24/05/2017

Fermentaciones - fermentadores o biorreactores

El crecimiento microbiano se considera para la visualizacin de las
Es el corazn del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores
actividades de las clulas vivas. Es importante para controlar el crecimiento celular
etapas de separacin y purificacin.
y las actividades biolgicas y biocataltica en el metabolismo celular.
discontinuas o batch
Fermentaciones semicontinuas (fed-batch) Una variedad de mtodos estn disponibles para predecir el crecimiento celular
continuas por mediciones directas o indirectas.

Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica del La clula de peso seco, la densidad de la clula ptica, la turbidez celular, la
crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la respiracin celular, la tasa metablica y metabolitos son bastante adecuados para
velocidad de formacin de los productos deseados. el anlisis del crecimiento celular, la utilizacin del sustrato y formacin de
producto.
Cintica de crecimiento de biomasa
Varios son los bioprocesos modelados por la utilizacin del sustrato y formacin
Definiciones de producto.
Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan
Cuantificacin de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin
de Monod
Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato

La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia entre la

Cintica de crecimiento microbiano velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de biomasa
por muerte celular o por metabolismo endgeno:

neta = g k d

Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la

concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin
msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere la
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin autocataltica. La velocidad concentracin msica.
de crecimiento est relacionada con la concentracin de clulas.
Formas de medir la concentracin de clulas
Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1):
Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta
rpida.
X: concentracin msica de clulas (g/L) Directos
t: tiempo (h) Mtodos Indirectos

Determinacin de la concentracin msica de clulas: Cintica de crecimiento de un cultivo en batch

Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin): Etapas:
Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)
1) de latencia o induccin
Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndar
Absorcin de luz por clulas en suspensin
2) de crecimiento
Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como son exponencial
la velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un producto.
Productos: etanol, CO2 3) de desaceleracin
Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o N 4) estacionario
Propiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH
5) de muerte o declinacin
celular

3) Desaceleracin: por consumo de un nutriente esencial o generacin de

productos de la desregulacin celular
5) Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la etapa
anterior.

1

1) Latencia: adaptacin del inculo al medio. Depende del
inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas ,
crecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3) Desaceleracin: por consumo de un nutriente esencial o
generacin de subproductos txicos, crecimiento
desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4) Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an
son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.
antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular
5) Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con
la etapa anterior.
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas
crecen con la misma velocidad la composicin media de las
mismas permanece constante. Es vlido para la etapa de
crecimiento exponencial.
En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los
nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.
Los microrganismos presentan un crecimiento cataltico y se puede
describir mediante el siguiente modelo matemtico:
=
Donde:
: =22
: =2
:
Si la duplicacin celular ocurre en potencias de dos
la recurrencia se da de la siguiente manera:
=2
=2
=2
Se tiene que la ltima ecuacin es el nmero de
clulas que finales que se obtienen despus de un
cierto nmero de divisiones celulares.
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FASES DE CRECIMIENTO
Una vez que existe una cantidad apreciable de clulas, y estn creciendo muy
rpidamente, el nmero de clulas aumenta de manera exponencial.
La densidad celular ptica de un cultivo puede entonces ser fcilmente detectado; esa fase
se conoce como la fase de crecimiento exponencial. La tasa de sntesis celular aumenta
bruscamente, el aumento lineal se muestra en la grfica semilogartmica con una
pendiente constante representa una constante de velocidad de la poblacin celular. En
esta etapa se utilizan fuentes de carbono y productos se forman. Por ltimo, la rpida
utilizacin de sustrato y la acumulacin de productos puede conducir a la fase
estacionaria, donde la densidad celular se mantiene constante. En esta fase, la clula
puede empezar a morir como la tasa de crecimiento de las clulas equilibra la tasa de
mortalidad. Es bien sabido que el biocatalticas actividades de la clula puede disminuir
gradualmente a medida que envejecen, y finalmente autolisis puede tener lugar. Las
clulas muertas y metabolitos celulares en el caldo de fermentacin pueden crear la
toxicidad, por lo desactivacin de las clulas restantes. En esta etapa, una fase de muerte
desarrolla mientras la clula densidad baja drsticamente si los metabolitos secundarios
txicos estn presentes. La fase de muerte muestra una disminucin exponencial en el
nmero de clulas vivas en los medios de comunicacin mientras que los nutrientes son
empobrecido. En realidad, los cambios se detectan mediante el control del pH de los
medios de comunicacin.
Duplicacin celular
modelado matemtico
Se tiene que una clula crece progresivamente y se divide en dos clulas
iguales.
Contando que se tiene un nmero inicial de clulas llamado y
queremos averiguar el nmero final de clulas la duplicacin celular
es la siguiente:
=2
Si la clula que se duplic se vuelve a duplicar tenemos que:
Tiempo de duplicacin celular
modelado matemtico
Es el tiempo que en que una clula se duplica. En el caso de
las bacterias el tiempo de regeneracin es de 20 min a 20
hrs en donde cada intervalo es menor a 1 hr
Para obtener el tiempo de duplicacin como modelo
matemtico usamos la ecuacin diferencial de crecimiento
celular:
=
Resolviendo la ecuacin diferencial por el mtodo de
variables separables tenemos lo siguiente:
2
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" "
Se tiene:
! = ! &'
=
" "
Queda como:
ln = + Si evaluamos la siguiente condicin =2
Rearreglando y usando antilogaritmos:
Obtenemos el tiempo de duplicacin celular:
= &'

ln 2
Evaluando la condicin inicial: =
A = 0; =

El parmetro es la velocidad especfica de crecimiento

celular y es la relacin de crecimiento de la clula en
funcin de los nutrientes del medio.
Esta variable la podemos obtener por medio de la
ecuacin de Monod:

-
= *+,
./ + -
Donde:

-:
*+, :
./ :

Combinando la ecuacin de Monod y la ecuacin de

Dicha ecuacin es usada como parmetro de diseo crecimiento microbiano se tiene la siguiente ecuacin:
en los biorreactores ya que es la ecuacin que ms
tiene similitud con el comportamiento poblacional de -
= *+,
./ + -
microorganismos y que depende tambin de la
cantidad de sustrato contenido en el biorreactor.

La ecuacin de Monod se utiliza para encontrar la tasa cuando se desea obtener *+, y ./ se linealiza la
de crecimiento a velocidad de crecimiento constante. ecuacin diferencial de la siguiente manera:

1,
si 1'
= ,

3
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-
, = *+,
./ + -

1 ./ + -
= La linealizacin anterior se hace cuando se desea
, *+, - averiguar el crecimiento celular para el caso que la
1 ./ 1
velocidad especfica de crecimiento sea constante.
= +
, *+, - *+,

Multiplicando por - :

- ./ 1
= + -
, *+, *+,

Integrando la ecuacin diferencial de a y de - a -

Para el caso de que la velocidad de crecimiento se halle en , /

un sistema(reactor) Batch y dependa a su vez de la ! = 3 ! -
concentracin del sustrato se tiene que introducir el ,6 /6
concepto de rendimiento de la reaccin, que se define Tenemos la siguiente ecuacin
como:
=3 - -
Despejando a S:
3=
-
-=- +
3
En trminos de diferencial: Y sustituyendo en la ecuacin diferencial
3=
- -
= *+,
./ + -

' ,7
Queda de la siguiente manera: 3- + 3./ +
*, ! =!
,6 3- +
*,
= - +
- + + ./ 3
3 Resolviendo por fracciones parciales la integral se ve
como:
Arreglando trminos ' ,7
3- + 3./ + 1 3./
*, ! =! +
,6 3- + 3- + 3- +
3- + *,
=
3- + 3./ +
Integrando queda como:
Resolviendo la ecuacin diferencial por el mtodo
de variables separables 3- + 3./ + 8 3./ 3-
ln + ln = *,
3- + 3- + 3- + 8

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En resumen:

g neta = = neta dt X =X 0e neta t

1 dX dX
La ecuacin antes deducida es la variante de la ecuacin de Monod X dt X
para sistemas que dependen directamente de la concentracin del
sustrato ya que de el depende si el crecimiento celular es eficiente o Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
provocar la muerte celular, asimismo, es una consideracin en el
X =2X 0 d =
diseo de reactores biolgicos . ln(2)
neta

Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no
crecen con la misma velocidad la composicin media se modifica.
Esta situacin caracteriza especialmente a la Etapa estacionaria
El estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de
subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil
induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevas
condiciones.
g neta = g k d
Puede ocurrir:
La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el
nmero de clulas viables.
X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo
de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertas
constituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico).
X constante pero su metabolismo es activo; cambia la
regulacin celular produciendo metabolitos secundarios.
Coeficiente de mantenimiento: se emplea para definir la
velocidad especfica de consumo de sustrato para energa de
mantenimiento.
Energa de mantenimiento: necesaria
para mantener la membrana celular activa
y el transporte de nutrientes, y para
funciones metablicas esenciales como la
movilidad y la reparacin de estructuras
daadas.
Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida de
masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).

Fase de decrecimiento Coeficientes de rendimiento:

Se definen en base a la cantidad consumida de otro componente.
Rendimiento de formacin de clulas por masa
En esta fase ocurre la Lysis celular
de sustrato consumida (g clulas/g S)
La velocidad de decrecimiento celular obedece a una velocidad
YX/S es un valor constante en la etapa de
de reaccin de primer orden.
crecimiento exponencial.
Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser
constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea
para otros fines:
S=Sformacion +Sformacion +Senergia +Senergia
de biomasa de productos para cre- para man-
cimiento tenimiento
El crecimiento celular se puede reestablecer transfiriendo un
medio fresco.
Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:

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Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en

glucosa; para la mayora de las bacterias y levaduras: CINETICA DE PRODUCCION
YX/S =0,40,6 g/g ; YX/O =0,91,4 g/g
2
(en condiciones anaerbicas suelen ser menores)

Los rendimientos
dependen del medio
y de la fuente de C.
Para la mayora de
los casos:

Efectos de la temperatura en el crecimiento celular Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin
de productos:
Definimos la velocidad especfica de formacin de producto, qP

Se encuentran 3 situaciones:
(a) qP asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una
enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).

(b) qP parcialmente asociada (etapa de desaceleracin y estacionaria), ej:

fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos metabolitos secundarios.

(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde la g=0) ej.:

metabolitos secundarios como antibiticos.

Factores que influyen Temperatura del medio

Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin de productos:

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Por encima de Top ocurre muerte celular disminuye el nmero de clulas viables
cuando la velocidad de muerte supera la de crecimiento.
Ambas velocidades siguen una ecuacin tipo Arrhenius con

La muerte celular es ms sensible a T que el crecimiento (importante para la esterilizacin)

La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero la Top y la Ea suelen ser

distintas.
Tambin influye sobre el YX/S porque para T > Top, la energa de mantenimiento es mayor
y baja YX/S
Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.

Cintica de crecimiento microbiano: Modelos Cuantificacin de la cintica de crecimiento: modelos cinticos

Descripcin detallada implica que debera involucrar diferenciaciones en la estructura
de la clula y la segregacin del medio de cultivo en unidades que pueden tener
diferentes concentraciones y propiedades fsico-qumicas as tenemos : modelos
estructurados-segregados

Modelos Estructurados
Tienden a representar la estructura de las clulas. Pueden dividir la clula en sus
componentes y considerar las reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar
en cada zona de la clula, como respuesta a cambios en el medio.

Modelos Segregados
Tienen en cuenta que el medio no es homogneo, permiten variaciones de
concentraciones de biomasa y de nutrientes y diferencias en las propiedades
fisicoqumicas del medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). Tambin permiten
considerar la posibilidad de agregacin de clulas.

Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados

Modelos No-Estructurados

Suponen una composicin fija de la clula (equivalente a suponer crecimiento

balanceado).

-Son estrictamente vlidos para la etapa de crecimiento exponencial en batch -No

andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la clula sea rpida y/o las
perturbaciones sean leves.

Modelos No-Segregados

Consideran un medio homogneo.

-Representan adecuadamente muchos casos.
El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del objetivo se debe elegir el
modelo ms simple capaz de representar en forma adecuada al sistema que nos
interesa.

7

Modelos cinticos de crecimiento: controlados por sustrato
Suponen que la cintica depende solamente de un nico sustrato esencial
(por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no afectan. Ms
difundido Modelo de Monod
Supone que un nico sistema enzimtico
controla el consumo de sustrato y que
dicho sistema determina la velocidad de
crecimiento de biomasa.
La premisa es generalmente falsa, pero
la ecuacin de Monod ajusta una amplia
gama de resultados experimentales y es
la expresin ms empleada para el
diseo de fermentadores.
Factores que afectan al crecimiento
Factores que influyen pH del medio
Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH. Existe un pH ptimo para
cada tipo de clula, generalmente prximo a 7. Se puede incrementar el rango
adaptando las clulas por incrementos pequeos.
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Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de crecimiento y baja
densidad de clulas.
Para cultivos concentrados se usan expresiones similares, modificando Ks:
Concentracin msica de clulas en estas condiciones
(EE y sin metabolismo endgeno):
Como adems g = D , si la formacin de
productos extracelulares es despreciable:
Estrictamente, depende de la concentracin de sustrato y de la velocidad de
crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0
La productividad en un fermentador continuo se obtiene como
el producto del factor de dilucin por la concentracin de
clulas, DX (g/Lh)
El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la
formacin de producto.
Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del
ptimo.
El pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.
- levaduras: 3 6
- hongos: 3 7
- clulas vegetales: 5 6
- clulas animales: 6,5 7,5
Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa
de mantenimiento.
El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N,
aminocidos, CO2)
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Factores que influyen concentracin de O2 disuelto (DO):

Es un sustrato importante para las fermentaciones

aerbicas.

Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede

ser un limitante de la velocidad de crecimiento.
La solubilidad del oxgeno en agua depende de la
presin, de la temperatura y de las sales disueltas (a
presin atmosfrica es 7ppm).
La concentracin crtica de oxgeno disuelto
CO2,critica es aquella por debajo de la cual comienza
a controlar la velocidad de crecimiento:
510% de la concentracin de saturacin para
bacterias y levaduras y 1050% de la
concentracin de saturacin para hongos (segn el
tamao)

Transporte de oxgeno a las clulas Factores que influyen otros factores

Potencial redox: afecta las reacciones de xido-reduccin. Esta relacionado

El O2 se introduce por
con la concentracin de O2, el pH y las concentraciones de otros iones.
burbujeo y su concentracin
Potencial de reduccin del medio:
depende de la agitacin.

Se puede reducir bajando la concentracin de O2 (burbujeo de nitrgeno) o

por agregado de agentes reductores (cistena, Na2S, HCl).

Concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser txica para algunas
clulas y necesaria para otras.
Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo.

Fuerza inica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el

interior de las clulas. Depende de la concentracin y de la carga de los iones
en el medio:

Generacin de calor por crecimiento microbiano

4050% de la energa suministrada por las fuentes de C se convierten en ATP
(forma en que las clulas acumulan energa) el resto se libera como calor.
El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpas de combustin del
sustrato y de la biomasa formada:
Algunos valores tpicos: Hc ~ 20 25 kJ/g clulas YH ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30
g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol) 0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)
El grado de oxidacin del sustrato afecta fuertemente la cantidad de calor que
evoluciona por el metabolismo de las clulas.
Para clulas en crecimiento acUvo, el requerimiento para mantenimiento es bajo la
evolucin de calor est directamente relacionada con el crecimiento.

Velocidad total de generacin de calor en una fermentacin batch se calcula

considerando la velocidad de crecimiento.

En una fermentacin aerbica, se correlaciona con la velocidad de consumo de

oxgeno, dado que es el aceptor final de electrones.

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Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa (b) serpentn

externo (c) serpentn interno helicoidal (d) serpentn interno tipo deflector (e)
intercambiador de calor externo

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