expuesta a radiactividad y revelada
despus presenta granos de plata en la emulsin radioautogrfica. Al microscopio se ven
simultneamente la clula y los granos de plata de la emulsin.
Por ejemplo, si se dan precursores radiactivos de RNA, como la uridina tritiada, a
los pocos minutos toda la radiactividad se encuentra en el ncleo. Si se fija 1 2 horas
despus de la exposicin a la uridina tritiada, cada vez aparece ms radiactividad en el
citoplasma, con lo cual queda probado que el RNA se forma en el ncleo y luego emigra al
citoplasma.

Introduccin a la clula 11
Para interpretar correctamente las radioautografas se deben conocer o sospechas las
vas metablicas implicadas y adems se emplean preparaciones testigo. Por ej, a una parte
de las muestras expuestas a precursores radiactivos de RNA se les aade RNAasa
purificada, que desdobla al RNA eliminndolo de los tejidos. Si esta tratamiento suprime la
radiactividad (no se producen granitos de Ag en la emulsin), se concluye que el precursor
radiactivo se incorpora al RNA.

HISTOINMUNOLOGA.
Como sabemos, los anticuerpos son protenas producidas por los vertebrados como
defensa contra las infecciones. Son producidos en millones de formas deferentes cada una
de las cuales tiene un lugar de unin que reconoce especficamente a una molcula diana de
nominada antgeno.
Si se marcan los anticuerpos con colorantes fluorescentes resultan muy valiosos
para localizar en las clulas determinadas molculas mediante la llamada microscopa de
fluorescencia. Tambin se pueden marcar con partculas densas a los electrones (como oro
coloidal) para la localizacin de molculas el microscopio electrnico.
Este mecanismo junto con mtodos de amplificacin de la seal (por ejemplo uniendo
al complejo Ag-Ac otros anticuerpos secundarios) permite detectar pequeas cantidades de
antgenos.
Los test ELISA (de Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay) que se emplea para
detectar varios tipos de infecciones, entre ellas la causada por el VIH, son tcnicas
desarrolladas sobre este fundamento de la reaccin Ag-Ac.

TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

En principio el trmino de DNA recombinante se empleaba para definir una


molcula de DNA construida in vitro a partir de DNA proveniente de dos o ms
organismos. Hoy en da este trmino se aplica a todo material gentico (tambin puede ser
RNA) que es manipulado in vitro.
Ms adelante, en el tema V (Las bases qumicas de la herencia), en el punto 5 (Tcnicas utilizadas en
Ingeniera gentica para transferir un gen de una especie a otra) volveremos a hablar de los mtodos que se utilizan para
conseguir insertar un fragmento de DNA de una especie en el genoma de otra. Ahora solo adelantamos el concepto como
un mtodo ms de estudio de la composicin y los procesos celulares.

Clonar significa hacer copias idnticas. En este caso se hacen copias idnticas, pero
en un organismo distinto al organismo original que posea el gen.
La clonacin del DNA comporta la separacin de un gen especfico o un fragmento
de DNA de su cromosoma (que es mucho mayor) y la unin a una pequea molcula de
DNA portador para replicar este DNA modificado miles o millones de veces. El resultado
es una amplificacin de un gen o de un fragmento de DNA. Posteriormente este gen se
expresar en forma de una protena recombinante.

Introduccin a la clula 12
La clonacin de un fragmento de DNA, procaritico o eucaritico se lleva a cabo
mediante 5 procedimientos generales:

1. Un mtodo para cortar el DNA en una regin precisa. Esto se ha conseguido con
el descubrimiento de endonucleasas especficas de secuencia (endonucleasas o
enzimas de restriccin), que son las tijeras moleculares necesarias.
La primera endonucleasa de restriccin fue aislada en 1970 por Hamilton Smith, a partir de extractos de
una bacteria llamada Haemophilus influenzae. Actualmente se conocen unas 150 que cortan del DNA de
una manera especfica y reproducible. Suelen reconocer secuencias especficas de 4-8 nucletidos, algunas
reconocen secuencias muy frecuente y cortan el DNA en muchos fragmentos pequeos, otras reconocen
secuencias muy raras y cortan el DNA en pocos fragmentos muy grandes.

2. Un mtodo para unir covalentemente dos fragmentos de DNA. Las DNA ligasas
son las encargadas de hacerlo.
3. Seleccin de una molcula de DNA portadora, capaz de autorreplicarse para
que acte como DNA portador. Suelen ser plsmidos bacterianos (pequeos
fragmentos de DNA bacterianos, distintos del cromosoma bacteriano) o DNAs
vricos (que pasan a ser llamados vectores de clonacin), a los que se unen las
molculas de DNA que se quieren clonar. Las nuevas molculas de DNA que
contienen segmentos procedentes de otras fuentes reciben el nombre de DNA
recombinantes.
4. Un mtodo para trasladar el DNA desde el tubo de ensayo a una clula
hospedera que ofrece la maquinaria enzimtica necesaria para la replicacin de
ese DNA. Esta clula va a producir la protena (protena recombinante) que
codifica el gen clonado (va a permitir la expresin del gen). Se suelen utilizar
como clulas hospederas las bacterias Escherichia coli y Bacillus subtilli, las
levaduras (hongos unicelulares) y clulas cultivadas de insectos y mamferos.
Los sitemas bacterianos son los mtodos ms utilizados.
5. Mtodos para seleccionar o identificar aquellas clulas hospederas que
contienen el DNA recombinante.

El procedimiento para la obtencin de una protena recombinante se esquematiza a


continuacin:

Introduccin a la clula 13
Transformacin: introduccin del DNA (del gen) en una bacteria.
Transfeccin: introduccin del DNA (del gen) en una clula eucariota (por ejemplo en una
levadura).

Introduccin a la clula 14
Ejemplos de produccin de protenas recombinantes, de aplicacin en Medicina
Insulina: fue la primera protena comercial creada de manera recombinante. Se
produce en un sistema de expresin bacteriano. Se usa, como sabemos para tratar la
diabetes.
Hormona del crecimiento: anteriormente era extrada de cadveres para tratar a
nios con dficit en esta hormona (enanismo hipofisario). A veces se produca muerte de
los nios por contaminacin con virus mortales. Su produccin de forma recombinante en
un sistema de expresin bacteriano produjo seguridad y abundancia del producto.
Vacunas contra enfermedades infecciosas: antes de la tecnologa del DNA
recombinante todas las vacunas estaban formadas por microorganismos inactivados
(bacterias o virus muertos) o atenuados (bacterias o virus modificados para que no puedan
multiplicarse en el organismo inoculado). Siempre haba un peligro de infeccin.
Actualmente se producen de forma recombinante nicamente protenas de la superficie
del agente infeccioso (por ejemplo, de la envoltura vrica) que son igual de eficaces para
inducir la respuesta del sistema inmunitario, pero ms seguras. La primera vacuna
desarrollada de forma recombinante en levaduras fue contra el virus de la Hepatitis B.
Actualmente hay muchas en estudio, sobre todo se est tratando de obtener protenas
recombinantes correspondientes a protenas de la superficie del virus del sida.
Anticoagulantes y factores sanguneos. Son producidos en cultivos de clulas de
mamferos. De momento es un proceso caro y lento. Se han obtenido de esta manera el
activador del plasmingeno de tejidos (que activa la plasmina, un enzima implicado en
la disolucin de cogulos, se emplea en el tratamiento de vctimas de ataques de corazn),
y el factor VIII (que promueve la coagulacin y se emplea para el tratamiento de
pacientes hemoflicos, eliminando el riesgo de las transfusiones).
Factores de estimulacin del sistema inmunitario: estimulan la produccin de
leucocitos. Se emplean para tratar deficiencias del sistema inmunitario y combatir
infecciones.
Eritropoyetina: estimula la produccin de eritrocitos. Se utiliza para tratar
anemia en pacientes con enfermedades del rin.
Interferones: utilizados para combatir las infecciones vricas y el tratamiento de
algunos cnceres.
Interleuquinas: activan y estimulan distintos tipos de leucocitos. Se emplean para
curas de heridas, infecciones por VIH, cncer e inmunodeficiencias.
Anticuerpos monoclonales: como sabemos, los anticuerpos son protenas
selectivas que pueden unirse a una determinada diana entre millones. Mediante la
tecnologa del DNA recombinante se ha conseguido clonar anticuerpos, generalmente en
bacterias, que reconocen un determinado antgeno. Esta extraordinaria especificidad hace
que sean usados en muchas pruebas de diagnstico.
Adems, los investigadores intentan aprovechar esta especificidad de los
anticuerpos para el transporte de frmacos selectivos, toxinas o compuestos radiactivos a
los tumores, (as se conseguira nicamente la muerte clulas tumorales) o bien a clulas
infectadas por agentes infecciosos.

Introduccin a la clula 15
Mullis, Kary (1944 - ), bilogo molecular y premio Nobel estadounidense que
desarroll la reaccin de la polimerasa en cadena (PCR), una tcnica que genera copias de
DNA. Esta innovacin tuvo una importancia decisiva en la gran expansin de la biologa
molecular a mediados de la dcada de 1980. Se ha aplicado de forma amplia en el campo
de la biologa, tanto para analizar el DNA de muy diversos organismos vivos como para
detectar la presencia de pequeas cantidades de DNA en los fluidos corporales con fines
diagnsticos (por ejemplo, DNA vrico en muestras de sangre humana).
Mullis obtuvo el doctorado en bioqumica por la Universidad de California en
1973. En 1986, public un trabajo en el que explicaba cmo se pueden replicar rpida y
repetidamente secuencias cortas y especficas de DNA. Para emplear la tcnica PCR, la
doble hlice del DNA objetivo, se desnaturaliza mediante temperaturas muy elevadas
para obtener cadenas sencillas de DNA (el DNA plantilla). A continuacin se unen dos
secuencias muy cortas (oligonucletidos) de DNA artificial de una sola hlice a la
plantilla de DNA. La clave de la tcnica es que estos oligonucletidos estn diseados
para unirse al extremo de cada una de las cadenas complementarias de DNA, que
constituan en conjunto el DNA objetivo de cadena doble. Estas dos cadenas de DNA son
replicadas entonces de forma independiente entre los oligonucletidos por accin del
enzima DNA polimerasa, duplicando el nmero de copias de cada secuencia plantilla
disponible. El proceso de desnaturalizacin por el calor, unin de los oligonucletidos y
sntesis de DNA se repite una serie de veces, lo que da lugar a una multiplicacin masiva
del DNA objetivo. En 1993 Mullis fue galardonado con el Premio Nobel de Qumica por
este trabajo.

Introduccin a la clula 16