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Obtencin de xilitol
a partir de licores
sulfticos residuales
M A. Crespo, J. R. Alvarez y S. Luque
Dpto. de Ingeniera Qumica y Tecnologa del Medio Ambiente
Universidad de Oviedo
Ingeniera Qumica
www.alcion.es
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Biotecnologa
Los licores sulfticos estn cons- muestra una estimacin econmica una disminucin de la viscosidad y
tituidos principalmente por ligno- preliminar del proceso global. en mayores flujos de permeado.
sulfonatos, azcares, sales y agua. Esto, unido a que su vida til es
Su composicin, que es muy varia- mayor que la de las membranas or-
2. Pretratamiento de
ble, depende de la especie de ma- gnicas, explica que actualmente
dera, del proceso de coccin y de la los licores sulfticos se est implantando la utilizacin
eficacia de las etapas de lavado de de membranas inorgnicas en los
la pasta de celulosa [11]. El residuo Para conseguir una elevada pro- procesos de fraccionamiento de los
slido de los licores procedentes de ductividad en el proceso fermenta- lignosulfonatos presentes en los li-
la coccin de madera dura contiene tivo, es necesario realizar un pre- cores sulfticos [17-18], aun siendo
aproximadamente un 45% de lig- tratamiento de los licores sulfti- su coste mayor.
nosulfonatos, 24% de azcares (de cos. El objetivo de sta es eliminar
los cuales un 80% es xilosa), los principales inhibidores de la El diseo se ha realizado consi-
17,5% de cido actico, 1,5% de fermentacin, aumentar la concen- derando que se va a tratar la canti-
furfural y 12% de otros compuestos tracin de xilosa y ajustar el pH y dad total de licores sulfticos dilui-
[12]. La carga contaminante de es- la temperatura a las condiciones dos (en torno a 2.000 m3/da) gene-
tos licores es muy elevada, y su ptimas de fermentacin. rados en una planta de produccin
aprovechamiento mediante com- de pasta de papel de tamao medio
bustin no es sencillo debido a la La variedad de inhibidores pre- [13]. Estimando una velocidad de
presencia de azufre y la subsiguien- sentes en los licores sulfticos es permeacin (J) medio de 300 L/(h
te contaminacin atmosfrica por amplia: productos derivados de la m2) y un coeficiente de retencin
la produccin de SO2. Por ello, se degradacin de ligninas (lignosul- del 95% para los lignosulfonatos y
han buscado alternativas, viables fonatos, compuestos fenlicos, ci- nulo para la xilosa, se precisa un
tcnica y econmicamente, para la dos aromticos y aldehdos), de rea total de 40 m2. Para una ope-
recuperacin de fracciones de inte- extractos (cidos orgnicos) o de racin en continuo es necesario au-
rs. Entre estas alternativas destaca hemicelulosas (cido actico, fur- mentar el rea de membrana hasta
la recuperacin de lignosulfonatos, fural e hidroximetilfurfural); sulfi- 44 m2, para as compensar las dos
fraccin con mercado propio utili- tos y metales procedentes de la co- horas diarias de limpieza estima-
zada en la fabricacin de aglome- rrosin de los equipos [9]. De entre das para una correcta operacin
rantes y surfactantes, ya implanta- stos, se han de eliminar los que (Fig. 1). Los mdulos cermicos
dos desde hace aos en el mercado, tienen un mayor efecto en el pro- seleccionados tienen un rea de
con un volumen de ventas impor- ceso fermentativo por sus caracte- 0,85 m2, requerindose, por tanto,
tante [11,13-14]. rsticas txicas y su elevada con- 52 mdulos.
centracin: lignosulfonatos, cido
La fermentacin de licores sul- actico y furfural. El retenido de la etapa de ultra-
fticos para la obtencin de xilitol filtracin se puede llevar a un pro-
supone el aprovechamiento de los Los lignosulfonatos tienen un ceso de recuperacin de lignosul-
azcares presentes en esta corrien- peso molecular elevado, entre uno fonatos, ya que stos tienen merca-
te y la reduccin de su carga conta- y tres rdenes de magnitud mayor do propio como aglomerantes y
minante. Adems, al tratarse de que el de la xilosa y el resto de az- surfactantes. Adems, se utilizan
una corriente residual su coste es cares [15], por lo que para su eli- en la obtencin de diversos mate-
mnimo, lo que supone una gran minacin se puede utilizar una tc- riales polimricos [11, 13-14].
ventaja frente a las otras opciones: nica de exclusin por tamaos. Se
utilizacin de xilosa pura o hidroli- ha seleccionado la ultrafiltracin, Algunos estudios [7] sugieren
zados de madera. tcnica ya implantada en la indus- una concentracin de xilosa pti-
tria pastero-papelera para el frac- ma en el medio de cultivo elevada,
Por tanto, el diseo preliminar cionamiento de lignosulfonatos entre 50-300 kg/m3, con la finali-
de una planta de obtencin de xili- [16]. La configuracin ms reco- dad de aumentar la productividad.
tol a partir de licores sulfticos pro- mendable es la ultrafiltracin en un Para evitar fenmenos de inhibi-
cedentes de la industria de pasta de solo paso, debido a que permite la cin por elevacin de la presin
celulosa presenta inters econmi- utilizacin de una alimentacin di- osmtica en el caldo de fermenta-
co, tanto por las caractersticas de luida, y con elevada velocidad li- cin se va a considerar que la con-
mercado del producto (elevado va- neal de circulacin, condiciones centracin ptima se encuentra en
lor aadido y demanda creciente), que reducen los problemas ms torno a 150 kg/m3. Para conseguir
como por el bajo coste de la mate- graves de la utilizacin de mem- esta elevacin en la concentracin
ria prima. branas: la polarizacin de la con- de xilosa, el permeado obtenido
centracin y el ensuciamiento. (ya estril) se lleva a unas etapas
En este artculo se presentan los de concentracin por smosis in-
detalles de las tres etapas de que Las membranas seleccionadas versa y evaporacin.
consta el proceso: pretratamiento son cermicas, ya que permiten
de los licores sulfticos, fermenta- operar a las temperaturas a las que En la etapa de smosis inversa,
cin y separacin y purificacin fi- se encuentran los licores sulfticos se pueden alcanzar como mximo
nal del producto. Finalmente, se (80-140C), lo que se traduce en concentraciones en torno al 25% en
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Biotecnologa
Figura 3.
diversos estudios realizados para Diagrama de ratura ptima de fermentacin do un valor de la velocidad espec-
flujo de la
seleccionar levaduras productoras seccin de
30C [21, 25]. fica de crecimiento en estas condi-
de xilitol, se obtiene que las mejo- fermentacin ciones de 0,201 h-1) y un factor de
res productoras son las de los g- En el proceso aqu propuesto, la rendimiento biomasa-sustrato de
neros Candida y Debaryomyces, fermentacin se lleva a cabo en 0,5 g/g [29], que se ha empleado
destacando las variedades Candida seis reactores, de 19 m3 cada uno, para calcular la cantidad de xilosa
tropicalis, Candida guilliermondii, dispuestos en paralelo y operando consumida.
Candida parapsilosis, Candida sp. en semicontinuo, configuracin se-
mutante y Debaryomyces hansenii leccionada para disminuir los efec- Una vez alcanzada una concen-
[7-8, 22]. tos txicos o de inhibicin de sus- tracin celular adecuada (30-34
tancias presentes en el medio de kg/m3), se disminuye la velocidad
De entre stas, se ha selecciona- cultivo (por efecto de la dilucin) de aireacin hasta alcanzar las con-
do la levadura Debaryomyces han- con el objeto de tener un mayor diciones microaerfilas necesarias
senii, ya que su comportamiento control y flexibilidad durante la para la obtencin de xilitol (en tor-
en fermentaciones en medios de operacin. no al 18% de la concentracin de
hidrolizados de madera se ha estu- saturacin). Para mantener durante
diado ampliamente, con resultados La duracin del ciclo fermenta- el mayor tiempo posible una con-
satisfactorios, consiguindose ren- tivo es de 72 horas (incluyendo centracin de xilosa ptima (entre
dimientos del 70-84% [21, 23-24]. operaciones de vaciado, limpieza, 50 y 100 kg/m3), cuando la concen-
En el diseo de la operacin de fer- esterilizacin y llenado del reac- tracin de sta en el reactor dismi-
mentacin utilizando D. hansenii tor). Al iniciarse el ciclo interesa nuye hasta 50 kg/m3 se alimentan
cobra gran importancia la concen- conseguir una elevada concentra- al reactor otros 3.875 m3 de medio
tracin de oxgeno disuelto en el cin celular. Para ello, se introdu- con 150 kg/m3 de xilosa. Este pro-
medio: en condiciones de elevada cen en el reactor 5,95 m3 de licores ceso se repite, y tras esta ltima
aireacin se favorece la formacin sulfticos pretratados (LST) y 1,37 adicin se continua la fermentacin
de biomasa, mientras que en au- m3 de inculo con una concentra- hasta que la concentracin de xilo-
sencia de oxgeno el crecimiento cin celular de 80 kg/m3, y se ope- sa sea de 1-3 kg/m3 (para concen-
est seriamente inhibido y no se ra a elevadas velocidades de airea- traciones de este azcar menores de
produce xilitol. El ptimo se en- cin (12,310-3 kg aire/m3s [26- 5 kg/m3 se observa que las levadu-
cuentra en condiciones de oxigena- 28]). La duracin de esta etapa pre- ras comienzan a utilizar el xilitol
cin limitada o microaerfilas via (algo inferior a 3 h) se ha esti- como fuente de carbono [24]; sin
(menos del 30% de la concentra- mado utilizando el modelo de cre- embargo, conviene reducir aun ms
cin de saturacin de oxgeno). En cimiento exponencial [29] para este valor para facilitar el proceso
cuanto a la temperatura del medio, una duracin de la fase de latencia de purificacin posterior).
la velocidad de fermentacin es despreciable (ya que se parte de
prcticamente constante en un in- una levadura previamente adapta- En el diseo de la etapa de ob-
tervalo 28 a 37C, siendo la tempe- da al medio de cultivo), suponien- tencin de producto se ha utilizado
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el modelo de Monod [30], conside- En primer lugar, es preciso se- opera con alimentacin directa y el
rando el sustrato limitante la xilo- parar las clulas del caldo de culti- vapor se introduce en paralelo. La
sa. Se ha supuesto que los tiempos vo en el momento en que se detie- presin en el tercer efecto es de
de carga del reactor son desprecia- ne la fermentacin. Esta separa- 26,6 kPa. Para conseguir una co-
bles, de modo que el comporta- cin se suele realizar mediante rriente de salida con una concen-
miento del reactor se puede asimi- operaciones de filtracin y centri- tracin en xilitol del 75% en peso
lar al de un reactor discontinuo. Se fugacin, aunque tambin existe la partiendo de 1.541 kg/h de disolu-
ha tomado un valor de la constante posibilidad de utilizar microfiltra- cin con un 10,9% en peso de xili-
de Monod de 74 kg/m3 [31]. El cin. Se ha realiza un estudio com- tol (combinacin de las corrientes
factor de rendimiento biomasa- parativo de las dos primeras alter- de salida de la etapa de centrifuga-
sustrato se ha tomado de 0,12 g/g, nativas, seleccionndose finalmen- cin y de recirculacin de aguas
y el de producto-sustrato de 0,73 te una centrfuga de sedimentacin madres) se requiere un rea de in-
g/g, valores habituales en biblio- de transporte helicoidal, ya que no tercambio en cada efecto de 7 m2 y
grafa [24]. En esta etapa, adems precisa de la adicin de coadyu- un consumo de vapor de 420 kg/h.
de xilitol, se produce etanol como vantes, y se obtiene un lodo con un La corriente de salida del ltimo
subproducto, siendo el factor de contenido en agua en torno al 80% efecto se alimenta a un cristaliza-
rendimiento etanol-sustrato 0.11 en peso, apto para su reutilizacin dor de circulacin forzada.
g/g, valor medio obtenido a partir (se utilizan las levaduras ya adap-
de datos de fermentaciones realiza- tadas como inculo en un nuevo Una propiedad de inters, que se
das por D. hansenii en distintos ciclo de fermentacin) o para su utiliza para aumentar el rendimien-
medios (hidrolizados de residuos procesado en la obtencin de ex- to de la etapa de cristalizacin, es la
de maz, cebada y madera de euca- tracto de levadura para medios de disminucin de la solubilidad que
lipto) [32]. cultivo. En esta etapa se elimina, experimenta el xilitol en presencia
asimismo, la concentracin resi- de alcoholes. A una temperatura de
Con la configuracin y el mode- dual de lignina. 30C, la solubilidad de xilitol en
lo propuestos, se obtiene que la agua es de 68 g/100 g, mientras que
productividad de xilitol en el pro- Con respecto al mtodo de sepa- en una disolucin de etanol al 96%
ceso (sin incluir etapa de obtencin racin del xilitol, mediante cristali- es de 1,2 g/100 g [2]. En el cristali-
de levadura) es de 1,31 g/Lh. La zacin [34], y partiendo de una di- zador se introduce etanol hasta que
concentracin final de xilitol y eta- solucin acuosa con un contenido se alcanza una concentracin de s-
nol en el medio cuyo volumen es en peso en torno al 70-75% de xi- te respecto a la mezcla etanol-agua
14,3 m3- es de 91,2 kg/m3 y 13.6 litol, 5% o menos de xilosa y 20% del 80%. Se ha estimado que, para
kg/m3, respectivamente (se ha teni- de agua, se puede obtener xilitol esta concentracin de etanol, una
do en cuenta que durante un proce- cristalino con una pureza superior temperatura de 30C y teniendo en
so de fermentacin a una tempera- al 99.9%. cuenta la presencia de impurezas
tura de 30 C se evapora en torno a (sales, otros azcares), el valor de
un 5 % del volumen total de me- La corriente del proceso puede la solubilidad resultante es de 9,9
dio) [33]. alcanzar estas especificaciones tras g/100g de disolucin.
una etapa de concentracin en un
En cuanto a la operacin de los evaporador de mltiple efecto, sal- Tras un diseo preliminar, se ob-
seis reactores, se ha configurado vo por la presencia de arabinosa tiene que en el evaporador del cris-
con el objetivo de reducir el volu- (que en principio no supone un pro- talizador se generan 63,6 kg/h de
men de los tanques de almacena- blema, ya que el contenido total de vapor con un contenido en etanol
miento anteriores y posteriores a la arabinosa y xilosa no supera el del 90% (razonable par una con-
fermentacin. Cada doce horas se 1,65% en peso) y la presencia de sa- centracin de etanol en el lquido
carga un reactor, con lo que se con- les, cuyo efecto se reflejara en una en ebullicin del 80% en peso, ba-
sigue que entre dos descargas disminucin de la solubilidad de xi- se etanol-agua). La corriente de sa-
transcurran tambin doce horas y litol [20]. Aunque no hay datos al lida es de 612,5 kg/h, con un total
que stas no se produzcan simult- respecto, se va a considerar que la de 107,7 kg/h de slidos cristaliza-
neamente. pureza del xilitol cristalizado dismi- dos. Se ha estimado que el tiempo
nuye por la presencia de sales, por de residencia requerido en el crista-
La figura 3 muestra el diagrama lo que la pureza que se alcanzara lizador es de cuatro horas [20] y
de flujo de la instalacin de fer- sera del 99,5%. En este caso no se- que, por lo tanto, el cuerpo del cris-
mentacin. ra posible llevar a cabo una etapa talizador ha de tener una capacidad
de preconcentracin por smosis total en torno a los 3 m3 (para una
4. Separacin y inversa debido al elevado contenido ocupacin del lquido del 80%).
en slidos, en torno al 25% en peso,
purificacin del xilitol
de la corriente de entrada. La separacin de los cristales se
realiza mediante una centrfuga de
El objetivo del proceso de sepa- Se ha seleccionado, al igual que transportador helicoidal, ya que es-
racin y purificacin es obtener xi- en la etapa de pretratamiento, un te tipo de centrfuga trabaja en con-
litol cristalino con una pureza su- evaporador de tubos largos vertica- tinuo, con descarga continua de s-
perior al 99,5%. les con tres efectos. El sistema lidos, permite obtener slidos lava-
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dos y, si las caractersticas de stos para el diseo preliminar de co- La cromatografa es un proceso
lo permiten, prcticamente secos. lumnas de destilacin y cambiado- discontinuo, siendo la duracin de
Se va a considerar que la cantidad res de calor [19]. cada ciclo de 5 h y 40 min. El elu-
de licor madre que se pierde adheri- yente utilizado es agua desionizada,
do a los cristales es del 3% (3,23 La columna simulada opera a y en cada ciclo se tratan 20 l de ali-
kg/h) [20] y que la pureza de stos vaco (presin en cabezas: 45 kPa, mentacin junto con 65 l de eluyen-
es del 99,5%. Se obtiene, por tanto, presin en colas: 55 kPa (Tabla I)), te. Se obtienen dos fracciones: la
una corriente de salida de slidos para evitar que se alcancen tempe- fraccin obtenida durante los prime-
con 107,7 kg/h de xilitol cristalino y raturas elevadas en el caldern. Pa- ros 145 min contiene el 96% del to-
3,23 kg/h de licor madre adherido. ra alcanzar el grado de separacin tal de azcares e impurezas y el
La corriente de salida de lquido tie- deseado se ha requerido la utiliza- 1,5% del xilitol total, la fraccin que
ne un flujo de 501,5 kg/h (343,6 cin de una columna con 10 platos, obtenida a continuacin contiene el
kg/h de etanol, 61,0 kg/h de xilitol y con condensador total, una altura resto del xilitol e impurezas, con un
3,1 kg/h de xilosa y arabinosa). de 8.55 m y un dimetro de 0,62 m, flujo total de 293 kg/h, constituida
operando con una relacin de re- principalmente por 232.9 kg/h de
La corriente de salida de lquido flujo de 2. La corriente de colas es agua, 59,7 kg/h de xilitol y 0,14 kg/h
de la centrfuga se lleva a una co- una corriente rica en xilitol, que in- de azcares [5]. Esta fraccin se re-
lumna de destilacin, con el fin de teresa recuperar. circula a la entrada del evaporador
recuperar el etanol (con una pureza de mltiple efecto, mientras que a la
del 90%) y poder reutilizarlo en la Una alternativa en el diseo del corriente rica en azcares se le pue-
etapa de cristalizacin. El diseo proceso consistira en recircular es- den dar otros usos como, por ejem-
de esta columna se ha realizado ta corriente al inicio del ciclo de se- plo, alimento para ganado.
con el programa de simulacin paracin del xilitol. Sin embargo,
HYSYS (HYPROTECH) -emple- antes de realizar esta operacin hay Figura 4. En la figura 4 se presenta un
ando un modelo de actividad basa- que purificar el xilitol y separarlo Diagrama de diagrama de flujo del proceso
do en los parmetros UNIQUAC- de los azcares (xilosa y arabinosa) flujo de la completo de separacin y purifica-
seccin de
y con aproximaciones heursticas y las sales para evitar que estos separacin y
cin de xilitol.
purificacin
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Separacin y purificacin 538.645.000 [27] Oh, D.K., Kim, S.Y. y Kim, J.H. Biotechnol.
Bioeng, 58, 440-444 (1998).
Caldera de generacin de vapor 17.902.000
[28] Shuler, M.L. y Kargi, F.Bioprocess enginee-
ring: basic concepts. Prentice Hall, New Jersey
Total inmovilizado (IF) 1.401.029.000 (1992).
[29] Bailey, J.E. y Ollis, D.F. Biochemical engi-
Costes de operacin Cantidad, pta/ao neering fundamentals. McGraw Hill, 2 ed, Singa-
pore (1986).
Pretratamiento de los licores sulfticos 16.252.000 [30] Gdia, F y Lpez, J. (Editores) Ingeniera
Bioqumica, Sntesis, Madrid (1998).
Fermentacin 28.977.000
[31] Paraj, J.C., Domnguez, H. y Domnguez,
Separacin y purificacin 16.002.000 J.M. Process Biochem., 32, 599-604 (1997).
Caldera de generacin de vapor 42.370.000 [32] Cruz, J. M., Domnguez, J. M., Domnguez,
Costes mano de obra 238.222.000 H. y Paraj, J. C. Food Biotech. (en prensa)
(2000).
Total costes de operacin (CF) 341.823.000 [33] Atkinson, B. y Mavituna, F. Biochemical En-
gineering and Biotechnology Handbook, Macmi-
llan Publishers, Hong Kong (1985).
Producto de ventas neto o flujo de caja (P) pta/ao
[34] Jaffe, G. M. y Weinert, P. H. U.S. Patent 3
985 815 (1976).
Opcin 1 936.828.000 [35] Peters, M.S. y Timmerhaus, K.D. Plant de-
Opcin 2 644.674.000 sign and economics for Chemical Engineers. Mc-
Graw-Hill, New York (1991).
[36] Chemical Prices, Chemical Market Reporter,
octubre (1999).
descuento, k, que iguala el VAN a [6] Domnguez, J.M.; Gong, C.S. y Tsao, G.T
Appl. Biochem. Biotech., 63/65, 117-127 (1997). [37] Cheryan, M. Ultrafiltration and microfiltra-
cero. El TIR es un criterio utilizado
[7] Heikkil, H., Nurmi, J., Rahkila, L. y Tyryl, tion handbook. Technomic, Pennsylvania. (1998).
para comparar la rentabilidad de M. U.S. Patent 5 081 026 (1992). [38] Paraj, J.C., Domnguez, H. y Domnguez,
distintos proyectos. Actualmente, [8] Paraj, J.C., Domnguez, H. y Domnguez, J.M. Bioprocess Eng., 13, 125-131 (1995).
se suele buscar que los proyectos J.M. Bioresource Technol., 65, 203-212 (1998). [39] Supelco. Informacin comercial (2000).
de inversin alcancen un TIR igual [9] Paraj, J.C., Domnguez, H. y Domnguez,
o superior al 50%. En el presente J.M. Bioresource Technol., 66, 25-40 (1998).
Agradecimientos
proyecto se alcanza, en el Caso 1, [10] Tavares, J.M., Duarte, L. C., Amaral-Co-
un TIR muy elevado, del 63%. En llao, M. T. y Grio, M. FEMS Microbiol. Lett., Los autores desear expresar su agradecimiento al
171, 115-120 (1999). grupo de investigacin del Prof. Juan Carlos Para-
el Caso 2 el TIR es del 43%.
[11] Alvarez, J.R., Luque, S., Avello. M., Areni- j Liares, de la Universidad de Vigo (Campus de
llas, A. y Coca, J. INGENIERA QUIMICA, 4, Orense) y, especialmente, al Dr. Jos Manuel Do-
Ambos valores indican que el 117-127 (1996). mnguez Gonzlez, por toda la informacin sumi-
nistrada sobre la fermentacin de xilosa.
proyecto presenta una rentabilidad [12] Heikkil, H., Hyky, G. y Kuisma, J. U.S.
elevada y que, por tanto, la pro- Patent 5 637 225 (1997).
duccin de un producto de elevado [13] Fartch, J.G. Lignosulfonates, Chemical Eco-
valor aadido a partir de una co- nomics Handbook, SRI. (1975).
rriente residual comporta elevados [14] Macleod, J.M. y Benko, J. V. J. Wood Chem.
Technol., 2, 207-219 (1982).
beneficios que permiten recuperar
[15] Tsapiuk, E.A., Bryk, M.T., Medvedev, M.I. y
el capital invertido en un tiempo de Kochkodan, V.M. J. Membrane Sci., 47, 107-130
dos aos y medio. (1989).
[16] Claussen, P.H. Synthetic Membranes Vol.2.
ACS Symp. Ser., 154, Washington D.C. (1981).
5. Bibliografa [17] Barnier, H.; Maurel, A. y Pichon, M. Paperi
Puu, 7, 581-583 (1987).
[1] Gil, A.M. Alimentacin, nutricin y salud [18] Gaddis, J.L., Fong, D.S., Tay, C.H., Urban-
6(2), 54-58 (1999). tas, R.G., y Lindgren, D. Tappi J., 74(9), 121-124
(1991).
[2] Hyvnen, L. y Koivistoinen, P. Adv. Food
Res., 28, 373-403 (1982). [19] Walas, S.M. Chem. Eng., 94(4), 75-81 (1987).
[3] Paraj, J.C., Domnguez, H. y Domnguez, [20] Perry, R.H. y Green, D.W. Perrys Chemical
J.M. Bioresource Technol,. 65, 191-201 (1998). Engineers Handbook, 7th ed. McGraw Hill, New
York (1997).
[4] Heikkil, H., Puuppo, O., Tylli, M., Nikander,
H., Nygrn, J., Lindroos, M. y Eroma, O. U.S. Pa- [21] Paraj, J.C., Domnguez, H. y Domnguez,
tent 5 998 607 (1999). J.M. Enzyme Microb. Tech., 21, 18-24 (1997).
[5] Melaja, A.J. y Hmlinen, L. U.S. Patent 4 [22] Domnguez, J.M., Gong, C.S. y Tsao, G.T.
008 285 (1977). Appl. Biochem. Biotech., 57/58, 49-56 (1996).
144