Bacteriologia Molecular 1

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Tcnicas de biologia
molecular
da anlise de genes e
produtos gnicos nicos a
abordagens em larga escala
os mesmos genes, qual a diferena?

Dogma central
Localizando alvos
Tcnicas iniciais para evidenciar
determinadas molculas de interesse
DNA / RNA mtodos baseados em
hibridizao
Hibridizao
desnaturao / renaturao de cidos nuclicos
Light absorption and temperature in DNA denaturation. (a) Melting of doubled-

stranded DNA can be monitored by the absorption of ultraviolet light at 260 nm. As
regions of double-stranded DNA unpair, the absorption of light by those regions
increases almost twofold. The temperature at which half the bases in a double-
stranded DNA sample havedenatured is denoted Tm (for temperature of melting).
Light absorption by single-stranded DNA changes much less as the temperature is
increased. (b) The Tm is a function of the GC content of the DNA; the higher the
GC percentage, the greater the Tm.
Southern blot
DNA hibridizado com uma sonda um
fragmento de DNA de seqncia conhecida que
contm algum tipo de marcao e pode ser
detectado.
Mostra sequncias complementares sonda
detecta pequenas quantidades (1 to 10 pg por
banda) de uma sequncia especfica 1000
vezes mais sensvel que EtBr
Southern blot - etapas

Etapas: amostra de DNA
submetida eletroforese
mobilidades registradas
DNA transferido para um
filtro (nitrocelulose ou
nylon) criando uma cpia
do gel
DNA imobilizado no
filtro
Sothern blot - marcao de sonda
Incorporao no DNA de nt
marcado radioativamente (p
ex. alfa fosfato P-32), ou por
adio de um grupamento
qumico (digoxigenina ou
biotina)
COMO?
"End labeling enzima
polinucleotdeo quinase
transfere fosfato terminal de nt
radioativo P-32-gamma- para
a extremidade 5 do DNA
Sothern blot - Hibridizao da sonda ao DNA

imobilizado no filtro
A sonda desnaturada
(fervida) e adicionada
(em excesso) em soluo
sobre filtro
Sonda hibridiza com
seqncias
complementares
Sothern blot - lavagens e deteco
Lavagens retiram
excesso de sonda e
desfazem ligaes
inespecficas
(temperatura, fora
inica)
Permanecem as
ligaes especficas
Revelao com base
na marcao da
sonda
Sothern blot - revelao
Sonda radioativa- filtro

exposto a filme raio X,
revelado
Sonda marcao
qumica filtro
exposto a anticorpo
conjugado a enzima (p
ex. fosfatase alcalina) +
substrato que pode
gerar produto colorido
ou luz
a posio da sonda
revelada
os mesmos genes, qual a diferena?

Anlise dos transcritos: Northern Blot

Extrair RNA dos organismos ou tecidos
eletroforese de RNA
transferncia do RNA para uma membrana
marcao de sequncias conhecidas
(sondas)
Hibridizao para localizar sequncias alvo
Visualizao e
quantificao do sinal
de hibridizao
Anlise da expresso de protenas:

Western Blot
Extrair protenas das
clulas
eletroforese
desnaturante
transferncia das ptns
para uma membrana
Reao com anticorpo
2o anticorpo marcado
Visualizao e
quantificao do sinal
Sequenciamento de DNA
Reao de sequenciamento -
replicao de DNA
molde: DNA plasmdeo, fragmento ou
produto de PCR (200 ng)
um primer 20 nt complementar a uma
regio de uma das fitas de DNA
tampo + dNTPs
enzima variante da Taq polymerase
Reao de polimerizao
Desnaturao do DNA 96oC 10 min + formamida
PCR 96oC 10, 50oC 5, 60oC 4 25 X
2 fitas de DNA molde se separam, primer anela a
uma delas especificamente,
polimerase estende
o primer
apenas uma fita
sintetizada, no
amplifica DNA
Mtodo trmino da sntese de DNA por dideoxi-

nt
dideoxinucleotdeos -
sem 3' OH
ao serem adicionados
extremidade do DNA
no h como continuar
a sntese
atuam como
terminadores da
sntese
a maior parte dos nt
so normais, uma
frao so ddNTP
Sequenciamento de DNA - reao Ex: ddTTP
dTTP normal em excesso,

incorporado na maioria dos
casos, a extenso continua
entrada de ddTTP aleatria, a
fita para
ao fim milhes de molculas
incluem paradas em todas as
posies de T
todas as molculas tm o
mesmo incio mas trminos
variados
tamanhos variados so
separados por eletroforese
Sequenciamento de DNA - reao

Dideoxi nt
quimicamente
modificados por
adio de corante
fluorescente.
Reao com os 4
ddNTPs (A, G, C, T)
cada um com uma
cor diferente permite
ler a seqncia de
DNA
Sequenciamento de DNA - automtico

Leitura: sequenciador de DNA contm fonte de laser que atravessa
o gel com um scanner, so registrados os comprimentos de
onda de emisso quando cada fragmento de DNA passa pelo
detector. Cada tipo de base com um comprimento de onda
prprio.
Sequenciamento de DNA - resultado
Software de anlise de sequncia fornece a leitura das

bases e um grfico com intensidade de sinal,
qualidade da sequncia, tamanho pode chegar a 700
nt

Bacteriologia Molecular 1

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Light absorption and temperature in DNA denaturation. (a) Melting of doubled-

Southern blot - etapas

Sothern blot - marcao de sonda

Sothern blot - Hibridizao da sonda ao DNA

Sothern blot - lavagens e deteco

Sothern blot - revelao

Sonda radioativa- filtro

os mesmos genes, qual a diferena?

Anlise dos transcritos: Northern Blot

Anlise da expresso de protenas:

Mtodo trmino da sntese de DNA por dideoxi-

Sequenciamento de DNA - reao Ex: ddTTP

dTTP normal em excesso,

Sequenciamento de DNA - reao

Sequenciamento de DNA - automtico

Sequenciamento de DNA - resultado

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