Uso de levaduras industriales

Agosto 24, 2010

Dr. Luis C. Damas Buenrostro

GCM
Descripcin de Levaduras

Las levaduras son hongos cuya forma usual

y dominante es unicelular. Hay
aproximadamente 50 gneros con ms de
500 especies descritas. Existen normalmente
en la naturaleza en vegetales, animales,
insectos y el suelo. Con pocas excepciones
(algunos gneros de la familia
Cryptococcaceae como Candida,
Cryptococcus, Pityrsosporum) rara vez
producen enfermedades.
 Gema
Vacuola

Membrana

Mitocondrias

Pared celular

Clula madre Cicatriz

Estructura fina de una clula de levadura
Saccharomyces cerevisiae
 FASES DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA
Reproduccin de la levadura Nmero de Clulas

60 80 mill/ml

0.5 10 mill/ml

19 23 mill/ml

Fase Lag Fase de Crecimiento Fase Estacionaria Fase de Muerte o

Sedimentacin
 Levaduras Industriales
Levadura Tipo de Uso industrial
levadura

Saccharomyces cerevisiae Ascomiceto Panificacin, elaboracin de bebidas fermentadas (vino,

cerveza, licores, sake, etc.). Produccin de etanol.
Elaboracin de complementos nutricionales, saborizantes,
vitaminas, extractos, etc.
Candida utilis Ascomiceto Proteina unicelular, produccin de alcohol.

Saccharomycopsis fibuligera Ascomiceto Proteina unicelular, glucoamilasa, bioquimicos, alcohol

Yarrowia lipolytica Ascomiceto Proteina unicelular, lipasa, bioquimicos

Candida milleri Ascomiceto Pan acido (sourdough)

Kluyveromyces marxianus Ascomiceto Proteina unicelular, alcohol

Phaffia rhodozyma Basidiomiceto Proteina unicelular para acuacultura

Brettanomyces sp. Deuteromiceto Fermentacin cervezas lmbicas
Ventajas tecnolgicas de
Saccharomyces cerevisiae
1. Tolerancia a concentraciones elevadas de etanol (hasta 18%
vs 1-4 % otras levaduras)
2. Poder acidificante y tolerancia a bajos pH (3 4) con la
consecuente supresin de patgenos
3. Inocuidad comprobada en ms de 8,000 aos de uso (status
GRAS)
4. Separacin espontnea natural del producto (floculacin) o
fcilmente filtrables o sedimentables
5. Alta productividad, tanto en condiciones aerobicas (hasta 0.54
g de biomasa por gramo de glucosa) como anaerobica (hasta
0.48 g de etanol por gramo de glucosa)
6. Posibilidad de manipulacin gentica
7. Estabilidad gentica
8. Velocidad de generacin aceptablemente rpida (1-2 hrs)
 Usos Industriales de S.
cerevisiae

Dirigidos a la produccin de biomasa
Produccin de levadura para panadera
Aditivos alimenticios agrcolas
Complementos nutricionales
Extracto de levadura para Microbiologa
Suministro de levadura para uso industrial

Dirigidos a los productos de fermentacin

Elaboracin de vino
Elaboracin de licores
Produccin de alcohol industrial
Elaboracin de cerveza
Variedades de uso industrial
de Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae var.
cerevisiae: levadura de las fermentaciones
ale, destileras, panadera, vinatera,
alcohol industrial, productos nutricionales.
S. cerevisiae var. uvarum
(carlsbergensis): levadura de las
fermentaciones lager.
S. cerevisiae var. bayanus: levadura de
vinos
S. cerevisiae var. fermentati (flor):
produccin de jerez
 Tipos de Levaduras
S. cerevisiae var. uvarum S. cerevisiae var. cerevisiae

Levadura
 Clulas muertas

Reaccin reduccin azul de metileno:

N Oxidado=Azul
+
S N(CH3)2
(CH3)2 N
NADH

NH Reducido=Incoloro

S N(CH3)2
(CH3)2 N
Viabilidad por fluorescencia
Resumen de la produccin de compuestos
en Fermentacin
Glucosa

Sulfato
Piruvato H2S y SO2
Acidos Acetaldehido
Aminocidos
Orgnicos Acetil-CoA

Etanol Aminocidos
Ac. Graso-
CoA Alcoholes
Etanol superiores
Diacetilo
Grasas
VDKs
Acidos
Grasos Esteres

Metabolismo de la levadura: produccin del sabor

 Curva de Fermentacin
100 16

Clulas Suspendidas
90 Extracto
14

80
12

70
Clulas suspendidas X10 6/mL

10
60
No Floculante

50 8

40 Etanol
6

30
4

20

2
10

Floculante
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7

Das
Mecanismo
Molecular
de la
Floculacin
 Saccharomyces cerevisiae

Contiene 16 cromosomas de 200 a

2200 Kb.

6183 marcos de lectura abiertos

5800 corresponden a genes que
codificaban para protenas.

Tamao promedio de los genes es
de 1.45 kb, o 483 codones
Expresin Global
Genoma

Transcriptoma

Proteoma
1 2 3 4 5 6 7 Figure 1. PCR products of FLO genes from S. diastaticus strain. Lanes: 1,
8 100-1000 bp ladder; 2, Lg-FLO (312 bp); 3, FLO5 (423 bp); 4, FLO9 (347 bp);
5, FLO8 (920 bp); 6, FLO10 (270 bp); 7, FLO11 (749 bp); 8, FLO1 (596 bp)

# FLO Flocculation
Strain FLO1 FLO5 FLO8 FLO9 FLO10 FLO11 Lg-FLO
Genes (mL)
Baker's + + - - - + - 3 0.0
Lager 790 + - + - - + + 4 2.5
Lager BRY - - + - + + + 4 3.8
Lager J-2036 - - + + + + + 5 3.6
Lager 820 + - + - + + + 5 4.5
Lager KJ8 - - + + + + + 5 5.5
Lager LAW + - + + + + + 6 5.0
S. diastaticus - + + + + + w 6 NA
S. pastorianus + + + - - + - 4 NA
S. willianus - + + + + + - 5 NA

7.0
Flocculation (mL, Helm Test)

6.0
KJ8 LAW
5.0
BRY 820
4.0
J-2036 R2 = 0.75
3.0
790
2.0

1.0
Baker's
0.0
2 3 4 5 6 7
Number of FLO genes
 Marcador

2
100
C FR1**
C FR2
C FR3

992 966
5
C FR4
100 C FR5

998
7 C FR6
101

MFR1**
992

MFR2
966

MFR3
5

descartado
100

MFR4

**NOTA: FR1
MFR5
998
7
101

MFR6
Ctrl (-)
FR1**
Ctrl (-) FR2
Ctrl (-) FR3
Ctrl (-) FR4
Ctrl (-) FR5
1.5% Ctrl (-) FR6
Agarose
Marcador
 Deteccin de mutaciones por HRM

Extraccin
DNA RT

Levadura

qPCR

HRM CP
Microarreglos
Anlisis de microarreglos

FLO 5

FLO 11

FLO 1
Herramientas de anlisis de microarreglos
-Spot finder: conversin de imagenes .tiff a valores numericos de
intensidad (medido por pixeles).

-GenArise: Determinacin de valor Z para deteccin de genes con

represin/induccin relevante

-FatiGo: Determinacin, mediante ontologa, de posibles funciones

de los genes seleccionados como relevantes por microarrays.
Expresin global de genes. Anlisis Ontolgico
Base de datos Saccharomyces Genome Database
 DISEO EXPERIMENTAL

2.- Extraccin de RNA

1.- Disear diferentes

condiciones de
fermentacin

3.- Anlisis de microarreglos

Genes regulatorios relacionados a floculacin

Nombre comn Descripcin Procesos biolgicos Expresin

CLB1 Ciclina B, especfica para G2/M Ciclo celular Inducida

CLB2 Ciclina B, especfica para G2/M Ciclo celular Inducida
SWE1 Cinasa de especificidad dual, inhibe Cdc28p Ciclo celular Reprimida
BCK2 Supresor de mutaciones de PKC1, su sobreexpresin estimula Estrs osmtico Inducida
transcripcin de ciclina B
MSN1 Activador transcripcional involucrado en regulacin de Estrs osmtico Inducida
expresin invertasa y glucoamilasa, crecimiento invasivo y
diferenciacin pseudohifal (FLO11) y respuesta a estrs
osmtico. Via MAPK
PKC1 Protein cinasa C, con actividad choque hipotnico. Via MAPK Estrs osmtico Reprimida

PTC2 Fosfoprotein fosfatasa tipo 2C, defosforila Hog1p y Cdc28p. Estrs osmtico Inducida
Inactiva va MAPK al finalizar estrs osmtico
RGD2 GTPasa proteina activadora para Cdc42p y Rho5p. Via Estrs osmtico Inducida
PKC1/MAPK
SLG1/WSC1 Sensor requirido para integridad de pared celular y respuesta a Estrs osmtico Inducida
estrs hipoosmtico, via sealizacin Ras, PKC1/ MAPK

STE20 Protein cinasa de la va MAPK participa en respuesta a Estrs osmtico Reprimida

feromonas, choque osmotico, y falta de nutrientes
HIR1 Regulador de transcripcin de histonas, correpresor Factores de transcripcin Reprimida
SNF12 Componente SWI/SNF activador global de transcripcin, Factores de transcripcin Reprimida
respuesta a estrs
ESC1 Establece silenciamiento de cromatina en telmeros uniendose Silenciamiento de genes Inducida
a Sir4p
ESC4 Establece silenciamiento de cromatina, regula transposicin Silenciamiento de genes Inducida

HHF1 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de Silenciamiento de genes Inducida
telomeros
HHF2 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de Silenciamiento de genes Inducida
telomeros
HHT2 Histona H3. Interactua con Sir4p para silenciamiento de Silenciamiento de genes Inducida
telomeros
HTZ1 Variante de histona H2AZ. Regula extensin de silenciamiento Silenciamiento de genes Inducida

TAF60 Factor transcripcional TFIID y subunidad SAGA, similar a Silenciamiento de genes Inducida
histona H4
 Alta concentracin de nutrientes

Eliminacin de estrs osmtico Estrs osmtico

MOSTO
SLG1
LgFLO1p SLN1 (1.02)
PTC2 CLB1,2
IRE1 (1.0)
SWE1 CDC28 (1.13)
SNF12 MSN1
Chaperonas BCK2
SIR4 (1.24) RGD2
Divisin HOR2
Lg-FLO1 RNAm
celular RHR2
ESC1 ESC4 PKC1
TAF60 HTZ1 Sntesis de PSA1
HHF1 HHF2 glicerol MNN1
HHT1 HIR1 GMH1
Silenciamiento END3
de genes Remodelacin OCH1
Lg-FLO1 Subtelomericos pared celular
GUK1
 DNA
Cbf1
Met4 Met28 Me31 Met32

SO42-
Met14
MUP3 APS KINASE NADPH
Low affinity Met3
Methionine ATP
permease sulfurylase 5'-adenylyl sulfate SO32-
ATP Met16
3 NADPH
3 phospho 5 adenylyl sulfate (PAPS) PAPS REDUCTASE
PPi PAP + NADP+ 3 NADP+
Met5 Met10
Sulfite reductase
adenosine S2-
Sulfuro
790
Met25
820 Met13
Homocysteine synthase
CH3

S-Adenosyl Met6
Homocysteine Homocysteine
metyl-transferase O-acetyl homoserine
Methionine
ATP Met2
MHT1 PPi + Pi Homoserine trans-acetylase

CH3

S-AdenosylMethionine Aspartate Homoserine

(AdoMet)
 Glicolisis PDC1 Piruvato
PDC5 Descarboxilasa ADH4 ADH5 SFA1 ATF2
PDC6 ADH1 ADH2 ADH3 ATF1
Piruvato Acetaldehido Alcohol etlico Acetato de etilo
Acetolactato ILV2 Alcohol Acetil transferasa
sintetasa deshidrogenasa
ILV6
2-acetolactato

Acetohidroxiacido
ILV5
reductoisomerasa

2,3 Dihidroxi-isovalerato

ILV3 Dihidroxyacido 790

dehidratasa
2- cetoisovalerato
BAT1 BAT 2
L-valina
820
Acetyl- CoA Aminotransferasa
Alfa-isopropilmalato
LEU4 LEU9
sintetasa
2-CoenzymeA
isopropilmalato
Isopropilmalato
isomerasa.
LEU 1 3- isopropilmalato
Beta-IPM- Descarboxilasa
LEU 2 dehidrogenasa ADH4 ADH5 SFA1
ARO10
ADH1 ADH2 ADH3 Acetato de
THI3 Alcohol isoamilico
L-Leucine 2- cetoisocaproato 3 metyl butanol isoamilo
BAT1 BAT 2 ATF1 ATF2
 FLO Flocula-
#Genes
Cepa
FLO
cin(mL) Bmax (fmol/cel) Kd
1 5 8 9 10 11 Lg
820 + - + - + + + 5 4.5 0.06445 1.337
790 + - + - - + + 4 2.5 0.04259 7.262
7754 + + - - - + - 3 0 0.001178 0.6071

820 = 38.82 millones sitios / cel

790 = 25.65 millones sitios / cel
7754 = 0.71 millones sitios / cel