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Fluorimetra
Fluorescencia es la emisin de radiacin, por
electrones excitados de compuestos que han
previamente absorbido radiacin y que de
esta manera vuelven a su estado basal.
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Los compuestos que fluorescen son aquellos
FLUORIMETRA que tienen enlaces mltiples conjugados con
electrones p deslocalizados.

Se utilizan dos tipos de aparatos.

Fluorocromos
FLUORMETRO: emplea filtros de vidrio o filtros de interferencia para
seleccionar la longitud de onda de excitacin y de emisin.
ESPECTROFLUORMETRO: emplea prismas o redes de difraccin para
seleccionar las longitudes de onda.

Ambos aparatos tienen como componentes bsicos:

Fuente de energa radiante: son dos lmparas de arco de Xenn o
lmparas de Mercurio. Emiten energa radiante de intensidad
elevada.
Rendijas de entrada y salida (igual que en el espectrofotmetro)
Monocromadores: pueden ser filtros o prismas o redes de difraccin.
Hay dos monocromadores

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Monocromadores de excitacin o primario, que

selecciona las longitudes de onda de excitacin.

Monocromadores de emisin o secundario, que

Equipo cuvetas selecciona la longitud de onda de emisin antes que la
luz llegue al detector.

Cubetas: son de slice o cuarzo, con sus cuatro caras

transparentes.
Detectores: son fototubos multiplicadores. Amplan la
pequea seal fluorescente pudindola cuantificar.
Son muy sensibles.
El monocromador secundario y el detector estn situados en
ngulo recto en relacin al haz de luz incidente para impedir
que la luz procedente de la lmpara llegue al detector.

Fluormetro

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Espectrofluormetro
CARACTERSTICAS DE LA FLUOROMETRA

Tiene una muy alta sensibilidad. Es de 100 a 1000

veces ms sensible que las tcnicas colorimtricas
normales.

Las medidas de fluorescencia se expresan en unidades

de intensidad relativa, se emplea lo que se llama
Rendimiento de Fluorescencia Relativo.

APLICACIONES Fluorocromos

FLUOROINMUNOANLISIS: son anticuerpos

marcados con una sustancia fluorescente,
especficos de la sustancia que se va a estudiar.
Citometra de flujo

DETERMINACIN de vitaminas, frmacos, algunas

enzimas, etc.

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CATECOLAMINAS EN ORINA

Acd. Vanil mandelico: 35 mg/da (0.0 - 5.0)

Catecolaminas libres: 882 ug/da (10 - 100)
Adrenalina: 109 ud/da (0 - 20)
Noradrenalina: 773 ug/da (10 - 70)
Dopamina libre: 375 ug/da (100 - 400)

Microscopia
fluoroscencia

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Micrografias de clulas en divisin, tomadas

con un microscopiode fluorescencia.

Se emplearon tres fluorocromos: DAPI

Inmunoensayos
(emite luz azul) para marcar cromosomas,
GFP (protena verde fluorescente
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intracelular que emite luz verde) y
rodamina (luz roja) para marcar
microtbulos.
Cada fluorocromo amerita el uso de filtros
especficos, dependiendo de la longitud de
onda necesaria para su excitacin, sealada
arriba y a la izquierda en cada imagen y
expresada en nm

Inmuno-ensayos
Tcnicas analticas cuantitativa basadas en la
reaccin de afinidad entre Anticuerpo-
Antgeno
Tipos de unin:
Mltiples enlaces no covalentes con el antgeno
Puentes de hidrgeno.
Uniones electrostticas.
Fuerzas de Van der Waals.
Enlaces hidrofbicos.
Enlaces hidrofbicos

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Tipos de inmunoglobulinas Caractersticas de la tcnica

Alta sensibilidad
Especificidad
Cuantifica compuestos en fluidos, que se
encuentran a muy bajas concentraciones
(ng/ml, pg/ml, fmol/ml).

Afinidad Afinidad

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Avidez Clasificacin de inmunoensayos

Criterios

vDiseo (competitivo o no competitivo)

vSeparacin(homogneos y heterogneos)
vPor el mtodo de deteccin

Tipos de inmunoensayos Segn el diseo del ensayo

Dependiendo del tipo de marca:

De reactivo limitado o competitivos
Marca utilizada Tipo de inmuno ensayo
(inmunoensayos propiamente dichos)
Istopo radioactivo radioinmunoensayo
Enzima Enzimoinmunoanlisis
Fluorescencia fluoroiunmunoanlisis
De reactivo en exceso o no
Quimioluminiscencia Ensayo unmunoquimioluminiscente
competitivos (ensayos
inmunomtricos)

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Ensayos con marca enzimtica Tcnicas de Inmunoensayo

Generacin de la seal
Homogneas y Heterogneas
La ltima parte de un inmunoensayo en que la marca es
A las tcnicas de inmunoensayo que requieren la
enzimtica es la cuantificacin de la enzima. separacin del complejo unido Ab-Ag* se las conoce
Mtodos de deteccin: como inmunoensayos heterogneos.
a) Espectrofotomtrico o colorimtrico. Se mide la
aparicin de un cromforo. Aquellas que no requieren separacin se denominan
b)Fluoromtrico- Se mide la aparicin de un producto inmunoensayos homogneos.
fluorescente

c)Quimioluminiscente- Se mide la aparicin de un producto

luminiscente.

Las tcnicas homogneas generalmente se

han aplicado a la medicin de pequeos Reactivo de
Tcnica Homognea
Anticuerpo de Fase Se mide el
analitos como por ejemplo las drogas de Slida (]-Ab) complejo Ab-Ag

abuso y teraputicas. Muestra (Ag) Tcnica Heterognea Aislar y Lavar el Complejo ]-

Ab- Ag- Ab*

Debido a que las tcnicas homogneas no Reactivo de Anticuerpo

Marcado (Ab*)
requieren la separacin de la unin Ab-Ag*
del Ag* libre, generalmente son ms fciles y
ms rpidas de realizar.

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Heterogneos

heterogneos: los ms utilizados , utiliza pasos de Ventajas :

separacin del antgeno. Menos interferencias, ms especficos y
Ejemplos: sensibles
ELISA, partculas magnticas, Instrumentacin menos costosa
membranas de nitrocelulosa, IFD, IFI, centrifugacin, precipitacin Admiten mayor tamao de muestra, as
disminuye el lmite de deteccin.
Ms verstiles en cuanto a tipo de analito
ensayos homogneos: sin pasos de separacin
Ejemplos: aglutinacin de ltex, FPIA; EIA homogneos
Desventajas :
Ms difciles de automatizar
Mayor tiempo de anlisis

Homogneos:
Reconocimiento inmunoqumico

Ventajas Ms precisos
En general automatizados, se llevan a cabo sin
entrenamiento especial
Seal fsica detectable
Desventajas:
Son ms costosos en reactivos
Cortas incubaciones
En general slo sirven para frmacos No errores por la separacin
Puede haber efecto de la matriz

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Ensayo competitivos inmunoensayo competitivos

Equilibrio

Ag = antgeno
Ag*= antgeno marcado (radioistopo)
Ac= anticuerpo ( concentracin limitante)
Ag-Ac= complejo antgeno-anticuerpo
Los ensayos competitivos pueden ser de un paso o de dos pasos
Ka= constante de asociacin
Kd= constante de disociacin

Mientras mayor sea la concentracin de antgeno en la muestra del paciente , mayor Ensayo competitivo de
ser la unin del antgeno no marcado al anticuerpo un paso

inmunoensayo competitivos Inmunoensayo No Competitivo

Antgeno del paciente Tipo Sandwich
En este tipo de ensayo se marca el anticuerpo
El anticuerpo se agrega en exceso
Ensayo competitivo
La muestra reacciona con 2 anticuerpos distintos
de dos de pasos
Ambos anticuerpos se unen a la muestra, se unen 2 sitios distintos
doble reconocimiento , mayor sensibilidad.

Ag + Ac* + Ac Ac-Ag-Ac* + Ac*

1. Se adiciona antgeno del paciente al Uno de los
anticuerpos se
anticuerpo especfico encuentra unido a
2. Luego se adiciona el antgeno marcado. una fase slida

La concentracin de antgeno est

inversamente relacionada a la concentracin
de marca (seal) en formatos competitivos

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Inmunoensayo No Competitivo

El formato no competitivo de dos pasos

generalmente ofrece la mayor especificidad y
sensibilidad.

La concentracin de antgeno es directamente

proporcional a la concentracin de marca
(seal) en los formatos no competitivos

Radioinmunoensayos Tipos de emisiones radioactivas

RIA (Radio Immuno Assay; Radio Inmuno Anlisis Alfa: partcula pesada que corresponde al ncleo de helio con
IRMA (Immuno RadioMetric Assay, ensayo inmunoradiometrico) doble carga.

Utilizan radioistopos Beta: partcula del ncleo con la misma carga que un electrn
ej titrio.

Gama: radiacin electromagntica, originada en el nucleo

producida por cambio en el estado de energa

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RIA RIA
Ensayo competitivo
Unin especfica
Sensibilidad dada por la utilizacin de
radioistopos.
El anticuerpo est en concentracin limitante
Cuantitativo, curva de calibracin estndar.

Curva de calibracin Confeccin de curva estndar

Se realiza con estndares de Parmetros a considerar
concentraciones conocidas y
Unin inespecfica (NSB):concentracin de Ag*
crecientes que se ponene en
que se une a otra molcula inespecficamente en
contacto con la misma cantidad de
ausencia de anticuerpo.
Ag* (hormona*) y anticuerpo que
esto se debe q ue no es posible separar totalmente la
la muestra a analizar.
fraccin libre de la fraccin unida.
A medida que se aumenta la
concentracin de Ag estndar
menos cantidad de Ag* se une al
unin mxima (Bo): es la cantidad de Ag* que se
anticuerpo , por lo que disminuye
une al anticuerpo en ausencia de Ag fro.
la radioactividad

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Validacin de un anticuerpo

En RIA se utiliza anticuerpo tal que una entre 30-60% del antgeno marcado

Mtodos de separacin de la fraccin

Tipos de radioinmunoensayos libre y unida
Mtodo de equilibrio El mtodo de separacin ideal ser aquel que:
Se realiza una sola incubacin entre Antgeno marcado
y fro con el anticuerpo compitiendo por la unin . Consiga una completa separacin de las fracciones ligada y libre.

Mtodo de no equilibrio No est influenciado por el suero u otra sustancia no especficas.

Mtodo secuencial : incubacin del antgeno fro con el Sea reproducible, sencillo, barato y tcnicamente rpido.

anticuerpo en exceso y luego se aade el Ag marcado. No interfiera con la reaccin Ag-Ac.

Mtodo de desplazamiento: se incuba el antgeno

marcado con el anticuerpo y luego se agrega Ag fro
que desplaza al Ag* del complejo

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Mtodos de separacin de la fraccin libre Mtodos de separacin de la fraccin libre

y unida 1. y unida. 2
Adsorcin de antgeno libre Precipitacin del complejo
Carbn activado cubierto con dextran Sulfato de amonio
La adsorcin depende del pH, tiempo de incubacin y PEG
la temperatura.
Etanol
La fraccin libre se une al carbn activado
El dextrano evita que se una el complejo al carbn
Doble anticuerpo
activado. Protena A
Separacin por centrifugacin
Lectura fraccin unida contador de centelleo

Mtodos de separacin de la fraccin libre

y unida. 3
Mtodo de separacin en fase slida
El complejo es unida a fase slida
No requiere centrifugacin
Factores que influyen en el RIA
pH : pH extremos disocian el complejo
Fuerza inica: concentraciones de sales disocian el

Solo se debe lavar para eliminar la fraccin libre complejo Buffer es importante

Temperatura: mejor unin a 4C por incubaciones

prolongadas

Anticoagulantes: pueden inhibir la formacin del complejo

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Criterios de validez del RIA Precisin

Exactitud
Grado en que una serie de medidas de una misma muestra difieren de la
Precisin media

Especificidad Se expresa como CV (coeficiente de variacin), y debe ser estudiada a

diferentes niveles de la curva.
Sensibilidad Reproductibilidad intraensayo: se acepta 5-10%
Reproductibilidad interensayo: se acepta 5-15%

Exactitud
Especificidad
Grado en que una cantidad medida corresponde con la cantidad presente en
la muestra. Capacidad de discriminar entre 2 compuestos
Se hacen 2 estudios: similares
1. Recuperacin : se evalan rangos crticos del ensayo (bajo , medio, alto).
a un suero libre de sustancia o de concentracin conocida se le aaden
concentraciones crecientes de la sustancia pura, se realiza el RIA y se calcula la Para mejorar la especificidad en el RIA :
concentracin esperada.
Purificar la muestra previamente al ensayo por extraccin
con solventes, cromatografa u otra.

Bloquear los anticuerpos menos especficos con una

2. Paralelismo: la conducta inmuno-qumica de los Stds y las muestras debe ser
sustancia incluida en el antisuero que produzca reactividad
idntica. cruzada.
se realizan diluciones seriadas de la muestra para luego hacer el RIA. Si las curvas
son iguales o paralelas el anticuerpo reconoce al Std igual que a la muestra . Si no
lo son existen sustancias contaminantes y se debe purificar.

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Sensibilidad
La sensibilidad analtica es la ms pequea cantidad de antgeno (Ag) no marcado que
puede ser distinguida del estndar cero (0).
Es el lmite de deteccin del ensayo y se determina calculando la precisin del
estndar cero, se procesa 20 veces y se calcula la media y tres desviaciones estndar
(SD o DE) de las cuentas por minuto (cpm) del estndar de concentracin cero. La La sensibilidad funcional es la menor concentracin que un ensayo es capaz de
sensibilidad depende de : detectar con un coeficiente de variacin inter-ensayo del 20%.
La afinidad del anticuerpo por el Ag, ya que la mnima concentracin de Ag
detectable se aproxima al recproco de la constante de afinidad.
La actividad especfica de Ag marcado.
El volumen medio de incubacin, el pH del medio y la T de incubacin.
La precisin del anlisis.
La realizacin de anlisis en 2 etapas.

Equipo de medicin
Contador de centelleo gama
Utiliza un cristal de Ioduro sdico activado con
talio
Cuando el cristal absorbe radiacin ionizante
genera un pulso de luz de corta duracin.
El pulso es una medida de la frecuencia de la
desintegracin isotpica (dpm)
Los pulsos de luz son detectados por un
fotomultiplicador y aumentados 105-108 veces
(cpm).

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Control de calidad
Fondo
contador gama
Fondo
Precisin El conteo de un tubo vaco debe dar menos de 70 cpm.
Un conteo de fondo alto indicara contaminacin de la fuente de istopos, vial o
Eficacia tubo contaminado, situacin inapropiada del contador o posibles fallos en el
componente electrnico.

Precisin IRMA
Ensayo no competitivo
El contador debe ser reproducible y para ello el CV de una muestra contada 20 Ms sensible y preciso que el RIA
veces debe ser menor al 1%

La radioactividad de la fraccin unida es

directamente proporcional a la concentracin
del analito en la muestra.

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IRMA IRMA unido a partculas

No competitivo tipo sandwich

Control en los Inmunoensayos Control en los Inmunoensayos

Este tipo de grfico traza los valores del control e indica si se estn

desarrollando posibles tendencias al respecto. Si los controles tienden a

subir o bajar (o por el contrario se comportan de una manera no

aceptable), probablemente indica algn problema del reactivo, la

calibracin, o el analizador que puede estar afectando los resultados de un

paciente de una manera similar.

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Interferencias en los Ensayos
Los inmunoensayos de un paso pueden tener tendencia a las
interferencias que afectan tanto la sensibilidad como la
especificidad. En la mayora de los casos las interferencias se
deben a agentes que interfieren en la unin de anticuerpos
con antgenos por varias razones.
Efecto Hook
IRMA
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Interferencias en los Ensayos
efecto Hook
La posibilidad de que exista un efecto hook en
concentraciones elevadas es un fenmeno inherente a los
diseos de los ensayos sndwich de un paso, tambin se
denomina efecto prozona.
Las concentraciones muy elevadas de antgeno en la muestra del
paciente se unen a todos los sitios disponibles saturndolos, tanto
en el anticuerpo- fase slida como en el anticuerpo- conjugado
marcado y as evitar la formacin sndwich.
Interferencias en los Ensayos
anticuerpos Humanos Anti-Ratn (HAMA)
Interferencia en los inmunoensayos es la presencia de anticuerpos
humanos anti-ratn (HAMA).
respuesta inmunolgica del cuerpo al estar expuesto a antgenos de
ratn.
Las muestras de pacientes que contienen HAMA pueden producir
resultados falsamente elevados (falso positivo) o reprimidos (falso
negativo) en los inmunoensayos que utilizan anticuerpos
monoclonales de ratn. Los ensayos sndwich por lo general son los
ms susceptibles a la interferencia HAMA.
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HAMA falso positivo
HAMA se une tanto al anticuerpo de captura de fase slida como al reactivo de
anticuerpo marcado. Por lo tanto parece como si el analito estuviese presente en la
muestra del paciente, causando el complejo.
Los fabricantes utilizan varias tcnicas para minimizar el impacto de HAMA
incluyendo:
Diseo real de dos pasos para eliminar las interferencias
Bloqueadores para reducir o eliminar las interferencias ocupando los puntos
de unin en los anticuerpos HAMA.
Los bloqueadores son nicos para la formulacin de cada ensayo y algunos
ejemplos pueden ser detergentes, protenas depuradas y suero animal
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HAMA falso negativo
HAMA puede provocar resultados del ensayo falsos negativos por medio de dos
mecanismos: unindose y bloqueando al anticuerpo de captura de fase slida, o
unindose y bloqueando al reactivo de anticuerpo marcado.
RIA e EIA
RIA: se usa particularmente para la deteccin de cantidades muy
bajas de analitos.
Sin embargo, debido a las complicaciones inherentes a la
manipulacin y desecho de los materiales radioactivos en el
laboratorio clnico, se usa con menos frecuencia que otro tipo
diferente de inmunoensayo, denominado inmunoensayo
enzimtico (EIA).
En EIA, las marcas de las enzimas se usan en lugar de las marcas
radioactivas.
Las marcas tpicas de enzimas son la fosfatasa alcalina, peroxidasa
de rbano picante, y la galactosidasa B.
Mientras que RIA usa radioactividad para medir la concentracin de
analito, EIA tpicamente usa un cambio de color, emisin de luz, u
otra seal.
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EIA ELISA
ELISA, o Enzimo-inmunoensayo, representa una aplicacin popular del Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
inmunoensayo sndwich heterogneo de fase slida que combina un
reactivo marcado enzima-anticuerpo con un anticuerpo unido a una fase La prueba de ELISA es una tcnica que
slida. permite tanto la valoracin de antgenos
Un ensayo ELISA es un tipo de EIA. como de anticuerpos.
Inicialmente, se utilizaban como material de base slida tanto las placas
de microtitulacin como las esferas de 1/4 de pulgada.
Una placa de microttulo es simplemente una placa plstica cuadrada con
pocillos de poca profundidad recubiertos con un analito.

ELISA
Basado en:
Interaccin Antgeno-Anticuerpo
Elevada especificidad de los Anticuerpos
La alta actividad de algunas enzimas

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Elisa Competitivo

VIDEO de ELISA

Antgeno/Anticuerpo marcados con una enzima

Conjugado con actividad inmunolgica y enzimtica.

http://www.abnova.com/abvideo/Indirect-ELISA.html
Actividad enzimtica sobre el substrato= cambio
de color
Espectrofotmetro colormetro

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Test ELISA - HETEROGNEOS Lector de placas

Deteccin de Antgenos Deteccin de Anticuerpos

ELISAs sndwich ELISAs indirectos

Anticuerpos marcados

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