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OBJETIVOS DE LA MATERIA
Formar un estudiante que posea conocimientos de Citologa, Histologa y Embriologa en un nivel
adecuado y suficientemente actualizado, capaz de interpretar los fenmenos dinmicos de la
Histofisiologa y del desarrollo embriolgico del hombre.
Contribuir a una profunda formacin cientfica general, preparando al estudiante para saber
categorizar los valores ticos y desarrollar el sentido de la responsabilidad.
HISTO: tejido
LOGOS: estudio, palabra o aprendizaje.
El fundamento de nuestras actividades prcticas, ser familiarizar a los alumnos con el estudio
microscpico de las estructuras normales, de los distintos rganos de la economa;
interrelacionarlos; comprender sus funciones (Fisiologa) y concluir en la posibilidad de que existan
alteraciones morfolgicas y/o funcionales, de los mismos (Fisiopatologa), intentando
capacitarlos para su futura introduccin al estudio de las enfermedades (Patologa), las
cuales se expresan mediante signos y sntomas que se estudian en la Clnica Mdica.
Toda metodologa didctica que nos permita concretar lo fundamentado anteriormente, ser
valida.
TCNICA HISTOLGICA
Con ms de cien aos de existencia, se ha ido perfeccionando con el paso del tiempo. Esta tcnica
debe estudiar una capa muy delgada de la muestra, susceptible de ser observada, por
transparencia, en el microscopio, conservando:
1. La forma y tamao, lo ms exactamente posible.
2. La estructura de las clulas y los tejidos.
Para conciliar estas dos exigencias, las piezas a estudiar deben sufrir un cierto nmero
de procedimientos, que comprendern ciertas etapas o pasos. Para ello proponemos a los
alumnos, las siguientes Unidades de Accin:
A. Nombre los pasos de la Tcnica Histolgica, para el examen mediato (Tcnica Corriente)
B. En la obtencin de material, discuta la diferencia entre Necropsia y Biopsia.
C. Nombre los animales de laboratorio mas comnmente utilizados, para la obtencin de material
de estudio.
D. Explique la importancia de la fijacin.
E. D ejemplos de Fijadores Fsicos, Fijadores Qumicos y Mezclas Fijadoras ms comunes.
F. Nombre el Fijador Qumico ms comn.
G. Establezca la importancia de la INCLUSIN.
H. Mencione la sustancia que se usa comnmente para la inclusin y los pasos utilizados
para la misma.
I. Mencione el espesor de los cortes que se utilizan en microscopia ptica; comprelos con el
espesor exigido en microscopia electrnica.
Ctedra B de Citologa, Histologa y Embriologa. Facultad de Ciencias Mdicas. U.N.L.P. 2017. Reserva de derechos. Quedan reservados todos los
derechos de propiedad intelectual, diseos e imgenes contenidas en estas pginas. Queda totalmente prohibida cualquier copia o reproduccin total o
parcial de dicha edicin por cualquier medio del contenido sin la autorizacin previa, expresa y por escrito de la Ctedra.
CTEDRA "B" DE CITOLOGA, HISTOLOGA Y EMBRIOLOGA F.C.M. U.N.L.P.
Nuestra Ctedra de Citologa, Histologa y Embriologa tiene como principal objetivo a lo largo y a travs de
nuestras actividades practicas, orientar a cada estudiante a comprender la microanatoma de las clulas, los
tejidos y los rganos que ellos constituyen, pudiendo as correlacionar la estructura y la funcin.
El estudio directo de clulas y tejidos vivos solo tiene aplicaciones limitadas, presentando los tejidos, en este
estado, cierto espesor que dificulta el paso de la luz a travs de ellos. Por lo que se utiliza con mayor frecuencia
el estudio de tejidos muertos obtenidos por biopsia o necropsia (autopsia) y mantenidos a travs de diversas
acciones qumicas, a las que son sometidos de forma inmediata a su extraccin.
El material se ha obtenido en algunos casos por biopsia, por ejemplo: piel, pero en mayor nmero por
necropsia de animales de laboratorio (rata, perro, gato, conejo, mono, etc.) o del hombre. Puede tratarse de:
un rgano entero o mas comnmente un trozo o fragmento del rgano. Siempre se realiza con instrumental
quirrgico y con el debido conocimiento anatomotopogrfico.
De las diversas acciones qumicas para preparar y preservar este material de estudio, el primer
paso esta marcado por la accin fijadora de ciertos agentes qumicos (individuales o mezclas). Los
fijadores conservan la estructura de las clulas y de los componentes extracelulares deteniendo el
metabolismo celular, es decir, frenando la autlisis y estabilizando las protenas. El fijador qumico
individual mas utilizado es el formol, solucin acuosa de formaldehdo al 37%, el formol es un mal
fijador de las membranas plasmticas pues no reacciona con los lpidos. La mezcla fijadora mas
utilizada es la de Bouin (formol, cido actico y cido pcrico). Si bien no los utilizamos en el material
que examinamos en nuestros trabajos prcticos, recordemos que tambin hay fijadores fsicos: fro,
calor, congelacin y desecacin.
El segundo paso es infiltrar o incluir la muestra con la finalidad de permitir cortes muy delgados y la
sustancia de inclusin empleada es la parafina debido a sus condiciones de penetrabilidad y
consistencia. Por lo tanto al retirar la muestra de la solucin fijadora, se deber lavar y luego: a)
deshidratar lenta y progresivamente en soluciones alcohlicas de concentracin creciente: 70% - 80
a 90% - hasta llegar al alcohol absoluto (100%). Se quita el agua de clulas y tejidos que componen
la muestra, porque la parafina no ser miscible ni en agua ni en alcohol. b) se proceder luego a la
aclaracin utilizando un solvente orgnico como el xileno, miscible tanto en alcohol como en
parafina, por lo tanto es reemplazado el alcohol absoluto.
Finalmente sobreviene la imbibicin en parafina fundida (estufa a 60), que deber ocupar todos los
espacios entre las clulas y en el interior de las mismas. Al retirar de la estufa la parafina fundida, se
enfra y endurece formando un bloque de tamao adecuado: taco, el cual se coloca en aparato de
gran precisin, provisto de una cuchilla de acero: Micrtomo, el mismo se encargar de efectuar
cortes lo suficientemente delgados (5-10 m de espesor) que permitan el paso de la luz a travs de
ellos.
MICROSCOPA Y TCNICAS DE ENFOQUE H1
Para acceder a la tercera etapa que es la coloracin, observar el corte histolgico al microscopio
ptico y examinarlo en detalle, habr que disolver y extraer la parafina utilizando nuevamente al
xileno. Procediendo luego a la rehidratacin de los tejidos mediante el uso de soluciones alcohlicas
de concentracin decreciente (100% - 90% - 70%). Los cortes o muestras se colorean, se colocan en
concentraciones crecientes (90-100) de soluciones alcohlicas para su deshidratacin y se montan
con blsamo de Canad, al cual se le adhiere un cubreobjeto.
La composicin qumica de un tejido vivo es muy diferente a un tejido muerto que ha pasado por la
accin de agentes fijadores y de otras reacciones qumicas posteriores. Perduran tras la fijacin,
macromolculas que no se disuelven con facilidad: nucleoprotenas, protenas del citoesqueleto,
protenas extracelulares, componentes de la membrana celular. Pero hay otras macromolculas que
se pierden si el fijador est en solucin acuosa, como: glucgeno, proteoglucanos y GAG.
BASOFILIA
Colorante bsico - fosfatos de los cidos nucleicos.
Reaccionan con
AZUL
o basfilo de carga + - sulfatos de GAG (glucosaminoglucanos)
(catinico) - carboxilo de las protenas.
Basofilia = capacidad de tincin de los colorantes bsicos
EOSINA
ACIDOFILIA
ROSADO
Colorante cido o Grupos catinicos: (carga +)
Reaccionan con
acidfilo de carga - Protenas bsicas del citoplasma.
(aninico)
Acidofilia = capacidad de tincin de los colorantes cidos
Tambin se incorporan en los trabajos prcticos aunque en menor nmero, cortes histolgicos
teidos con tcnicas tricrmicas tales como:
a) de Gomori: Hematoxilina (bsico), color azul violceo.
Crosmotropo (cido), color rojo.
Verde luz (cido), color verde.
Hay diversas variantes de Azn, una de ellas es el Mallory (Mallory-Azn) con tres colorantes cidos:
orange G, azul de anilina y fucsina cida.
Con la tcnica del PAS (cido Perydico-reactivo de Schiff), que tien de color rojo prpura:
carbohidratos (glucgeno, glucoprotena, GAG, etc). Mostramos en trabajo prctico un corte de
hipfisis (glndula endocrina), la membrana basal de los cordones epiteliales secretores e incluso
algunas clulas secretoras de hormonas glucoproteicas.
Con la impregnacin argntica los tejidos son tratados con sales metlicas (de plata) producindose
un precipitado al ser enfrentadas dichas sales a un agente reductor. Con esta tcnica mostramos
fibras reticulares como sostn o estroma en un ganglio linftico y tambin en la observacin de
clulas de la neuroglia, en cortes de rganos del sistema nervioso central.
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MICROSCOPIOS PTICOS
SIMPLE: Lupa
COMPUESTOS, DE LUZ O DE CAMPO CLARO: la muestra se observa ms oscura que el campo
que la rodea (son los que se utilizan en el aula de trabajos prcticos).
ESTEREOSCPICOS: permiten ver las muestras en dos y tres dimensiones.
DE LUZ ULTRAVIOLETA: la imagen depende de la absorcin de la luz UV, por las molculas de la
muestra.
DE LUZ POLARIZADA: presenta modificaciones del M/O: entre la fuente de luz y la muestra se
coloca un filtro (polarizador) y entre el objetivo y el observador un segundo filtro (analizador).
DE CAMPO OSCURO: para observar microorganismos; tiene un condensador especial que hace
que los rayos luminosos no penetren directamente sino en forma oblicua, es decir la luz se
dispersa o refracta por las estructuras del espcimen.
DE CONTRASTE DE FASES: se utiliza para clulas vivas, es decir en cultivos. Se basa en
modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, provocando contrastes notables en la
preparacin.
DE FLUORESCENCIA: el material biolgico es tratado con flurocromos, emite luz propia.
CONFOCAL DE BARRIDO: combina componentes de un microscopio de campo claro con un
sistema de barrido para disecar pticamente una muestra.
MICROSCOPIOS ELECTRNICOS
DE TRANSMISION (MET): con poder de resolucin de 0,1 a 0,2 nm. Permite observar la
ultraestructura de cortes finos de las clulas.
DE BARRIDO (MEB) O SCANNING: con poder de resolucin de 10 nm. Se observan superficies
de clulas y de tejidos.
DE FUERZA ATOMICA (MFA): con resolucin molecular y atmica. Es un microscopio no ptico.
Es una sonda exploradora puntiaguda, en su extremo (pa) que contacta la muestra o puede
subir y bajar, de acuerdo a las irregularidades de la superficie de la muestra biolgica (la muestra
puede estar en el agua).
MICROSCOPIO PTICO
MICROSCOPIO PTICO O DE LUZ (COMPUESTO): denominado compuesto por estar
constituido por dos sistemas de lentes. (OBJETIVO Y OCULAR). Agrandando las imgenes de
pequeos objetos.
MICROSCOPA Y TCNICAS DE ENFOQUE H1
- TUBO
- REVLVER PORTAOBJETIVO
- COLUMNA O BRAZO
PARTE MECNICA O ESTATICO - PLATINA
- PIE O BASE
- TORNILLO MACROMETRICO
- TORNILLO MICROMETRICO
- OCULAR/ES
- OBJETIVO/S
PARTE PTICA - ESPEJO
- APARATO DE ILUMINACIN - CONDENSADOR
- DIAFRAGMA
FIG.1.1
PLATINA: es una pieza metlica, de forma diversa (rectangular, circular o cuadrada). Dispuesta en
forma perpendicular al eje ptico, sirve de apoyo al preparado, para su observacin. Est provista de
un orificio central, el cual permite el paso de los rayos de luz procedentes del aparato de
iluminacin, situado por debajo de ella. Puede ser fija, con pinzas que sujeten el preparado, el cual
tendr que ser desplazado manualmente para observar distintos campos; puede ser mvil. Algunos
modelos ms modernos tienen la posibilidad, a travs de un sistema de tornillos, de imprimirle al
objeto coloreado (preparado) desplazamientos anteroposteriores y de derecha a izquierda.
SISTEMA REVLVER: disco giratorio adosado al borde inferior del tubo, donde se atornillan los
distintos objetivos.
OCULAR/ES: cilindro hueco metlico, ubicado en el extremo superior del Tubo, con una lente o
sistema de lentes convergentes, en cada extremo. La Lente Ocular es la ms prxima al ojo del
observador y la Lente Colectora o de Campo es la inferior (recibiendo directamente los rayos
provenientes del objetivo). Aumenta slo la imagen producida (en su plano focal) por el
objetivo, pero sin agregar nuevos detalles y corrigiendo defectos de la imagen.
VIDRIO: n = 1,52
AIRE: n = 1,00
AGUA: n = 1,33
ACEITE: n = 1,52
MICROSCOPA Y TCNICAS DE ENFOQUE H1
LECTURA DE UN OBJETIVO
CONDENSADOR: concentra los rayos luminosos reflejados por el espejo y los proyecta sobre el
preparado, con un ngulo de incidencia apropiado para que atraviesen la Lente Frontal del
objetivo. En definitiva, es un conjunto de lentes que aumentan la intensidad luminosa, desviando los
rayos de luz de una zona relativamente extensa hacia una reducida. El Condensador debe estar
alto, es decir lo ms cerca de la platina posible, por lo tanto lo ms cercano al Objeto. En
algunos microscopios se puede acercar o alejar el Condensador con los movimientos de
un tornillo que se ubica a un lado de la Columna.
A. Ubquese frente al microscopio, de manera cmoda. Puede inclinar la Columna hacia usted, si el
microscopio lo permite.
B. Ponga en posicin correcta:
1. Mediante el revlver el Objetivo de menor aumento situado en el eje ptico y fijado por el
retn del revlver.
2. Fuente luminosa artificial, situada a 20 30 cm del espejo.
3. El espejo con la cara cncava, hacia la fuente de luz.
4. El condensador colocado en la posicin ms alta (muy cerca de la Platina)
5. El diafragma completamente abierto.
C. Efecte las operaciones necesarias para que el campo quede completamente iluminado y con la
mayor intensidad que le sea posible conseguir; para ello proceda bajando el Tubo hasta que la
lente frontal del Objetivo este a 1 cm de la Platina. Observe por el Ocular, moviendo el espejo y
trate de que los rayos reflejados se dirijan al eje ptico del microscopio; a partir de esto, no
mueva el microscopio de su lugar.
D. Tome el preparado y compruebe que est limpio, fjese si tiene huellas digitales o polvo, en caso
de haberlas, lmpielas con un pauelo.
E. Coloque el Preparado sobre la Platina y sujtelo con las pinzas; tenga en cuenta que el
Cubreobjeto este hacia arriba, mirando hacia el Objetivo.
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F. Mueva el Preparado de tal manera, que el material de estudio (objeto coloreado), est
aproximadamente sobre el orificio de la Platina.
G. Baje el Tubo mediante movimientos hacia adelante del tornillo macromtrico, mirando
lateralmente desde afuera, hasta que la lente frontal del Objetivo est a 2 - 4 mm del
cubreobjeto.
H. Mire por el ocular, mientras sube el Tubo hasta obtener una imagen clara del objeto.
Subir el Tubo moviendo el tornillo macromtrico, lentamente siempre atrs. Trate de
observar siempre por el ocular con un ojo, mientras mantiene el otro abierto; al principio
resultar difcil (porque ver tanto el preparado como la mesa), pero luego le ser ms cmodo.
I. Regule con el tornillo micromtrico para lograr la imagen ms ntida posible; mueva dicho
tornillo hacia delante o atrs, lentamente.
J. Recorra el preparado movindolo con los dedos o con los tornillos de la Platina mvil, si la
hubiere, mientras observa por el ocular en caso de que el Objeto quede fuera de foco.
Cuando realiza el movimiento, regule con el tornillo micromtrico.
K. Para observar a mayor aumento, gire el revlver hasta colocar, en el eje ptico, el objetivo de
mayor aumento. Fjese que quede trabado por el reten (se tacta un click)
L. Observe por el ocular, mientras regula con el tornillo micromtrico para obtener una buena
imagen. Queda totalmente prohibido utilizar el tornillo macromtrico, para regular a
mayor aumento. Generalmente para colocar en foco, al pasar de menor aumento, a
mayor, debe moverse el tornillo micromtrico hacia atrs.
M. Recorra el preparado de la misma manera que a menor aumento, mientras enfoca con el tornillo
micromtrico, pues el movimiento del preparado a mayor aumento, hace que el objeto salga de
foco frecuentemente.
CONCLUSIONES
1. Deber iniciarse la tcnica de enfoque colocando el objetivo de menor aumento mediante el
recorrido de diferentes reas (y la observacin de distintas estructuras). Se efectuar un
diagnstico histolgico del corte. Corroborar que el cubreobjetos este hacia arriba.
2. Los movimientos de descenso del Tubo (mediante el tornillo macromtrico de enfoque rpido)
buscando aproximar el objetivo al preparado (ubicado en la Platina), deben realizarse
mirando desde afuera, para evitar la ruptura del preparado.
3. Al colocar el objetivo de mayor aumento, para observar con mayor detalle algunas
estructuras no debe accionarse el tornillo macromtrico.
NOTA: se aclara que la tcnica de enfoque que aqu se describe, ha sido adecuada al estado de
conservacin de nuestros microscopios. Actualmente en la mayora de nuestros microscopios, la
platina es la que se mueve (ascenso y descenso)
El PODER DE RESOLUCION depende del sistema ptico (objetivos), de la longitud de onda de la luz:
a menor longitud de onda mayor poder resolutivo y del espesor de la muestra (debe ser fina).
PODER DE RESOLUCION O RESOLUTIVO: es el poder del microscopio para diferenciar entre dos
puntos u objetos cercanos (muy prximos) como diferentes, es decir la distancia mnima que debe
existir entre dos puntos para que se visualicen separados. Mientras ms corta sea la distancia entre
esos puntos del objeto, ms finos sern los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce
como Lmite de Resolucin y responde a la frmula:
o,61 x
d=
AN
MFA 50 pm
UNIDADES DE MEDIDA:
MACROSCPICO:
Metro (m)
Milmetro (mm) = 0,001 m (1 mm); es la milsima parte del Metro.
MICROSCPICO:
Micrn ( ) o Micrmetro ( m) = 0,001 mm (1 m); es la milsima parte del Milmetro.
SUBMICROSCPICO:
Milimicrn (m ) o Nanmetro ( m) = 0,001 (1 m); es la milsima parte del Micrn.
ngstrom (A) = 0,0001 m; es la diezmilsima parte del Micrn.
Picmetro (pm) = 0,01ngstrom.
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CEREBELO
CEREBELO
LENGUA
RIN
PAS 600X
MICROSCOPA Y TCNICAS DE ENFOQUE H1
INTESTINO DELGADO
HE/PAS 600X
RIN
CARTLAGO ELSTICO
ORCENA 200X
ARTERIA AORTA
GANGLIO LINFTICO
GANGLIO LINFTICO