Mtodos de

Diagnstico
Contenido.
Recoleccin de la muestra
Procesamiento de muestras
Medios utilizados para el estudio de
anaerobios.
Sistema de cultivo
Medios pre rreducidos (PRAS)
Mtodo Roll-tube
Cmara de anaerobiosis
Identificacin de anaerobios
 RECOLECCION DE LA MUESTRA

Adecuada asepsia
Elegir la forma de recoleccin
Aspirado
Biopsia de Tejido

65 % mal recolectadas

Behra-Miellet J. Anaerobe 2003;9:105

TRANSPORTE
Recepcin
Una vez recibida la muestra en el
laboratorio se anota la fecha y hora de
recepcin y se comprueba que cumple
los requisitos para su aceptacin.
Procesamiento
El procesamiento inicial incluye su preparacin,
examen directo e inoculacin en los medios de cultivo
apropiados.
Preparacin : la muestra se procesa con las mximas
precauciones y lo antes posible (15 minutos)
Si es posible, la preparacin se deber hacer en una
cmara de anaerobiosis para minimizar su oxigenacin.
Examen directo
Proporciona de forma inmediata
informacin semi cuantitativa acerca de
los microorganismos presentes y un
diagnstico presuntivo de la existencia de
bacterias anaerobias.
Examen macroscpico
Consiste en la observacin de los siguientes datos:
Mal olor (productos finales del metabolismo de
bacterias anaerobias),
Fluorescencia roja a la luz ultravioleta (produccin de
protoporfirina por las especies pigmentadas de
Prevotella y Porphyromonas),
Exudados sanguinolentos, exudados de color negruzco
(presencia de bacilos gramnegativos pigmentados),
Existencia de tejidos necrticos,
Gas en los tejidos,
Existencia de grnulos de "azufre" en el exudado
(presencia de Actinomyces spp. y Propionibacterium
propionicus), exudados purulentos, etc.
 FLUORESCENCIA BAJO LUZ UV

Bacteria Color
Porphyromonas Rosa o naranja
P. gingivalis No fluorece
Prevotella pigmentadas roja
Fusobacterium sp Amarilla o verde
Veillonella sp roja
Clostridium difficile Verde o amarilla
Clostridium ramosum roja
Eubacterium sp roja -
Medios de cultivo
Para conseguir una recuperacin optima de
bacterias anaerobias es fundamental elegir
correctamente los medios de cultivo
primarios. La mayora de estas bacterias
requieren para su crecimiento vitamina K1 y
hemina.
Para su aislamiento e identificacin
presuntiva se aconseja utilizar una
combinacin de medios enriquecidos no
selectivos, selectivos y diferenciales, entre los
que se incluyen:
Agar sangre para anaerobios
Como agar Brucella o agar Schaedler
con un 5% de sangre de carnero, a los
que se aaden vitamina K1 (1g/ml) y
hemina (5g/ml).
En estos medios crecen tanto las
bacterias anaerobias facultativas como
las anaerobias obligadas.
Agar Bacteroides bilis esculina
con amikacina(BBE)
Es un medio selectivo para Bacteroides
del grupo fragilis y Bilophilia spp.
Contiene amikacina (100 g/ml) que
inhibe la mayorIa de facultativos, bilis
(20%) que slo permite el crecimiento de
las especies citadas y esculina que al ser
hidrolizada en presencia de un indicador
(citrato frrico) vira el medio a color
negro.
Agar con alcohol fenil-etlico
(PEA)
Con un 5% de sangre de carnero.
El alcohol inhibe el crecimiento de bacilos gram
negativos facultativos, principalmente el
crecimiento de las especies de Proteus. Tambin
evita el crecimiento de algunas especies de
Clostridium como Clostridium septicum, facilitando
de este modo su aislamiento.
Se aconseja sembrar en este medio las muestras
purulentas o cuando sea previsible una infeccin
mixta.
Agar selectivo (SNV)
Como agar Schaedler con :
Neomicina (75 g/ml) y vancomicina (7,5
g/ml) (SNV)
kanamicina (75 g/ml) y vancomicina (7,5
g/ml) (SKV)
El clsico agar Brucella con kanamicina,
vancomicina y en este caso sangre de
carnero (ASLKV).
Agar selectivo
Son medios selectivos para bacilos gramnegativos como el
grupo de Bacteroides fragilis y especies de Prevotella.

La presencia de neomicina o de kanamicina inhibe a la

mayor parte de los aerobios facultativos y la presencia de
vancomicina inhibe la mayorIa de los gram positivos y
especies de Porphyromonas.

A veces pueden crecer en estos medios levaduras y

anaerobios facultativos resistentes a estos aminoglicsidos
por lo que siempre debe realizarse una tincin de Gram y
un ensayo de aerotolerancia a todos los aislados.
Agar con yema de huevo
(AYE)
Cuando se sospecha la presencia de
clostridios, para detectar la produccin
de lipasa y/o lecitinasa.
CCFA o CCEY
Un agar selectivo para Clostridium
difficile, cuando se investigue la
presencia de esta especie, como agar
fructosa-cicloserina-cefoxitina (CCFA) o
agar yema de huevo-cicloserina-
cefoxitina (CCEY).
MEDIO LIQUIDO
Como medio lquido de enriquecimiento o de
mantenimiento se recomienda usar caldo de
tioglicolato sin indicador, suplementado con
vitamina K1 (200 l) y hemina (20 l).

Este medio se utiliza para recuperar las bacterias

anaerobias en caso de que falle la anaerobiosis
en la incubacin de los cultivos primarios, haya
una inhibicin del crecimiento debido a
antibiticos o a otros factores, o bien cuando las
bacterias se encuentran en cantidades muy
pequeas
Tiempo de incubacin
Las placas de cultivo se incuban a 35-37C en
el sistema de anaerobiosis disponible.
Si se utiliza una cmara se pueden examinar
a las 24 h, puesto que no es necesario
sacarlas.
Si se emplean jarras o bolsas hay que esperar
48 h, a no ser que se busquen
microorganismos de crecimiento rpido y se
empleen medios selectivos como el BBE para
el grupo de Bacteroides fragilis o el EYA para
clostridios, en cuyo caso se pueden examinar
a las 24 h.
Tiempo de incubacin
Si en las placas no se observa ningn
crecimiento se deben reincubar hasta
completar 7 das, al menos las de agar
sangre no selectivo, ya que algunos
anaerobios requieren este tiempo para
formar colonias visibles (Actinomyces,
Porphyromonas, Propionibacterium,
Bilophila, ...).
Tiempo de incubacin
Se aconseja mantener la incubacin del
medio lquido de enriquecimiento entre 7
y 10 das y se deben realizar subcultivos.
Si se aprecia turbidez u otro signo de
crecimiento, sembrar en agar sangre y
agar chocolate y se incubar en una
atmosfera con 10% de CO2.
 ERRORES EN EL PROCESAMIENTO
DE MUESTRAS
Falla en coloracin de Gram
Contaminacin con flora comensal normal
Falla en generacin del ambiente anaerbico
Condiciones de transporte de la muestra
Uso medios sin suplementos requeridos
No incluir CO2 en la mezcla de gases
Incubacin hasta 10 das
 EL PROCESO
Exmen microscpico: Gram
macroscpico: olor, color, fluorescencia,
presencia de grnulos

Medios de Cultivo para aislamiento:

Agar Brucella+VitK+Hemina+sangre 5%
Anaerobios agar Bacteroides Bilis-esculina (BBE)
agar sangre Kanamicina + Vancomicina
Fenil etil agar+Vit K+Hemina+sangre 5%
Caldo: Tioglicolato

Incubacin: hasta 10 das

 MUESTRA

MEDIO LQUIDO
EX. DIRECTO TIOGLICOLATO

MICROSCOPIO PLACAS
TINCIN GRAM

Incubacin en
Macroscpico anaerobiosis
Incubacin al 10% CO2
Agar sangre
Agar brucella Agar chocolate
SNV
BBE
PEA
* Cuando se sospecha la
presencia de Clostridium AYE*
Tcnicas para la
identificacin de bacterias
La interpretacin de estas observaciones es la
siguiente:
1. Crecimiento en bilis (+), vancomicina R,
kanamicina R, colistina R = grupo Bacteroides fragilis.

2. Crecimiento en bilis (+), vancomicina R, kanamicina S,

colistina S = grupo Bilophila/Sutterella.

3. Crecimiento en bilis (-), vancomicina variable (V), kanamicina

R, colistina V = grupo Prevotella/Porphyromonas.

4. Crecimiento en bilis (-/+),vancomicina R, kanamicina S,

colistina S = Fusobacterium spp. (dos especies bilis+).

5. Crecimiento en bilis (-), vancomicina R, kanamicina S, colistina

S = grupo Bacteroides ureolyticus/Campylobacter (la
diferenciacin presuntiva entre este grupo y Fusobacterium
tendra que basarse en las caractersticas morfolgicas de la
cepa).
 TEST de SIM

El estudio de la capacidad de producir indol

y de descomponer el H2O2 estn al alcance
de cualquier laboratorio de microbiologa,
por lo que deberan incluirse en todo
esquema de identificacin.