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MTODO DE SECUENCIACIN SANGER

UNIVERSIDAD
MTODO TCNICA DE AMBATO
DE SECUENCIACIN SANGER

FACULTAD DE INGENIERIA EN ALIMENTOS


El mtodo de secuenciacin de Sanger fue diseado por Fred Sanger
en 1977),CARRERA
es tambin DEconocida
INGENIERA BIOQUMICA
como mtodo didesoxi o de
secuenciacin de ADN mediante terminacin de cadena. Se basa en
el uso de ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una
terminacin especfica, generndose fragmentos de ADN de todos los
tamaos posibles. Esto es viable, mediante el uso nucletidos
modificados que no tienen grupos hidroxilos en su extremo 3 OH,

MODLO
grupo esencial para la polimerizacin por la ADN polimerasa, de la
misma forma cuando se incorpora un dideoxinucletido (ddNTP),
como residuo terminal, evita que la cadena de ADN contine
extendindose, de tal forma que se obtienen fragmentos de

OPTATIVO III
diferentes tamaos, (De Necochea, & Canul, 2004; Pea, 2013).

Proceso de secuenciacin tradicional por el mtodo


de Sanger
La estrategia es hacer cuatro reacciones (Figura 1). Se incluye la
hebra de ADN a secuenciar, ADN polimerasa, cebadores
desoxiribonucletidos, didesoxirribonucletidos trifosfato
correspondientes a las 4 bases (A, G, T Y C).
2017

BIOINFORMTICA

Integrantes:

- Cisneros Ruth

-Flores Valeria

-Guanoquiza Kelly

--torres Daniela

-Sailema Magdalena

ING. CHRISTIAN GALARZA


MTODO DE SECUENCIACIN SANGER

Figura 1. Mtodo de Sanger, Cuatro reacciones con


ddNTPs diferentes permiten la sntesis con distintos
fragmentos.
1. La muestra de ADN se divide en cuatro tubos de reacciones de
secuenciacin separadas que contienen los cuatro tipos de ddNTP
(ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP), adems se incluyen el resto de
componentes moleculares ya nombrados.

2. Se inicia la reaccin aadiendo los cebadores marcados y


complementarios al extremo 3-OH de la secuencia molde. La
polimerizacin ocurre direccin 5 a 3.

3. La cadena recin sintetizada se finaliza en el punto de la adicin


del ddNTP complementario y se generan fragmentos de ADN de
diferentes tamaos. El tubo de ddATP genera fragmentos acabados en
A, el tubo de ddTTP acabados en T, y as sucesivamente.

4. Para estudiar los diferentes fragmentos sintetizados en los cuatro


tubos de reaccin se desnaturalizan y se realiza una electroforesis en
gel de poliacrilamida. Cada disolucin se aade a diferentes carriles
en el gel y se deja correr la electroforesis, as las muestras se separan
segn el tamao y tipo de nucletido en cada pocillo. La lectura del
gel se comienza desde arriba que sera el extremo 3 (fragmentos ms
pequeos) hasta abajo, que corresponde al extremo 5 (fragmentos
MTODO DE SECUENCIACIN SANGER

ms grandes). Esto nos proporciona la lectura correcta de la


secuencia de ADN. (Galera, 2014; Gobernado, 2013).

Se asla y se clona el ADN que se desea secuenciar, este ADN se


desnaturaliza y se emplea una sola hlice en la secuenciacin. En la
secuenciacin se utiliza un cebador o primer marcado
radiactivamente que suministra el extremo 3OH que necesita la ADN
polimerasa. Se preparan cuatro tubos de reaccin, cada uno con el
ADN molde de hlice sencilla que se desea secuenciar, con ADN
polimerasa, con el cebador marcado y con los cuatro nucletidos
trifosfato. A cada tubo se le aade una pequea proporcin de un
didesoxinucletido trifosfato , un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el
tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos
se producirn cadenas de ADN de distintas longitudes, terminando
todas en el lugar en el que se incorpor el dideoxi correspondiente
aadido al tubo. Posteriormente, estas piezas de ADN se separan
mediante electroforesis vertical en geles de acrilamida. Las piezas
ms pequeas migran ms rpidamente que las grandes y la
secuencia se puede leer directamente sobre el gel de acrilamida.

autorradiografa del gel de secuenciacin:


MTODO DE SECUENCIACIN SANGER

En este tipo de geles pueden leerse hasta 300 bases. (Rodrguez,


2015)

Usos
o Con la secuenciacin de Sanger se obtiene secuencias de alta calidad
para segmentos relativamente largos de ADN (900900900 pb).
o Es muy utilizada para secuenciar fragmentos individuales de ADN,
plsmidos bacterianos, o ADN copiado por PCR.

Ventajas
o Las reacciones de secuencias se realizan en unas horas.
o Reacciones ms puras, con menos contaminantes que afecten
la resolucin del gel.

Limitaciones
o Surgen algunos problemas de secuenciacin con este mtodo en el
que se puede presentar uniones no especficas del cebador al ADN,
afectando la correcta interpretacin de la secuencia de ADN. Adems
el ADN exgeno o inhibidores de la ADN polimerasa puede afectar la
reaccin.
o Este mtodo de secuenciacin es ineficiente para proyectos a gran
escala y a su vez resulta muy costoso.

BIBLIOGRAFA
MTODO DE SECUENCIACIN SANGER

De Necochea, R., & Canul, J. (2004). Secuenciacin de cidos


Nucleicos. Instituto de Biotecnologa UNAM.

Galera, A. (2014). Mtodo de Sanger: Secuenciacin tradicional.


Recuperado de:
http://elguardiandeloscristales.com/wordpress/metodo-de-sanger-
secuenciacion-tradicional/. (Consultado: 01/07/2017)

Gobernado, I. (2013). Secuenciacin de Exoma Completo en Trastorno


Bipolar autosmico dominante: Afectacin del Gen Period3- Ritmo
Circadiano. Universidad Alcal.

Pea, J., Gregorio, O., & Barrera, B. (2013). Los mtodos


experimentales que permiten el estudio de las macromolculas de la
vida: historia, fundamentos y perspectivas. Educacin qumica, 24(2),
237-246.

Rodrguez, G. (2015). Secuenciacin automtica de ADN. Recuperado


de: http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm#sanger. .
(Consultado: 01/07/2017)

Secuenciacin de ADN. (2017). Disponible en:


https://es.khanacademy. Org/science/biology/biotech-dna-
technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/ha/dna-sequencing