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DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA
ELABORADO POR:
Relacin de prcticas
Titulo Sesiones*
9. Diseo de primers
g. Anlisis de resultados
*La sesiones necesarias para la realizacin de cada prctica no son necesariamente continuas.
Manual elaborado por Jess Agustn Badillo Corona, Mara del Carmen Oliver Salvador, Claudio Garibay Orijel, Csar Agustn 2
Jimnez Sierra y Hector Molina Jimnez
Instituto Politcnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa
Laboratorio de Ingeniera Gentica
Prctica 1
1. INTRODUCCION
La modificacin gentica de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la
generacin de especies resistentes a condiciones de estrs (sequa, estrs osmtico, etc.),
la mejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminocidos o
precursores de vitaminas, etc.), obtencin de plantas para fitoremediacin (remocin de
metales pesados), la obtencin de variedades con flores de color no convencional, la
produccin de alguna protena o metabolito con propiedades teraputicas (vacunas,
anticuerpos, alcaloides, etc.).
Esta ltima es de gran inters para los Ingenieros Biotecnlogos ya que la produccin de
metabolitos y protenas en plantas presenta varias ventajas en comparacin con el resto
de los sistemas de produccin. Algunas de estas ventajas son: el costo de produccin es
en muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, protenas ms
complejas (anticuerpos, protenas con varios enlaces disulfuro, protena que requieren un
procesamiento postraduccional, etc.) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas
y granos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.
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2. OBJETIVOS
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3. MATERIALES
3. 1 Materiales biolgicos
Plsmido pROK CRE. Este plsmido es un derivado del plsmido pBIN 19, el
cual contiene el gen CRE fusionado a la secuencia del pptido de transferencia
RbcS y se encuentra bajo el control del promotor 35S. Contiene adems el gen
nptII que codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere
resistencia a kanamicina en las clulas portadoras del gen.
Cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plsmido binario desarmado
que porta los genes vir.
Plantas de N. tabacum cultivadas en condiciones de asepsia en un cuarto de
cultivo a 25C durante 4-6 semanas.
Primers para la amplificacin total o parcial por PCR del gen nptII.
3.2 Equipos
3. 3 Material de laboratorio
Medio LB, Ampicilina 100 mg/mL, Carbamicilina 500 mg/mL, Kanamicina 100
mg/mL, etanol al 70%, solucin de hipoclorito de sodio 5.5 % de cloro libre
(solucin al 10% de cloro comercial), HCl 1.0 N, NaOH 1N, agua grado biologa
molecular.
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4. MTODOS
Medio LB
Medio NBM
2. Control positivo. Inocular una cepa silvestre de Agrobacterium en otra placa con
medio LB con kan y estr.
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Medio NBM
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Esta sesin ser dedicada al anlisis de resultados de forma grupal con la moderacin del
profesor.
Presentacin y discusin de los resultados por parte de los estudiantes de forma grupal.
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El informe de la prctica debe contener los resultados de los todos los equipos y hacer la
discusin y conclusiones de los experimentos realizados.
6. BIBLIOGRAFIA.
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[3] Garfinkel, D. J. et al. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the TDNA
by site-directed mutagenesis. Cell. Vol. 27 (1981); p. 143-153.
[5] Hansen, G. and Chilton, M-D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe,
in Current Topics in Microbiology and Immunology (Vol. 240), Plant Biotechnology
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Prctica 2
1-. INTRODUCCION
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Vectores pET
Es una familia de vectores derivada del plsmido pBR322. Poseen una secuencia
consenso de alta afinidad a la T7 Pol, y de muy baja afinidad a la polimerasa de E. coli.
El gen de inters esta clonado despus de esta regin promotora, por lo que su expresin
en cepas que carecen de la polimerasa del bacterifago T7 es sumamente baja.
Cuando se conjuga una cepa como BL21 y un plsmido de la familia pET se tiene alto
control sobre la expresin de la protena de inters pues esta solamente es inducida
cuando se aade al medio de cultivo un inductor del opern lac. Generalmente se utiliza
un inductor gratuito como el IPTG.
2-. OBJETIVOS
2.1-. General:
2.2-. Especficos:
3-. MATERIAL
3.1-. BIOLOGICOS:
Cepa E.coli BL21, vector pET16b con el gen de la protena verde fluorescente gfp de
Aquea victoria.
3.2-. EQUIPOS
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Matraces, micropipetas y puntas, cajas petri, tubos eppendorf de 0.5 mL y de 1.5 mL,
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4. METODOLOGA
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1. Hacer observaciones de las cajas Petri. Poner especial atencin a los controles.
2. Almacenar las cajas a 4C hasta el momento de usarlas
3. Tomar una colonia y transferirla a un tubo con 5 mL de medio LB con ampicilina
100 g/mL.
4. Incubar los tubos en agitacin durante toda la noche (12-16 h) con agitacin
constante (>200 rpm) a 37C
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6. BIBLIOGRAFA
1-. Terpe Kay (2006). Overview of bacterial expresin systems for heterologous protein
production: from molecular and biochemical Fundamentals to comercial systems.
Microbiol Biotechnol.
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ANEXO I
pH 7.0
Medio SOC
pH 7.0
Antibiticos
Estreptomicina 300 mg/ml
Kanamicina 25 mg/ml
Ampicilina 100 mg/ml
Carbamicilina 200 mg/ml
MS I ( Macronutrientes ) mg/L
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2O 370
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KH2PO4 170
MS II ( Micronutrientes )
IK 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4.4H2O 22.3
ZnSO4.7H2O 8.6
NaMoO4.2H2O 0.25
CuSO4..5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
EDTA 37.3
FeSO4.7H2O 27.8
MS0
Medio Base MS
Sacarosa 30 g/L
pH 5.5
MSB5
Medio MS0
Inositol 1 mg/L
Piridoxina 0.1 mg/L
Tiamina 2 mg/L
cido Nicotnico 0.1 mg/L
pH 6
NBM
Medio MSB5
cido Naftalen Actico (NAA) 0.1 mg/L
Benzil Aminopurina (BAP) 1 mg/L
pH 5.9
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ANEXO II
PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD
En Biologa Molecular se emplean algunos reactivos qumicos peligrosos, por esta razn
el frasco que contiene el reactivo, deber llevar una etiqueta que describa la naturaleza de
riesgo y los procedimientos de seguridad que debern seguirse, cuando se trabaja en un
laboratorio con tcnicas de Biologa de Molecular.
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Bibliografa
Sambrook, J. & D. Russel 2001. Molecular Cloning Book 1. 3ra. ed., Cold Spring Harbor
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