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FICHE N°9 Extraction de chlorophylle et séparation des composants de la chlorophylle brute

Cette manipulation courante en SVT, trouve sa place dans cet enseignement comme un exemple de préparation d’un extrait : la chlorophylle brute. Elle est complétée par une manipulation un peu moins courante trouvée sur le site http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle qui permet de séparer les composants de la chlorophylle.

1- Rôle des pigments chlorophylliens en cosmétologie

La chlorophylle dite brute contient des chlorophylles a et b, des carotènes et de la xanthophylle

1-1-Effets cosmétiques des pigments de la chlorophylle Beaucoup de produits cosmétiques contiennent de la chlorophylle, surtout des produits naturels : on lui prête des effets rafraichissants, tonifiants, stimulants, antioxydantes, antiâge… mais nous n’avons trouvé aucune trace de recherche prouvant les effets de la chlorophylle. Cet actif embrouille le consommateur qui l’associe au vert, au naturel… En revanche l’action anti-oxydante des caroténoïdes et des xanthophylles est bien documentée (exemple de référence http://www.sfa-site.com/?q=ingredients_rech/Peau&page=4). Beaucoup ,de travaux portent sur leurs effets in vivo car ils sont utilisées dans ce qui est appelé « Nutricosmétiques », « les cosmétiques de l’intérieur », comme accélérateur de bronzage, anti-

1-2-Les pigments comme colorants dans les cosmétiques De nombreuses substances naturelles sont utilisées dans les cosmétiques. Les chlorophylles, caroténoïdes et xanthophylles sont des colorants utilisés en cosmétologie.

Colorants naturels

 

E

100

Curcumine

E

101

Lactoflavine (riboflavne)

E

120

Cochenille, Acide carminique

E

121

Oseille, orcéine

E

140

Chlorophylles

E

14

Complexes cuivriques des chlorophylles et chlorophyllines

E

150

Caramel

E

153

Carbo-indecinalis vegetalis

E

160

Caroténoïde

E

161

Xantophylles

E

162

Rouge de betterave, bétanine

E

163

Anthocyanes

Tiré de : http://www.dermaptene.com/les-lexiques/1-allergologique/484-colorants-alimentaires-et- pharmaceutique Plusieurs articles signalent la possibilité de toxicité des xanthophylles dans les aliments.

2- Extraction de la chlorophylle

Ci-dessous un résultat d’extraction de chlorophylle d’épinards. (http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle)

3- Séparation des pigments chlorophylliens par

3- Séparation des pigments chlorophylliens par chromatographie sur couche mince (CCM)

Voir le protocole sur : http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle Images et commentaire de la plaque trouvé sur ce site.

Plaque CCM. Dépôt au capillaire. Taches après élution.

Plaque CCM.

Plaque CCM. Dépôt au capillaire. Taches après élution.
Plaque CCM. Dépôt au capillaire. Taches après élution.

Dépôt au capillaire. Taches après élution.

Analyse de la plaque :

En haut de la plaque, on remarque une tache jaune constituée de carotènes

Puis vient une tache de couleur vert-bleu correspondant à la chlorophylle a.

Puis une tache de couleur vert-jaune correspondant à la chlorophylle b.

Enfin, deux tâches jaunes constituées de xanthophylles (violaxanthine et néoxanthine).

NB : on obtient le même résultat sur du papier de cellulose (papier filtre)

Voir le protocole complet et les résultats sur http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle Ci-dessous quelques extraits

4.1 Matériel et produits

Colonne de chromatographie (ou burette graduée) ,

Coton

Sable grossier

Sable de Fontainebleau (sable fin)

Sucre glace

Pipette

Erlenmeyer ou autre récipient en verre d’environ 100 mL

récipient en verre d’environ 100 mL Éther diéthylique Éther de pétrole 4.2 Protocole Les constituants de

4.2 Protocole

100 mL Éther diéthylique Éther de pétrole 4.2 Protocole Les constituants de l’extrait d’épinard sont

Les constituants de l’extrait d’épinard sont récupérés grâce à la chromatographie liquide sur colonne. Cette technique de purification peut sembler difficile à mettre en œuvre la première fois, mais en respectant bien les différentes étapes décrites, réussir la purification est loin d’être si complexe que ça. Nous verrons ici la purification avec du sable de Fontainebleau et, chose rare, du sucre glace !

La chromatographie liquide sur colonne (CLC) nécessite l’emploi d’une colonne de verre, d’une longueur d’une trentaine de centimètres, si possible munie d’un robinet à son extrémité inférieure. Si la colonne n’a pas de robinet, on peut fixer à son extrémité un tuyau muni d’une pince de Mohr.

Colonne sans robinet. Colonne avec pince de Mohr.
Colonne sans robinet. Colonne avec pince de Mohr.

Colonne sans robinet. Colonne avec pince de Mohr.

Préparation de la colonne

Préparer 400 mL d’éluant : mélange de solvants éther de pétrole/éther diéthylique (60/40 en volume)

Fixez la colonne en deux points à un support fixe.

Remplir la colonne de sable de Fontainebleau sur environ 20 cm de hauteur.

la colonne en deux points à un support fixe. Remplir la colonne de sable de Fontainebleau
Colonne fixée. Colonne remplie de sable.

Colonne fixée.

Colonne fixée. Colonne remplie de sable.

Colonne remplie de sable.

Videz la colonne dans un bécher de 400 mL.

Replacez la colonne sur son support et placer un peu de coton en bas de colonne puis le recouvrir d’une couche d’environ 1 cm de sable.

Ajoutez environ 10 cm de l’éluant et chassez les bulles d’air en tapotant légèrement la colonne à l’aide d’un objet quelconque en caoutchouc (une gomme fait très bien l’affaire).

Ajoutez environ 200 mL d’éluant dans le bécher contenant le sable. Bien agiter pour obtenir un gel un peu visqueux.

Versez doucement ce gel dans la colonne. Chassez les bulles d’air en tapotant la colonne.

Rajoutez si besoin de l’éluant dans la colonne de façon à ce que le haut de la couche de sable ne soit jamais sec. Laisser environ 2 cm de solvant au-dessus du sable de Fontainebleau.

Déposez doucement environ 1 cm de sable grossier sur le sable de Fontainebleau.

 
Sable et solvant mélangés.

Sable et solvant mélangés.

Solvant au dessus du sable.

Solvant au dessus du sable.

 
Sable dans un bécher.

Sable dans un bécher.

Sable dans un bécher.

Sable grossier ajouté dans la colonne.

   

4.2.2 Purification sur la colonne de sable [3]

Laissez le solvant s’écouler jusqu’à atteindre la couche de sable grossier.

Prélever la solution d’extrait d’épinard dans le dichlorométhane à l’aide d’une pipette et la déposez goutte à goutte sur tout le pourtour interne de la paroi. Ne pas déposer la solution directement sur le sable.

Laissez s’écouler un peu de solvant pour faire pénétrer l’extrait dans le sable.

Rajoutez à la pipette (toujours sur le pourtour de la colonne) de l’éluant propre.

Laisser couler le solvant en en rajoutant régulièrement de l’éluant en haut de colonne afin que celle-ci ne soit jamais sèche.

Solvant affleurant la couche de sable grossier. Extrait en début de colonne. Ajout de solvant.
Solvant affleurant la couche de sable grossier. Extrait en début de colonne. Ajout de solvant.
Solvant affleurant la couche de sable grossier. Extrait en début de colonne. Ajout de solvant.

Solvant affleurant la couche de sable grossier. Extrait en début de colonne. Ajout de solvant.

Observez les couleurs qui semblent avancer sur le sable.

Les substances sont séparées dans le même ordre qu'en CCM. Belle séparation de toutes les

Les substances sont séparées dans le même ordre qu'en CCM.

Les substances sont séparées dans le même ordre qu'en CCM. Belle séparation de toutes les couleurs.

Belle séparation de toutes les couleurs.

Récupérer les différentes fractions dans des erlenmeyers, ou tout récipient en verre, en

fonction de la couleur du coton en bas de colonne. On obtient ainsi les carotènes, la chlorophylle a, la chlorophylle b et les xanthophylles.

Fraction jaune : Fraction bleu-verte : Fraction verte : Fraction jaune : carotènes. chlorophylle a.
Fraction jaune : Fraction bleu-verte : Fraction verte : Fraction jaune : carotènes. chlorophylle a.
Fraction jaune : Fraction bleu-verte : Fraction verte : Fraction jaune : carotènes. chlorophylle a.
Fraction jaune : Fraction bleu-verte : Fraction verte : Fraction jaune : carotènes. chlorophylle a.

Fraction jaune :

Fraction bleu-verte :

Fraction verte :

Fraction jaune :

carotènes.

chlorophylle a.

chlorophylle b.

xanthophylles.

Ensemble des fractions récupérées. En évaporant une partie du solvant, on obtient des solutions concentrées

Ensemble des fractions récupérées.

En évaporant une partie du solvant, on obtient des solutions concentrées de ces molécules.

on obtient des solutions concentrées de ces molécules. Solutions concentrées dans l'éther, de gauche à

Solutions concentrées dans l'éther, de gauche à droite : carotènes, chlorophylles a, b, xanthophylles.

4.2.3 Purification sur colonne de sucre [4]

Préparez la colonne de la même façon que précédemment en remplaçant le sable de Fontainebleau par du sucre glace.

Déposez l’extrait et réalisez l’élution comme précédemment.

CLC sur sucre glace. Séparation. Séparation.

CLC sur sucre glace.

CLC sur sucre glace. Séparation. Séparation.

Séparation.

CLC sur sucre glace. Séparation. Séparation.

Séparation.

On peut donc de la même façon que précédemment récupérer les différentes fractions composant l’extrait dans des récipients en verre. On retrouve les carotènes (jaune), les chlorophylles a et b (respectivement vert-bleu et vert-jaune) et la violaxanthine (jaune, très peu visible sur le sucre). Et ceci grâce à du sucre glace.

5 Explications

5.1 Plusieurs couleurs pour un même composé !

5.1 Plusieurs couleurs pour un même composé !
Extrait vu à la lumière naturelle. Extrait éclairé par UV.
Extrait vu à la lumière naturelle. Extrait éclairé par UV.

Extrait vu à la lumière naturelle. Extrait éclairé par UV.

La même expérience peut être réalisée sur les différentes fractions après chromatographie : Sous lumière
La même expérience peut être réalisée sur les différentes fractions après chromatographie :
Sous lumière naturelle, de gauche à droite (dans l’éther) : carotènes, chlorophylles a, b,
xanthophylles.
Sous UV, de gauche à droite (dans l’éther) : carotènes, chlorophylles a, b, xanthophylles. Les

Sous UV, de gauche à droite (dans l’éther) : carotènes, chlorophylles a, b, xanthophylles.

Les carotènes ne sont pas fluorescents et les xanthophylles ne le sont que très peu, du moins dans la longueur d'onde utilisée ici.

5.2 Extraction et séparation

Les solvants employés lors de l’extraction ne dissolvent pas que les chlorophylles mais également d’autres pigments. Pour obtenir les chlorophylles pures, il faut séparer le mélange par chromatographie.

Cette technique est basée sur les différentes interactions entre une molécule, un support solide et un solvant. Le solide est du sable, donc de la silice qui présente à sa surface de nombreux groupes hydroxyles (-OH) qui vont interagir avec les molécules dissoutes dans un solvant. Le sucre en poudre (saccharose) peut jouer le même rôle en raison de ses nombreux groupes hydroxyles disponibles.