Mtodo para la determinacin de bacterias Coliformes, Coliformes

fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple

(nmero ms probable o NMP)

GENERALIDADES

Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando
como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que
funcionen como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes,
abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de
los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.

El grupo coliforme constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal

para la mayora de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la
materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino tambin se
observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua; encontrndose que mientras mayor sea el nmero de
coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por
lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el
agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento trmico
(pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), estos microorganismos se utilizan como
indicadores de malas prcticas sanitarias.

Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual
comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a
35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de

fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo
no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli.

La demostracin y el recuento de organismos Coliformes, puede realizarse mediante el

empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la
familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado
de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas que
provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas que
presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un
mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las clulas epiteliales
de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera
similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.

Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC),
E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente
difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las
cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el
consumo de agua y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea

del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones
es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios.

Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil
de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina
del clera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y
es capaz de resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos.

La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos
(lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en
aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva
puede ser ms baja.

Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes

particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la
mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en
ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin por ECEP provoca diarrea acuosa
generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crnica.

Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es codificada por el

gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plsmido, ambas protenas
permiten su unin a los enterocitos y la destruccin de las microvellosidades intestinales.

Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua

contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis
infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples
serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin
del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H (flagelar).

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente

relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La
enfermedad se presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que
viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir
las clulas epiteliales de la mucosa intestinal.

A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso

de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas caractersticas
importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli
son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y
anaerognicas.

La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio

del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.

Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su

efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de mono verde africano.
Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis
hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad
capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y
trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades similares a la toxina shiga producida por
algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la
verotoxina el ms comn y el nico que puede identificarse en muestras clnicas es el O157:H7.
La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.

La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada,
particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis
hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa
de la carne

En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por las cepas de
Escherichia coli antes descritas.

Propiedades y sntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli

patgenas
ETEC EPEC EHEC EIEC
Toxina Lbil/estable - Shiga o vero -

Invasiva
- - - +
Intiminas
- + + -
Enterohemolisina - - + -

Aspecto de las Aguadas Aguadas Aguadas muy Mucoides y

heces sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
Presencia de
leucocitos en - - - +
heces
Fiebre baja + - +
Intestino Colon y parte
involucrado Delgado Delgado Colon baja del
delgado
Dosis infectiva Alta Alta baja Alta
Serotipos O26, O111 y O157:H7, O26,
varios Varios
otros O111 y otros

FUNDAMENTO

La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms

Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando
un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la
fase presuntiva y la fase confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en
la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase
confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual
es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto
las sales biliares como el verde brillante.

La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza

a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de
las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una
temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h.

Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac
Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas
bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1. Para anlisis de agua

Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua
o hielo, consultar el cuadro 1.

5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo

lactosado concentracin doble o triple con campana de Durham a.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de
Durhamb.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC
MUG con campana de Durham b.
 2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d
2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons
(opcional)e

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Frascos gotero con reactivo de Ehrlich o Kovace

Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIN DE GRAMd

MATERIAL Y EQUIPO

Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodn a.
Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d
Asa bacteriolgicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio pticod
Termmetro calibradob
Bao de agua a 44.5 0,1C.b
Incubadora a 35 2,0Ca.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca
Autoclavea

NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica.
 DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

37C

24 - 48 h

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato positivos (produccin de gas) en caldo lactosa
CLSS + 20.0 mL de muestra verde brillante bilis 2% y caldo EC
de sodio (CLSS) doble concentracin (2X)

2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo

37C 44.5C

24 48 h 24 48 h

Lectura de tubos positivos en Tubos con 10.0 mL de Lectura de tubos positivos en

Tubos con 10.0 mL de
tablas. NMP de coliformes caldo EC o EC-MUG tablas. NMP de coliformes
caldo lactosa verde
totales /100 ml de muestra fecales /100 ml de muestra.
brillante bilis 2%

Siembra de tubos positivos en

placas de Agar EMB para la
bsqueda de Escherichia
coli
PROCEDIMIENTO

1. Agua y hielo

1.1 Prueba presuntiva

Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de

los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los
tubos para homogeneizar la muestra.

CUADRO 1. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio

INOCULO CANTIDAD DE VOLUMEN DE CALDO LAURIL CONCENTRACIN

(mL) MEDIO POR MEDIO MAS TRIPTOSA
TUBO (mL) INOCULO REQUERIDO g/L
(mL)
1 10 o ms 11 o ms 35,6 1X
10 10 20 71,2 2X
10 20 30 53,4 1.5 X
20 10 30 106,8 3X
100 50 150 106,8 3X
100 35 135 124.6 3.5 X
100 20 120 142.4 4X

Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva, a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana
de Durham.

Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.

Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h..

Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento)

y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h..
 Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de
organismos coliformes totales/100 mL.

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva a tubos con caldo EC.

Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.

Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua con circulacin durante 24

a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y

produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.

Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de

organismos coliformes fecales/ 100 mL.

Control de calidad para coliformes fecales

1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras.

1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli

Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.

Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.

Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial:

Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con
morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y
sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa
microscpica y pruebas bioqumicas.

Incubar las placas a 35C por 18-24 h.

Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos

cortos o cocobacilos Gram-negativos.
1.4.1 Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

A partir de las cajas de agar cuenta estndar, selecionar una colonia, resuspenderla en
2 ml de solucin salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.

a. Produccin de indol (I)

Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona,
incubarlo a 35C por 24 2 h.

Finalizada la incubacin, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o

Ehrlich.

La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera como

prueba positiva para la presencia de indol.

b. Produccin de cidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga

caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h.

Finalizada la incubacin, adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.

Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color

amarillo es una prueba negativa.

c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga

caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h.

Finalizada la incubacin , adicionar 0.6 mL de solucin KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2
mL de solucin alfa- naftol (VP2 )y agitar.

Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba

positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilizacin del citrato (C)

Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga

caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional) Incubar a 35C por 96
h.

El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser,
se considera una prueba positiva.
NOTAS

Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
medio SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacteriologca de forma
recta. Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el
reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.

Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono,
tambin se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
Para evitar resultados falsos positivos, el inoculo no debe ser muy abundante, tanto en
el caldo citrato como en el agar citrato de Simmons

1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil--D-glucuronido)

FUNDAMENTO

Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.

a. Prueba confirmativa

A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) tomar una asada de cada tubo que
muestre formacin de gas y sembrar en un nmero igual de tubos con medio EC-
MUG.

Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de
gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.

Finalizado el periodo de incubacin, irradiar los tubos con una fuente de luz UV,
observar cuantos tubos presentan fluorescencia

Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli.

Control de calidad

Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable conforme al

procedimiento sealado en la tabla 1, para estimar la poblacin de bacterias coliformes
totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en muestras de agua.

TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.

No. de Tubos 95% de Lmite de Confianza (aproximado)

positivos NMP/100 mL Inferior Superior
0 <1,1 0 3,0
1 1,1 0,05 6,3
2 2,6 0,3 9,6
3 4,6 0,8 14,7
4 8,0 1,7 26,4
5 >8,0 4,0 Infinito

TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.

No. de Tubos 95% de Lmite de Confianza (aproximado)

Positivos NMP/100 mL Inferior Superior
0 <1,1 0,0 3,0
1 1,1 0,03 5,9
2 2,2 0,26 8,1
3 3,6 0,69 10,6
4 5,1 1,3 13,4
5 6,9 2,1 16,8
6 9,2 3,1 21,1
7 12,0 4,3 27,1
8 16,1 5,9 36,8
9 23,0 8,1 59,5
10 >23,0 13,5 Infinito
Todos los cultivos
que:

Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la lactosa

con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C. y se obtenga las siguientes
combinaciones para las pruebas IMVIC:
Biotipo
1(++--)
Biotipo 2 (-
+--)
son consideradas como Escherichia
coli.

Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporcin de los tubos positivos de

la prueba confirmatoria en caldo EC.

BIBLIOGRAF
A

NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos crnicos

troceados y curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones y
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Washington. 69-82.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)

Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.
 Determinacin de coliformes totales por cuenta en placa

OBJETIVOS

Comprender y realizar adecuadamente la determinacin de coliformes totales en

un alimento, mediante la cuenta en placas vertidas.
Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

GENERALIDADES

La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos

microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, aunque algunos
pueden ser fermentadores tardos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia,
respectivamente.

La mayora de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto

digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las
heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razn, su presencia constante en la
materia fecal, los coliformes son el grupo ms ampliamente utilizado en la microbiologa
de alimentos como indicador de prcticas higinicas inadecuadas. Como los
coliformes tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes
totales y coliformes fecales. Esta prctica se refiere a coliformes totales.

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de

los alimentos.
La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su presencia
no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de
origen no-fecal.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas en el equipo.
La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las
diferentes reas del procesamiento de alimentos.
La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante
el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas selectivas
o diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV).
FUNDAMENTO

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se

desarrollan en ABRV, el cido producido por la fermentacin de la lactosa, ocasiona
el vire del indicador rojo neutro y la precipitacin de las sales biliares por lo que las
colonias son color rojo oscuro y generalmente estn rodeadas de un halo de sales
biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa.

La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersin y separacin,

como se explic en la tcnica de preparacin de diluciones.

NOTAS

Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de
coliformes, debe considerarse lo siguiente:
Si el alimento contiene mono o disacridos en altas concentraciones, stos
pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias
semejantes a las de coliformes.
El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes
de 3 h. a partir de su preparacin; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar
en bao de agua a 45 C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo.
Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han
solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas
para los coliformes.
El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de
incubacin, especialmente la incubacin prolongada, pueden ocasionar la
formacin de colonias rojas de cocos Gram positivos.
El rango estadstico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de
sensibilidad del mtodo) es de 15 a 150 UFC por placa.
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con
las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solucin amortiguadora de

fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a
2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9.0 mL de solucin
amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a
5 a 9 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo violeta
c/u, o un matraz erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL. a
MATERIAL Y EQUIPO

Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista con
termmetro calibrado. a
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadrculada y lente amplificador. b
Registrador mecnico o electrnico b
Microscopio ptico b
Bao de agua con termmetro calibrado, que mantenga la temperatura a 45
1.0 C. a
Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a
Propipetaa
Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior
(las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones). a
Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior.
(las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones) a
Pipetas Pasteur estriles a, b
4 a 8 cajas Petri estriles, de 15 x 100 mm. a
Stomacher (homogeneizador peristltico). a
Bolsas estriles para stomacher. a

NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica
b
Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la prctica
 DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA
Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de

1.0 mL 1.0 mL
1.0 mL
-1 -2 -3
10 10 10 10-4
Homogeneizar
Pesar 10 g de la muestra con
muestra en 90.0 mL de
condiciones de

Depositar 1.0 mL de cada dilucin en

cajas de Petri estriles por duplicado
Adicionar de 15 a 20 mL de agar
bilis rojo violeta fundido y
enfriado a 45C en cada placa

Homogeneizar la muestra
con el agar haciendo
movimientos rotatorios Incubar las cajas
en posicin
invertida Contar aquellas placas que tengan
entre 15 a 150 colonias y reportar
24 h/ 37C como UFC/g o mL de muestra

4
PROCEDIMIENTO

1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de

Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis
Microbiolgico. Recordar que el rango de sensibilidad del mtodo es de 15
a 150 colonias por placa.
2. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la
inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y
libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes
de colocar el inculo.
3. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilucin correspondiente en cada caja,
mediante pipeta estril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido
y mantenido a 45 1.0C en bao de agua. El tiempo transcurrido entre la
preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio
de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
4. Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio, mediante seis
movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las
manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las
manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y
nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre
una superficie horizontal fra. No permitir que se mojen las tapas de las
cajas.
5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 5
mL del mismo medio fundido y mantenido a 45 C, no permitir que se mojen
las tapas de las cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el
crecimiento de los coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique.
6. Preparar una caja control con 18.0 a 20.0 mL de medio para verificar la
esterilidad.
7. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a
35C, durante 24 2 h.
8. Despus de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias.
Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias
tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de
un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo
claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un
dimetro de 0.5 a 2.0 mm.
9. Si hay desarrollo extendido o un nmero de colonias superior al del rango
de sensibilidad del mtodo, aplicar las reglas indicadas en el inciso de
RESULTADOS de la prctica de Cuenta de Bacterias en Placa. Hacer uso
del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir
las colonias de las pequeas partculas de alimento.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la prctica Cuenta

de Bacterias en Placa.
Reportar como se indica a continuacin, con dos cifras significativas y
potencias de 10.

Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 + 2 h a

35 C: UFC / g (o / mL) de muestra.

BIBLIOGRAFA

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ed. Arlington, VA: AOAC.

Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y Dilucin

de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana.
Mxico.

Secretara de Salud. NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodos para la cuenta

de microorganismos coliformes totales en placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico.

Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la

Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico.

Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia
coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 69-82.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)

Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL