couvs 2 et 3.

indd 1 25/07/12 16:16

 Fermentis tiene la satisfaccin de presentar la gua
prctica de levaduras y fermentacin especial-
mente ideada para produccin de tequila. El
objetivo de este proyecto es proporcionar
consejos tcnicos tiles para poder lle-
var adelante un manejo correcto de la
fermentacin alcohlica a partir de
levadura en formato seco, priori-
zando rendimientos y calidad orga-
nolptica.

El contenido de nuestra gua

tambin puede ser bajado desde
la seccin tequila en el sitio
www.fermentis.com.
Visite nuestro sitio web!

couvs 2 et 3.indd 2 25/07/12 16:16

 ndice
Levadura y tequila 3
Tipos de levaduras en la industria tequilera
Qu es la levadura activa seca?
Levaduras Fermentis para produccin del tequila

El crecimiento de las levaduras y cintica de fermentacin 8

El crecimiento de las levaduras
Velocidad de produccin de alcohol durante la fermentacin

Factores que afectan el desempeo de las levaduras 11

en la fermentacin alcohlica
Factores fsicos
Factores qumicos
Factores biolgicos

Manejo de levaduras en la industria tequilera 15

Rehidratacin
Inoculacin
Fermentacin

Influenca de las levaduras en la produccin de los principales 23

compuestos voltiles y otras sustancias relevantes
Acetaldehdo
Alcoholes superiores
steres
Metanol

Nutricin 25
Nitrgeno
Vitaminas
Minerales
Factores de supervivencia
Adicin de derivados de levaduras como activadores de fermentacin

Tecnologa VHG 31
Caracterizacin de Safteq silver y Safteq blue 32
Bibliografa 35

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 La seccin 4.34 de la norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 define al tequila de la siguiente manera:
Bebida alcohlica regional obtenida por destilacin de mostos, preparados directa y originalmente
del material extrado en las instalaciones de la fbrica de un productor autorizado, la cual debe estar
ubicada en el territorio comprendido en la Declaracin, derivados de las cabezas de Agave tequilana
weber variedad azul, previa o posteriormente hidrolizadas o cocidas, y sometidos a fermentacin
alcohlica con levaduras, cultivadas o no, siendo susceptibles los mostos de ser enriquecidos
y mezclados conjuntamente en la formulacin con otros azcares hasta en una proporcin no
mayor de 49% de azcares reductores totales expresados en unidades de masa, en los trminos
establecidos por esta NOM y en la inteligencia que no estn permitidas las mezclas en fro. El tequila
es un lquido que, de acuerdo a su clase, es incoloro o coloreado cuando es madurado o cuando es
abocado sin madurarlo:

El tequila tiene establecido un territorio de denominacin de origen (TDO) que incluye

181 municipios en Mxico. Entre ellos se encuentran :
Todos los municipios del Estado de Jalisco,
30 municipios de Michoacn,
11 municipios de Tamaulipas,
8 municipios de Nayarit y
7 municipios de Guanajuato.
Las etapas en la produccin de tequila involucran la cosecha del agave y preparacin de las
cabezas. Estas son trasladadas a la fbrica donde son sometidas a un proceso de cocimiento
para hidrolizar los fructanos, el principal polisacrido del agave. Una vez cocidas, las cabezas
se muelen y se extrae un jugo rico en azcares, que es fermentado. El vino generado es
posteriormente destilado (doble destilacin) para producir el tequila conocido como blanco.
Las versiones reposado, aejo y extra aejo requieren un cierto tiempo de aejamiento
en barricas de roble, que es establecido por la norma que regula la produccin de tequila.

Guide Tquila.indd 2 26/07/12 17:19

 Levadura y tequila

Tipos de levaduras en la industria tequilera

Las levaduras son hongos predominantemente unicelulares que incluyen varios taxones. Existen
ms de 700 especies de levadura, algunas de ellas muy conocidas debido a sus aplicaciones
industriales, principalmente las correspondientes al gnero Saccharomyces, de amplia utilidad
en la produccin de pan y bebidas alcohlicas, as como alcohol industrial.

La industria tequilera, as como en toda actividad que involucra una fermentacin alcohlica,
necesita de la accin de las levaduras, justamente para transformar los azcares en alcohol.
Pero no slo es importante este producto mayoritario de la fermentacin. Las levaduras tambin
contribuyen en forma notoria a la produccin de compuestos voltiles, influenciando el perfil
sensorial de manera significativa.

Contrariamente a lo que ocurre en otras industrias de la fermentacin alcohlica (por ejemplo: la

enolgica, cervecera, otras espirituosas), en muchas tequileras, la fermentacin es an conducida
en forma espontnea. En este tipo de fermentaciones, los mostos suelen ser colonizados en forma
progresiva por diferentes tipos de microorganismos. Algunos estudios han establecido patrones
de colonizacin de microorganismos en fermentaciones espontneas de mostos de agave, como el
trabajo de Lachance (1995), que describi, en una primera instancia, la presencia de Torulaspora
delbrueckii, Hanseniaspora spp. y Kluyveromyces marxianus, para dar luego, progresivamente,
lugar a otras especies, como Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri
y Brettanomyces spp. En trminos generales, las especies ms resistentes al alcohol son las que
dominan la segunda parte de la fermentacin y entre ellas siempre se encuentra Saccharomyces
cerevisiae.

Debido a que el proceso incluye la exposicin del agave a elevadas temperaturas antes de la
fermentacin alcohlica, con la consecuente eliminacin de la flora microbiana proveniente
junto a la materia prima, las especies indgenas que colonizan los mostos estaran, ms bien,
instaladas en las plantas (pudiendo provenir originalmente del agave) y es muy factible que haya
una secuencia de sucesos con patrones colonizacin del mosto bien definidos, que se repitan
fermentacin tras fermentacin. Si bien hay consenso general que involucrar muchas especies

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 de levaduras en la fermentacin alcohlica puede ser enriquecedor respecto a la produccin
de compuestos voltiles y bouquet de una bebida, an con patrones de comportamiento que
suelen repetirse, es extremadamente difcil lograr consistencia en el proceso. La composicin
del mosto depende bsicamente de la materia prima, que vara, a su vez, con las condiciones
agronmicas. El pH, la temperatura, perfil de azcares y su concentracin, nutricin, compuestos
txicos, estrs osmtico, etc., son algunos de los parmetros que pueden variar e influenciar la
fermentacin alcohlica y, principalmente, afectar los patrones de colonizacin de los mostos.
En procesos que se apoyan en fermentaciones espontneas, estas variables son las encargadas
de generar inconsistencias y, muchas veces, alteraciones en los perfiles sensoriales de una
bebida, as como rendimientos pobres, que causan prdidas econmicas muy importantes. Por
tal motivo, gran parte de la industria se ha volcado al empleo de levaduras seleccionadas, que
al inocularse en altas concentraciones, pueden implantarse exitosamente y predominar en el
proceso, logrando, como consecuencia, repetitividad y consistencia. Inclusive, a travs del uso
de cepas especficas, se pueden lograr mejoras sustanciales en los rendimientos y, por supuesto,
en las caractersticas sensoriales.

Algunas plantas han logrado caracterizar cepas de levadura a partir de sus procesos y aislaras.
Estas pueden ser propagadas en planta hasta los niveles de biomasa necesarios, para luego
utilizarse en la fermentacin. Sin embargo, la propagacin desde laboratorio suele demorar
varios das y, en la mayora de los casos, la obtencin de una biomasa saludable para lograr
consistencia en el proceso se torna muy complicada. Esto puede ser fcilmente solucionado a
partir del empleo de levadura activa seca (LAS), directamente en fermentacin o realizando una
fase previa de propagacin corta. Muchas plantas tequileras han optado por LAS, ya que a travs
de su empleo logran mejorar la consistencia y rendimientos, uniformizar patrones organolpticos
y disminuir costos operativos asociados al mantenimiento y propagacin de las cepas desde
cero (costo de personal muy calificado y de laboratorios equipados para tal propsito).

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Qu es la levadura activa seca (LAS)?
Las LAS son producidas a partir de cultivos puros de levaduras, obtenidos por Lesaffre
International R&D, ubicado en la Ciudad de Marcq en Baroeul, norte de Francia, que cuenta con
laboratorios equipados con tecnologa de punta, especializados en el desarrollo de levaduras
para las distintas industrias de la fermentacin, y con uno de los bancos de microorganismos
ms importantes del mundo.

Las cepas puras de levadura son custodiadas por Lesaffre International R&D y enviadas, luego de
anlisis muy exhaustivos, a las plantas del grupo para su posterior propagacin.

En las plantas industriales, las levaduras son crecidas inicialmente en laboratorios especializados
y luego en fermentadores industriales. Una vez alcanzada la biomasa necesaria, sta se concentra
por centrifugacin y filtros rotatorios de vaco hasta formar una pasta, que luego es extruida y
secada con tecnologa especfica que permite llevar la materia seca a 94 - 96,5 %, manteniendo
altas viabilidades en el producto terminado.

Figura 1. Fotos obtenidas por microscopa de levadura activa seca.

Aumento de 25 veces. Se diferencian Aumento de 1600 veces. Se empiezan Aumento de 6400 veces. Se visualizan
los pellets obtenidos luego del secado a diferenciar las clulas clulas con detalles

El producto es empacado al vaco en un envase trilaminado que no permite el intercambio

gaseoso, as como el pasaje de luz. Este tipo de acondicionamiento permite que el producto
tenga una vida til mnima de 2 aos.

Los productos Fermentis slo son liberados al mercado luego de pasar un control de calidad
muy estricto, que verifica el cumplimiento de especificaciones muy rigurosas, implicando
anlisis microbiolgicos, fisiolgicos, tests de viabilidad y vitalidad, as como otros especficos
desarrollados por Lesaffre.

Figura 2. Esquema simplificado de produccin de LAS

Almacenamiento de Filtro rotatorio Secado instantneo

Laboratorio Fermentacin Centrifugacin crema de levadura de vaco de levadura

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 Levadura seca para Tequila

Ingredientes: Levadura (Saccharomyces cerevisiae), agente emulsionante (E491)

Propiedades: Levadura clsica tequilera, utilizada desde hace varios aos por la industria, con
un perfil organolptico muy clsico. Fue seleccionada gracias a su buen desempeo en jugos
SafTeq

de agave destinados a la produccin tequila y mezcales. Fermenta muy bien jugos de agave
suplementados con azcares que no provienen del agave, como por ejemplo melazas de caa o
sacarosa.

Temperatura ptima de fermentacin: 32 C

Packaging disponible en dos presentaciones:

Caja conteniendo 20 sachets x 500 g
Caja conteniendo 1 sachet x 10 kg
Nota: todos los sachtes estn cerrados al vaco en un envase trilaminado, que impide el intercambio gaseoso y pasaje de luz.

Almacenaje: Es preferible almacenar la levadura en sitios frescos, con temperaturas menores

a los 10 C, para conservar su vida til. Se recomienda no utilizar sachets que se encuentren
blandos (prdida de vaco).

Los sachets abiertos y utilizados parcialmente pierden el vaco y, por lo tanto, deben ser guardados
bien sellados a 4 C. En estas condiciones, la levadura puede utilizarse en los siguientes 7 das.
Pasado dicho perodo, se recomienda el descarte.

Vencimiento: Fermentis recomienda el uso de la levadura dentro de los 24 meses de su fecha

de produccin, siempre y tanto hayan sido almacenadas bajo condiciones recomendadas en la
seccin Almacenaje.

Anlisis tpico:

Nota importante: Se informa que cualquier cambio en el proceso fermentativo puede alterar la calidad del producto. Por lo
tanto, siempre se recomienda la implementacin de ensayos antes de de utilizar la levadura en forma comercial

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 Levaduras Fermentis para produccin tequila
Ingredientes: Levadura (Saccharomyces cerevisiae), agente emulsionante (E491)

Propiedades: Levadura seleccionada por Fermentis y evaluada por el CIATEJ para fermentar
Levadura seca para Tequila

jugos de Agave tequilana weber variedad azul, destinados a la produccin de tequila,

suplementados o no con otros tipos de azcares. Su excelente performance en este medio se
debe a la capacidad de tolerar sustancias txicas como furfurales, normalmente presentes en
los jugos de agave. Posee tambin elevada tolerancia a la presin osmtica y al alcohol, que
permite trabajar en condiciones de VHG (ver seccin Tecnologa VHG para ms informacin)
y temperaturas ms altas. Presenta una velocidad de fermentacin muy superior a cepas clsicas
tequileras, acortando los tiempos del proceso.

Packaging disponible en dos presentaciones:

Caja conteniendo 20 sachets x 500 g
Caja conteniendo 1 sachet x 10 kg

Nota: todos los sachtes estn cerrados al vaco en un envase trilaminado, que impide el intercambio gaseoso y pasaje de luz.

Almacenaje: Es preferible almacenar la levadura en sitios frescos, con temperaturas menores

a los 10 C, para conservar su vida til. Se recomienda no utilizar sachets que se encuentren
blandos (prdida de vaco).

Los sachets abiertos y utilizados parcialmente pierden el vaco y, por lo tanto, deben ser guardados
bien sellados a 4 C. En estas condiciones, la levadura puede utilizarse en los siguientes 7 das.
Pasado dicho perodo, se recomienda el descarte.

Vencimiento: Fermentis recomienda el uso de la levadura dentro de los 24 meses de su fecha

de produccin, siempre y tanto hayan sido almacenadas bajo condiciones recomendadas en la
seccin Almacenaje.

Anlisis tpico:

Nota importante: Se informa que cualquier cambio en el proceso fermentativo puede alterar la calidad del producto. Por lo
tanto, siempre se recomienda la implementacin de ensayos antes de de utilizar la levadura en forma comercial

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 El crecimiento de las levaduras y
cintica de fermentacin

El crecimiento de las levaduras

Las levaduras, como todo microorganismo, pasan por diferentes etapas de crecimiento cuando
son inoculadas en un medio conteniendo azcares (mosto).

Figura 3. Las distintas fases de una tpica curva de crecimiento de levaduras. El grfico representa
el logaritmo en base 10 de la concentracin de clulas/ml en funcin del tiempo de fermentacin.

1. Fase de latencia o perodo lag: En esta etapa la poblacin de levaduras es inoculada en

el mosto y debe adaptarse o aclimatarse al nuevo medio. Se registra una intensa actividad
metablica, pero sin crecimiento, ya que las levaduras estn avocadas a la readecuacin de su
maquinaria biolgica al nuevo ambiente.

2. Fase de aceleracin de crecimiento: En esta etapa la poblacin de lavaduras comienza a

dividirse asexualmente por gemacin o fisin. Cada clula que entra en divisin genera dos
clulas. Inicialmente, en la fase de aceleracin, el tiempo generacional (tiempo que una clula

Guide Tquila.indd 8 26/07/12 17:19

 demora entre dos divisiones celulares sucesivas o tiempo de duplicacin de la poblacin) es
muy largo y ste va disminuyendo conforme avanza el tiempo, hasta alcanzar el mnimo valor
registrado durante toda la curva de crecimiento, que coincide con el comienzo de la etapa
siguiente (fase exponencial).

3. Fase exponencial de crecimiento: En esta etapa se registra un crecimiento mximo, debido

a que tanto el medio como el estado fisiolgico de las clulas es el ideal para expandir la
poblacin. El tiempo generacional se mantiene constante y es el mnimo alcanzado durante la
curva de crecimiento. La poblacin se duplica cada vez que transcurre un tiempo equivalente al
tiempo generacional. El crecimiento de la poblacin en esta fase se puede predecir fcilmente
con la ecuacin a continuacin:

n = n02G
donde:
n = nmero de clulas a un tiempo dado
n0 = nmero de clulas al inicio de la fase exponencial
G = tiempo generacional = t/z (t = tiempo; z = nmero de generaciones)

4. Fase de desaceleracin de crecimiento: En esta etapa los nutrientes empiezan a escasear o

se incrementa la toxicidad de algunos metabolitos (por ejemplo: etanol) y las condiciones dejan
de ser ideales para sostener un crecimiento mximo como en la etapa anterior. Paulatinamente,
el tiempo generacional se incrementa, produciendo una desaceleracin del crecimiento. Las
clulas se adaptan al nuevo medio y se preparan para resistir una etapa de escasez.

5. Fase estacionaria: En esta etapa el crecimiento celular iguala la muerte celular. Por lo
tanto, no se registra variacin en el nmero neto de clulas vivas. Las clulas pueden sobrevivir
perodos prolongados en esta condicin. Sin embargo, comienzan a exponerse cada vez ms a la
toxicidad del alcohol y potencialmente otras sustancias, como pueden ser los cidos orgnicos,
disminuyendo la productividad.

6. Fase de muerte celular: La tasa de mortandad supera la tasa de crecimiento y la poblacin de

clulas vivas comienza a declinar.

Velocidad de produccin de alcohol durante la fermentacin

La velocidad de produccin de alcohol (etanol) o productividad de alcohol no es constante
durante la fermentacin. Esta es funcin del nmero de clulas y su estado fisiolgico.

En la figura 4 se muestra una curva de crecimiento y cmo vara la productividad de alcohol

en las distintas etapas. La mxima productividad es alcanzada durante la fase de crecimiento
exponencial, cuando las clulas se dividen rpidamente con tiempos generacionales muy cortos.
Sin embargo, en la etapa estacionaria, aunque no hay crecimiento neto de la poblacin de
levadura, tambin se produce alcohol. En esta etapa puede producirse a una velocidad hasta 30
veces menor que la mxima alcanzada en la fase exponencial.

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 La velocidad de produccin de alcohol determina el patrn de acumulacin de este metabolito,
tal cual se muestra en la figura 4.

El conocimiento de las curvas de produccin de alcohol es vital para los diseos de los
equipamientos y los sistemas de control de temperatura. La velocidad de produccin de alcohol
est asociada a la liberacin de energa. Por lo tanto, la mxima demanda de energa para
enfriar las cubas de fermentacin coincide con la velocidad mxima de produccin de alcohol.
Como consecuencia, los sistemas de enfriamiento deben dimensionarse para que puedan actuar
correctamente en la etapa de mayor liberacin de calor y no en funcin del valor promedio del
ciclo fermentativo.

Figura 4. Curva de crecimiento (nmero de clulas por ml vs. tiempo de fermentacin - curva
azul -) superpuesta a la curva de productividad de alcohol (curva roja) y acumulacin de alco-
hol (curva verde). La velocidad de produccin de alcohol y acumulacin de alcohol se expresan
como % de la mxima velocidad alcanzada en el ciclo y como % de la mxima cantidad de alcohol
acumulado, respectivamente.

10

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 Factores que afectan el desempeo
de las levaduras
en la fermentacin alcohlica

En una fermentacin alcohlica es muy importante mantener la viabilidad y vitalidad de la

poblacin de levaduras en valores altos. Existen varios factores de estrs ambiental que afectan la
fisiologa y desempeo de las levaduras disminuyendo su crecimiento y rendimiento fermentativo.
Walker (1999) describi los factores de estrs de relevancia para las fermentaciones industriales,
que pueden ser qumicos, fsicos o biolgicos. Los principales se detallan a continuacin:

Factores fsicos
Temperatura

Las levaduras poseen temperaturas mnimas, ptimas y mximas de crecimiento. Normalmente,

las levaduras del gnero Saccharomyces toleran temperaturas mximas que oscilan entre 35 y 43
C. Sin embargo, a temperaturas mayores de 35 C, el desempeo fermentativo es cada vez ms
pobre, ya que el estrs se incrementa en forma considerable. Los efectos son desvos metablicos
que alteran el perfil sensorial y una clara disminucin del rendimiento. Es normal que las fermen-
taciones a temperaturas elevadas terminen paralizadas, con una gran cantidad de azcares
residuales y disminucin considerable del rendimiento con las prdidas econmicas que ello significa.

El control inadecuado de la temperatura es uno de los problemas ms grandes que sufren las
plantas tequileras, causando prdidas econmicas de importancia. La utilizacin de Safteq blue
puede ser una alternativa, ya que est caracterizada como una cepa termotolerante (ver Manejo
de levaduras en la industria tequilera, seccin fermentacin).

Estrs osmtico

En general, los mostos utilizados para la produccin de bebidas alcohlicas suelen tener altas
concentraciones de solutos, principalmente azcares, ocasionando elevada presin osmtica,
factor de importancia para las levaduras. El efecto que produce la elevada presin osmtica
es la prdida de la turgencia celular por disminucin del agua contenida en el citoplasma y la
consecuente disminucin de actividad enzimtica y desestabilizacin de algunas protenas, entre
otras consecuencias. La especie S. cerevisiae es moderadamente resistente al estrs osmtico e,
inclusive, tiene un mecanismo de respuesta, como la produccin de osmolitos, que permiten
restablecer el volumen citoplasmtico. Es osmolito ms importante es el glicerol, que aumenta

11

Guide Tquila.indd 11 26/07/12 17:19

 su concentracin ante situaciones de estrs. Sin embargo, para su produccin se desvan
azcares, generando cada en los rendimientos.
Actualmente, las industrias de la fermentacin alcohlica buscan cada vez ms trabajar con
elevadas concentraciones iniciales de azcares, tecnologa denominada VHG (del ingls: Very
High Gravity). La tecnologa VHG produce innumerables beneficios, mencionados en la seccin
Tecnologa VHG. Para poder trabajar con tecnologa VHG se requieren cepas de levadura
osmotolerantes y que resistan altas concentraciones de alcohol. Esas dos condiciones las cumple
Safteq blue.
Otros factores fsicos

Otros factores fsicos de estrs son la deshidratacin, presin hidrosttica, mecnicos y

radiaciones.

La LAS es sometida a una deshidratacin durante su proceso de produccin, como fue descripto
anteriormente. La concentracin de materia seca se lleva al 94 96,5% y consecuentemente se
produce una desestabilizacin de las membranas y paredes celulares. En este caso particular,
existen procedimientos adecuados que devuelven a las clulas su estado ideal para poder llevar a
adelante la fermentacin alcohlica y que se describen en secciones posteriores (ver Protocolo
de Rehidratacin)

La presin hidrosttica y la generada por el CO2 producido endgenamente en la fermentacin

suelen ser causales de estrs, en especial en fermentadores de gran altura. La toxicidad del
alcohol se incrementa en estos casos y tambin suelen producirse desvos organolpticos.

El estrs mecnico es producido por agitacin y centrifugacin de alta velocidad. S. cerevisiae

resiste en forma moderada al estrs mecnico debido a la naturaleza de su pared celular y
generalmente no se registran inconvenientes en las plantas.

Factores qumicos
pH

La mayora de las cepas de levadura son medianamente acidfilas, desarrollndose a valores de

pH que oscilan entre 4,0 y 6,5.

En algunos casos suelen conducirse fermentaciones alcohlicas por debajo de los valores
mencionados para controlar infecciones bacterianas. Sin embargo, tambin se produce una
cada en el rendimiento fermentativo ocasionando prdidas econmicas importantes. El grado
de impacto tambin depende de la cepa y otros metabolitos, que pueden incrementar su efecto
txico a pH muy bajo.
Limitacin nutricional

La disponibilidad de algunos nutrientes durante la fermentacin alcohlica puede ser limitante,

causando un efecto negativo. La consecuencia ms comn es la inhibicin del crecimiento

12

Guide Tquila.indd 12 26/07/12 17:19

 y paralizacin de la fermentacin. El nitrgeno, normalmente presente en concentraciones
subptimas en mostos de agave, suele ser un limitante frecuente. En la seccin Nutricin se
discute sobre los principales nutrientes y cmo se realiza el ajuste.

Alcohol (etanol)

La acumulacin del etanol durante la fermentacin alcohlica constituye un factor de estrs

de importancia. Cuando est presente en bajas concentraciones puede ocasionar inhibicin del
crecimiento, pero cuando son elevadas, los efectos son letales.

El alcohol ejerce su toxicidad en varios aspectos de la fisiologa, pero es la membrana plasmtica

la estructura ms daada, ya que se incrementa la fluidez y se ve afectada su integridad.

Si bien S. cerevisiae suele ser resistente a altas concentraciones de alcohol en fermentacin,

existe una gran diferencia intraespecie respecto al lmite mximo de tolerancia. Algunas cepas
no resisten ms all de 5% de alcohol v/v. Sin embargo, algunas industrias de la fermentacin
alcohlica que utilizan cepas con alta tolerancia a ste metabolito, suelen trabajar con concen-
traciones de hasta 18 % v/v y se ha registrado hasta 21% v/v en determinadas condiciones.

Sustancias y metabolitos txicos

Algunos metabolitos producidos por las levaduras y otros microorganismos (contaminantes, por
ejemplo) durante la fermentacin alcohlica son txicos. El CO2 y etanol, como se mencion
anteriormente, acetaldehdo y cidos orgnicos, pueden afectar la fermentacin alcohlica.
Los cidos orgnicos de mayor importancia son el lctico y el actico. El primero es producido
por bacterias contaminantes, mientras que el segundo tanto por bacterias como por la propia
levadura. El cido lctico es inhibitorio cuando est presente en concentraciones que superan
0,8 % p/v y el cido actico por encima de 0,05 % p/v.

Como algo particular de la industria tequilera, en el jugo de agave se encuentran altas

concentraciones de furfurales generados por las reacciones de Maillard ocurridas durante el
proceso de cocimiento. Estas sustancias ejercen un efecto inhibitorio sobre las levaduras. Safteq
blue se caracteriza por poseer una alta resistencia a estos compuestos. De ah surge uno de los
argumentos que explica su gran adaptacin a los medios utilizados para la produccin de tequila.

Factores biolgicos
Competencia con otros microorganismos

La proliferacin de otros microorganismos (contaminacin), ya sean levaduras o bacterias, suele

ser un factor de estrs importante, dado a que compiten por los mismos nutrientes y pueden, a
su vez, generar metabolitos txicos, como se describi anteriormente (bacterias productoras de
cido lctico y actico).

13

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 La presencia de levaduras salvajes en plantas tequileras suele ser comn. Las poblaciones que no
pertenecen al gnero Saccharomyces (llamadas no Saccharomyces) pueden, en algunos casos,
llegar a nmeros importantes durante la primera fase de la fermentacin. Estas levaduras son
luego suplantadas por las del gnero Saccharomyces, ms resistente al alcohol. Esta sucesin
de microorganismos puede ser positiva desde el punto de vista sensorial de la bebida, cuando
ocurre en forma correcta. Sin embargo, es difcil lograr consistencia y repetitividad. En muchos
casos, las fermentaciones se desvan hacia lugares no deseados, lo que puede causar estrs por
la produccin de metabolitos txicos y muy probablemente deficiencias sensoriales.

Otros factores biolgicos

El envejecimiento celular y cambios a nivel gentico tambin son factores de estrs. Las
levaduras tienen un nmero limitado de divisiones celulares y su vitalidad decrece en funcin
del envejecimiento. Por otro lado, los cambios a nivel genoma producidos por mutaciones suelen
generar alteraciones en las poblaciones. Normalmente, estos problemas ocurren luego de varias
generaciones y afectan, principalmente, las industrias que reciclan levadura, como la cervecera.
Las alteraciones a nivel gentico se establecen en las poblaciones, ocasionando anomalas en el
proceso fermentativo.

Los cambios a nivel gentico tambin ocurren en cepas almacenadas en el laboratorio y luego
pueden trasladarse a las fermentaciones industriales. Para evitar inconvenientes, los cambios
deben ser monitoreados frecuentemente a nivel molecular. Una de las ventajas de la LAS
producida por Fermentis es que su integridad y pureza est custodiada en nuestros laboratorios,
equipados para aplicar tcnicas de biologa molecular que permiten analizar minuciosamente
el ADN y asegurar que las cepas propagadas en plantas industriales no tengan ningn tipo de
alteracin.

14

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 Manejo de levaduras
en la industria tequilera

Los sachets de levadura deben ser almacenados en un lugar fresco y seco luego de su recepcin. La
temperatura ideal de almacenaje es alrededor de 10C. Sin embargo, a temperaturas de 15 25C se puede
almacenar en planta por algunos meses.

Rehidratacin
Antes de poder dar inicio a la fermentacin, las levaduras secas deben recuperar el agua que
han perdido en el secado. Este proceso se denomina rehidratacin y es vital para que las clulas
adquieran nuevamente su funcionalidad biolgica.

Rehidrate la LAS hasta la formacin de una crema. Este proceso se debe realizar esparciendo la levadura en un
volumen de agua equivalente a 10 veces su propio peso. La mezcla debe homogeneizarse a travs de agitacin
manual o mecnica. El proceso debe durar no ms de 30 minutos (ver texto para ms informacin)

(a) (b)

Incorporacin de agua

Esparcir la levadura Mezclar con Crema Inocular

en un volumen suavidad hasta de levadura la crema
de agua homogenizar homognea resultante en
equivalente completamente el tanque
a 10 veces su peso (no ms de 30 minutos) de fermentacin

Figura 5. (a) Recuperacin de la turgencia luego del proceso de rehidratacin.

(b) Esquema simplificado del proceso de rehidratacin de levadura.

15

Guide Tquila.indd 15 26/07/12 17:19

 En la figura 5 (b) se muestra un esquema simplificado del proceso de rehidratacin, que se realiza
en un tanque acondicionado para tal propsito. Este tanque debe ser sometido a limpiezas
exhaustivas (se recomienda una limpieza CIP) y desinfeccin cada vez que es utilizado para evitar
contaminacin bacteriana o de otro tipo de levaduras. Cuando el proceso de rehidratacin es
llevado en forma adecuada, se logra una alta viabilidad celular y reducir la fase lag o de latencia,
perodo donde no se registra produccin de alcohol, ya que las levaduras se ambientan al nuevo
medio. Las variables ms importantes a controlar en la rehidratacin son: calidad microbiolgica
del agua, temperatura y agitacin (ver Protocolo de Rehidratacin para ms detalles).

Las levaduras son organismos vivos y la temperatura de rehidratacin es crtica para lograr un
buen desempeo fermentativo. Fermentis recomienda que las levaduras de fermentacin Saf-
teq sean rehidratadas entre 35 y 38 C.

Descartar los sachets que se encuentren blandos (es sntoma de prdida de vaco) o que se
encuentren vencidos.

Dejar aclimatar la levadura por lo menos 4 horas antes de su uso, a temperatura ambiente.

Limpiar y desinfectar el tanque y piping empleados para la rehidratacin de la levadura, ya sea

en forma manual o a travs de un proceso de limpieza CIP.

Agregar en el tanque de rehidratacin un volumen de agua (debe poseer calidad microbiol-

gica adecuada al proceso) que equivalga a 10 veces el peso de LAS a utilizar. La temperatura
del agua debe permanecer a 35 C - 38 C durante todo el proceso de rehidratacin. Cuando
las cantidades de levadura involucradas sean grandes, se recomienda emplear un tanque con
agitacin incorporada para facilitar la homogenizacin. Cuando las cantidades son menores,
la agitacin se puede realizar en forma manual.

Rociar los sachets con un spray conteniendo alcohol al 70% y cortarlos en uno de los extremos
con una tijera, tambin previamente rociada con la solucin desinfectante.

Agregar la levadura esparcindola lo ms homogneamente posible sobre la superficie del

agua, evitando la formacin de grumos.

Comenzar a mezclar suavemente con un utensilio previamente esterilizado o mediante

agitacin mecnica. Agitar durante 10 minutos a baja velocidad.

Dejar 15 minutos de reposo, con agitaciones intermitentes a mayor velocidad.

Luego del perodo de reposo, agitar a mayor velocidad otros 5 minutos hasta formar una crema
bien homognea (nunca llegar a una agitacin muy vigorosa).

Agregar la levadura en forma de crema al fermentador o al propagador (el mosto debe estar a
32C).
Notas importantes:
Mantener siempre la temperatura de hidratacin en los rangos mencionados arriba.
Agregar siempre la levadura sobre el agua y no lo opuesto.
Agitacin adicional puede ser requerida durante la rehidratacin para romper la espuma o grumos de levadura.

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 La inoculacin de la levadura
Una vez finalizado el proceso de rehidratacin, las levaduras pueden ser utilizadas de dos formas
diferentes:

Inoculadas en forma directa

Propagada para amplificar la biomasa en una etapa anterior a la fermentacin

inoculacin directa Hidratacin

20 kg
200 l

~ 30 min 8 X 106
cel/ml
propagacin Volumen de
propagacin: 5 m3
Volumen de
2,5 kg fermentacin
25 l 50 m3

30 min ~ 10 horas
10 X 106 80 X 106
cel/ml cel/ml

Figura 6. La curva de nmero de clulas en propagacin vs el tiempo se muestra en la parte

inferior del grfico. Se asume que la fase exponencial comienza a las 2,5 horas y que el tiempo
generacional en esa etapa es de 2,65 horas.
Inoculacin en forma directa

Es la forma ms sencilla de trabajar. Gracias a que el nmero de clulas por gramo de LAS es
un valor conocido, es posible ajustar la concentracin inicial en funcin de un simple pesaje
(Ver tabla 1). Normalmente, la concentracin de levaduras inoculada en fermentacin est en
el rango de 0,25 0,5 g/l de mosto. Por lo tanto, slo se requiere pasar por una fase previa de
rehidratacin.
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Tabla 1. Nmero de clulas por gramo de LAS, tasas de inoculacin recomendadas y nmero de
clulas finales que se alcanza en el mosto inoculado, para las cepas Safteq silver y blue.

En la figura 6 se muestra un esquema clsico de inoculacin directa (lnea roja). Para un fermen-
tador de 50 m3, asumiendo una tasa de inoculacin de 0,4 g/l, se requiere rehidratar 20 kg de
LAS. Si el producto empleado es Safteq blue, el nmero de clulas iniciales alcanzado es de 8 x
106 clulas/ml.
Propagacin

En este caso, la levadura no es utilizada en forma directa, sino que es previamente propagada
para alcanzar la biomasa requerida, mientras se mantiene un estricto control de las condiciones
nutricionales y ambientales. Esta alternativa tiene como beneficio un menor consumo de
levadura. Sin embargo, la propagacin requiere equipamiento complementario (tanques de
propagacin), personal dedicado al proceso y supone mayor riesgo de contaminacin.

La propagacin se realiza en tanques con un volumen de 10 a 20 veces inferior que los fermen-
tadores. La tasa de inoculacin es exactamente la misma que en el mtodo directo. Siempre se
realiza con inyeccin de oxgeno, ya que se favorece la produccin de biomasa.

En la figura 6 tambin se muestra un ejemplo de propagacin (lnea azul). Partiendo de 2,5 kg

de levadura rehidratada, se inicia la propagacin en un tanque de 5 m3. Si el producto utilizado
es Safteq blue, el nmero mnimo de clulas vivas al inicio alcanza 10 x 106 por ml de mosto, que
equivale a 0,5 g/l de LAS. Asumiendo que la propagacin entra en fase exponencial a 2,5 horas de
la inoculacin y un tiempo generacional en la misma fase de 2,65 horas, la biomasa puede llegar
aproximadamente a 80 x 106 clulas/ml al cabo de 10 horas, tiempo en el que se transfiere en su
totalidad al fermentador. Teniendo en cuenta que le fermentador es de 50 m3, el nmero de clulas
iniciales alcanzado en fermentacin es de aproximadamente 8 x 106 clulas/ml.

Cuando se realiza la propagacin, es muy importante transferir la biomasa al fermentador an

en fase exponencial de crecimiento.

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 Las condiciones ptimas de propagacin se describen a continuacin:

Fermentacin
El objetivo de la fermentacin alcohlica es convertir la mayor cantidad de carbohidratos
disponibles en alcohol de la forma ms eficiente y rpida posible, manteniendo la calidad
sensorial de la bebida.

Para lograr una fermentacin consistente es necesario poder controlar las siguientes variables
y procesos:
Limpieza y desinfeccin

Se recomienda seguir procesos de limpieza CIP (del ingls: cleaning in place) para mantener
una higiene correcta y evitar infecciones bacterianas. Para poder tener un proceso eficiente, se
debe tener en cuenta el diseo del piping y tanques, de forma tal que todos los circuitos puedan
limpiarse sin tener que parar la planta y evitar, a la vez, zonas muertas donde potencialmente
puedan acumularse microorganismos. La superficie de los tanques debe ser lisa y de materiales
de fcil limpieza (idealmente el acero inoxidable).
Temperatura

La temperatura de fermentacin recomendada para las cepas de la lnea Safteq es de 32 C. Sin

embargo, tanto Safteq silver como Safteq blue pueden trabajar a temperaturas menores (de
hasta 20 C, aproximadamente), aunque con una actividad metablica menor, lo que incrementa
el tiempo de fermentacin. Tambin se genera mayor consumo energtico, debido a que las cubas
de fermentacin deben ser mantenidas a temperaturas menores. Por lo tanto, en plantas donde
existe capacidad ociosa de fermentacin y de enfriamiento suficiente, se puede utilizar como
opcin la fermentacin a bajas temperaturas. Los beneficios estn relacionados con el cambio
en la calidad y cantidad de compuestos voltiles, que genera perfiles sensoriales diferenciales y
una mejor retencin de aromas.

Safteq blue es una cepa termotolerante y, por lo tanto, soporta mucho mejor temperaturas entre
35 y 40 C que las cepas clsicas. Esta cepa es altamente recomendable en plantas que operan por
encima de los 35 C o que tienen dificultades para controlar la temperatura durante la fermentacin.

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 pH

Se recomienda trabajar con un pH entre 4,0 y 5,5

Timing de inoculacin

Lo ideal es adicionar el inculo de levadura una vez que se ha completado con mosto el 10%
del volumen de fermentacin. De esta forma, las levaduras pueden empezar a trabajar ms
rpidamente, disminuyendo tiempos de fermentacin y, por otro lado, se evita que la flora nativa
pueda proliferar.
Control de azcares

En los medios tequileros se encuentra mayoritariamente la fructosa, ya que es el monosacrido

predominante en fructanos. En los jugos de agave puro hay cantidades menores de glucosa,
que generalmente no sobrepasan el 10% del total de los azcares y que tambin provienen
mayoritariamente de la hidrlisis de fructanos. En los mostos destinados a la produccin de
tequila, existe la adicin de otros azcares, como pueden ser jarabes especficos, melazas de
caa, sacarosa, etc. En estos casos, tambin es posible encontrar sacarosa y mayor proporcin
de glucosa.

La forma ms sencilla de monitorear el progreso de la fermentacin alcohlica es a travs de

la medicin del grado Brix. Si bien es posible hacer un seguimiento preciso con esta tcnica,
es siempre importante realizar chequeos ms especficos, que brinden ms informacin, sobre
todo al final de la fermentacin. Para poder determinar con exactitud la cantidad de azcares
residuales, la tcnica de Fehling es utilizada por la industria tequilera. En general se determinan
azcares reductores totales (con un paso previo de hidrlisis cida) y directos (sin hidrlisis). Sin
embargo, el alcance de esta tcnica es limitado y muchas veces no brinda informacin correcta.
Una alternativa es la utilizacin de la cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC). La figura
7 muestra un perfil clsico de una corrida de HPLC, utilizado por la industria de la fermentacin
alcohlica para monitorear los procesos. Se pueden detectar los azcares y otros metabolitos
como alcohol, glicerol y cidos orgnicos en una simple corrida.

Figura 7. Cromatograma tpico obtenido por HPLC. Una simple corrida puede utilizarse para
medir varios metabolitos.

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 Medicin de alcohol (etanol)

Tambin es un parmetro que suele medirse al final de la fermentacin. Existen varios mtodos
como el del dicromato de potasio, enzimtico, hidrometra, densitometra y picnometra, todos
ellos utilizados por la industria. Sin embargo, el etanol puede tambin ser determinado por HPLC
de forma ms precisa, en la misma corrida que la utilizada para medir azcares (ver figura 7).

Control del glicerol

El glicerol es un metabolito de importancia, ya que gran cantidad de azcar es desaviado para su

produccin. Las levaduras lo utilizan para restablecer el equilibrio redox de las clulas. Tambin,
su produccin se incrementa notoriamente en condiciones de estrs. Sin embargo, rramente
es medido y tomado en consideracin para controlar la fermentacin. La forma ms eficiente de
medirlo es tambin a travs de HPLC. Tambin puede ser detectado en la misma corrida utilizada
para determinar azcares (ver figura 7).

Control de produccin de cidos orgnicos

Los cidos orgnicos ms importantes son el lctico y el actico. Bsicamente, su determinacin

es una medida indirecta de la contaminacin bacteriana. Ante infecciones severas, los niveles de
estos cidos orgnicos, en forma individual o conjunta, se disparan y ocasionan prdidas econ-
micas importantes debido al desvo de azcares.

La tabla 2 muestra la prdida de rendimiento (produccin de etanol) en funcin de la magnitud

de la infeccin. En general, los cidos orgnicos no son tenidos en cuenta como parmetros
de control por las plantas tequileres. La forma ms eficiente de medirlos es a travs de HPLC.
Tambin pueden ser detectados en la misma corrida utilizada para determinar azcares.

Tabla 2. Prdidas de rendimiento ocasionadas por la infeccin de bacterias lcticas en fermen-

taciones industriales

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 Control de biomasa

Se refiere a la concentracin de levaduras. En este caso, si bien hay mtodos muy sofisticados
como la citometra de flujo, puede ser fcilmente estimada a travs de microscopa.

La viabilidad celular (% de clulas vivas), tambin puede ser determinada por microscopa a
travs de la utilizacin de algunas sustancias colorantes, como el azul de metileno.

Rendimiento, eficiencia y balance de masas

A travs de la medicin de los principales metabolitos de la fermentacin, conociendo la concen-

tracin de azcares al inicio y al final del proceso, as como la produccin de biomasa, es posible
realizar un balance de masas y determinar cmo fueron utilizados los azcares durante el proceso
fermentativo. Por otro lado, es posible obtener la eficiencia (% de alcohol obtenido respecto
al mximo valor terico) y rendimientos de fermentacin (cantidad de alcohol producido por
gramo de azcar).

Tabla 3. Valores de azcares iniciales, etanol al final de la fermentacin, rendimiento de alcohol

y eficiencia registrados por 5 cepas evaluadas en la produccin de tequilas

* El mximo terico de alcohol se obtiene multiplicando la concentracin inicial de azcar por el factor estequio-
mtrcio de conversin del azcar a etanol: 0,511

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 Influencia de las levaduras en la pro
pro--
duccin de los principales compuestos
voltiles y otras sustancias relevantes
Los compuestos aromticos pueden ser pre-fermentativos o fermentativos. Los primeros
provienen de la materia prima y son de naturaleza variada: steres, aldehdos, cidos, alcoholes,
terpenos, cidos grasos y compuestos ms especficos como la vainillina. Tambin son pre-
fermentativos los furfurales, producidos durante el cocimiento de las cabezas del agave. Se han
descripto gran variedad de estos compuestos producidos a travs de las reacciones de Maillard,
que ocurren a altas temperaturas durante el cocimiento de la materia prima. Los furfurales
impactan notoriamente el perfil sensorial de los tequilas y constituyen una caracterstica
fundamental de la bebida. El nivel de estos compuestos est regulado por la norma mexicana
NOM-006-SCFI-2005, no pudiendo exceder los 4 mg en 100 ml de alcohol anhidro.

Las levaduras tambin influyen en forma notoria en el perfil sensorial del tequila a travs de
la produccin de compuestos voltiles. Estos son los denominados aromas fermentativos y son
consecuencia del metabolismo de las levaduras. Los distintos grupos se describen brevemente
a continuacin:
Acetaldehdo

Tambin llamado etanal, es un intermediario de la fermentacin alcohlica. Es el aldehdo

ms importante, caracterizado por producir aromas frutales en bajas concentraciones, que se
transforman en picantes o pungentes cuando est en exceso. Los niveles generados dependen
mucho de la cepa de levadura involucrada. El acetaldehdo est regulado en el tequila a travs
de la norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 y los niveles no pueden exceder 40 mg cada 100 ml
de alcohol anhidro.
Alcoholes superiores

Tambin son llamados alcoholes fusel. Son aquellos que contienen dos o ms tomos de carbono
en su estructura, con puntos de ebullicin ms elevados que el etanol. Estos compuestos aportan
aromas intensos en todas las bebidas alcohlicas.

A bajas concentraciones suelen aportar complejidad en tequilas. En altas concentraciones

su impacto suele ser negativo. La norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 regula los niveles del
n-propanol, isobutanol, n-butanol, alcohol amlico e isoamlico, que en su conjunto no pueden
exceder 500 mg en 100 ml de alcohol anhidro.

La generacin de alcoholes superiores es muy dependiente de la cepa de levadura y est asociada

a la fase de crecimiento. Tambin, su produccin se incrementa a altas temperaturas y est
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 asociada a condiciones de estrs. Estos compuestos son sintetizados a travs de la reaccin
de Ehrlich, a partir de aminocidos de cadena ramificada como valina, leucina e isoleucina;
aminocidos aromticos como el triptfano, fenilalanina y tirosina; y el aminocido azufrado
metionina. Por tal motivo, la utilizacin de nutrientes que tienen aminocidos en su formulacin
puede estimular la produccin de estos compuestos. Sin embargo, los alcoholes superiores
tambin pueden sintetizarse a travs del metabolismo de los carbohidratos (sntesis de novo).

Los alcoholes superiores son tambin precursores de otros compuestos voltiles muy importantes,
como son los steres.

steres

Los steres son compuestos voltiles con un alto impacto sensorial en tequilas y otras bebidas
alcohlicas. Existen dos grandes grupos: los steres de acetato y los steres etlicos.

Esteres de acetato: Son producidos por la unin de alcoholes superiores y el acetyl-CoA, que es
un intermediario metablico. Los ms importantes son el acetato de etilo (el ms abundante en
tequilas), acetato de isoamilo, acetato de isobutilo, acetato de feniletilo, acetato de hexilo y
acetato de bencilo.

Esteres etlicos: son producidos por la unin de etanol y acyl-CoA. Entre los ms importantes
estn el propanoato de etilo, butanoato de etilo, hexanoato de etilo, octanoato de etilo,
decanoato de etilo y lactato de etilo.

La norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 regula la presencia de steres en tequilas. La norma

establece la medicin del acetato de etilo y lactato de etilo (los dos steres mayoritarios), que
no pueden exceder en su conjunto los 200 mg cada 100 ml de alcohol anhidro. Si bien la norma
regula la produccin de steres a travs de los dos compuestos mayoritarios, la mayora de ellos
tiene un umbral de deteccin muy bajo y pueden, potencialmente, influir en el perfil sensorial
a muy bajas concentraciones. Considerando que la mayora de los steres generan aromas
positivos y que estos dependen en gran parte, en forma cualitativa y cuantitativa, de la cepa
involucrada, es probablemente uno de los campos ms importantes a desarrollar en el futuro, a
travs de la incorporacin de nuevas levaduras para la industria.
Metanol

El metanol se forma a partir de las pectinas presentes en el agave, por intermedio de una reaccin
de demetilacin. Se ha establecido que en algunos casos las concentraciones de metanol pueden
variar en mostos de agave fermentados (Daz Montao, 2008). Se estima que algunas cepas
de levadura podran influenciar en su produccin a travs de la presencia de metil esterasas
especficas de pectinas.

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 Nutricin

Los azcares son los principales nutrientes en mostos tequileros, ya que proporcionan la
fuente de carbono, que es el elemento mayoritario en la biomasa de levadura, representando,
aproximadamente, un 47% de la materia seca. En fermentaciones industriales para producir
bebidas alcohlicas, siempre se parte de un mosto con altas concentraciones de azcares. Salvo
algunas excepciones, el objetivo es fermentar la totalidad de los azcares. Por lo tanto, el resto
de los nutrientes se ajustan en funcin de este objetivo.

A continuacin se mencionan algunos nutrientes fundamentales para llevar adelante un proceso

fermentativo eficiente.
Nitrgeno

El nitrgeno representa aproximadamente el 8% de la biomasa de levadura, siendo constituyente

esencial de protenas y cidos nucleicos, as como de otras sustancias. Muchos mostos sometidos
a la fermentacin alcohlica son, a priori, ricos en nitrgeno, sin que esto signifique que
sea asimilable por las levaduras. Por lo tanto, se requieren ajustar las concentraciones para
que el mismo no se encuentre en forma limitante, hecho que llevara a paralizaciones de la
fermentacin.

El YAN (del ings: yeast assimilable nitrogen) se define como el nitrgeno asimilable por
la levadura y est compuesto por la suma de los iones amonio y alfa amino cidos (menos la
prolina, porque no es asimilable en anaerobiosis). Para saber el valor del YAN se determina el
FAN (del ings: free amino nitrogen), que corresponde al nitrgeno de los grupos alfa amino de
los aminocidos y luego se suma la concentracin de iones amonio.

Las levaduras transportan iones amonio y aminocidos del mosto dentro de la clula. Los
iones amonio son muy fcilmente asimilables y son preferidos por las levaduras. Por lo tanto,
constituyen la fuente principal de nitrgeno en fermentaciones alcohlicas. Los aminocidos,
cuando incorporados por la clula en la primera parte de la fermentacin, son almacenados y
se utilizan en etapas posteriores para la sntesis proteica, cuando hay escasez de iones amonio.
Este mecanismo tambin asegura la provisin de una fuente de nitrgeno en etapas tardas de
la fermentacin, cuando los sistemas de transporte se encuentran inhibidos y la disponibilidad
energtica de las clulas es escasa (la sntesis de protenas requiere menos energa cuando la
fuente de nitrgeno la constituyen los mismos aminocidos).

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 El nitrgeno es suplementado normalmente en forma de sales de amonio (como sulfato o
fosfato) y urea. El caso de la urea es bastante particular, ya que su uso incrementa los niveles de
carbamato de etilo, un potencial carcingeno, y est generalmente prohibido para la produccin
de bebidas alcohlicas. Los aminocidos tambin se adicionan como fuente de nitrgeno, cuando
se utilizan extractos de levadura como nutrientes.

Ante un exceso de iones amonio, la levadura prefiere estos como fuente de nitrgeno casi
en forma exclusiva. Sin embargo, el exceso de iones amonio genera aumento de la biomasa,
que incrementa a su vez la demanda de nitrgeno. Los aminocidos son asimilados tambin
en la primera fase de la fermentacin. Pero ante la presencia de alcohol, su incorporacin es
rpidamente inhibida. Por lo tanto, siempre es recomendable agregarlos antes de promediar
la mitad de la fermentacin. Se estima que los iones amonio pueden ser asimilados por ms
tiempo, pero igualmente siempre se recomienda agregarlos no ms all de la primera mitad de la
fermentacin, ya que su transporte al interior de la clula tambin es afectado por la produccin
de etanol.

Se asume que una fermentacin alcohlica de un mosto de agave debe transcurrir con un mnimo
de 150 ppm de nitrgeno. Considerando que el fosfato diamnico (DAP; del ingls diammonium
phosphate) y el sulfato de amonio proporcionan aproximadamente el 21 % de su peso como
nitrgeno, una adicin de 0.3 g/l de cualquiera de estas sales, aporta 63 ppm de este elemento.
No obstante, para lograr buena seguridad fermentativa, se sugiere trabajar con un mnimo de
150 - 200 ppm de nitrgeno. Es importante determinada aclarar que la demanda de nitrgeno
est tambin determinada por la cepa de levadura. Algunas cepas requieren ms nitrgeno que
otras.

En la figura 8 se comparan dos fermentaciones industriales de un mismo mosto de agave, una

sin adicin de nitrgeno y otra suplementado con 150 ppm. Claramente, la adicin de nitrgeno
activa la fermentacin y logra finalizar antes. La curva correspondiente al fermentador sin
suplemento de nitrgeno muestra un perfil tpico de limitacin de nutrientes, con un descenso
del brix casi lineal durante toda la fermentacin.

Figura 8. Fermentaciones industriales de mostos de agave, suplementadas com 150 ppm de

nitrgeno y sin adicin.
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 En otras industrias, como la enolgica, es comn seguir ciertas prcticas para la adicin de
nitrgeno, completamente aplicables a la industria tequilera. Tales prcticas se resumen a
continuacin:

1. Siempre es recomendable adicionar el nitrgeno faltante y no un exceso. Pero para poder

lograrlo hace falta medir el YAN de un mosto. Como esto no es siempre posible, se recomienda
agregar como mnimo 150 ppm de nitrgeno (esto asegurara un mnimo de 200 ppm,
considerando lo que trae la materia prima) y ajustar en funcin de los resultados.

2. Se recomienda adicionar las sales de amonio luego de transcurrido un perodo de la

fermentacin (transcurridos de la fermentacin, por ejemplo). De esta forma se favorece la
incorporacin de aminocidos del mosto en la fase inicial.

3. Cuando se requiera agregar ms de 30 g/hl de nitrgeno en forma de sales de amonio, se

recomienda realizar adiciones parciales para evitar un crecimiento desmedido de la biomasa.
Tpicamente, se adiciona antes de transcurrido el de la fermentacin y antes de pasar la de
la fermentacin.

4. Se recomienda no realizar adiciones de DAP o sulfato de amonio en la ltima parte de la

fermentacin, ya que, como se mencion anteriormente, el alcohol inhibe su incorporacin.

5. Se recomienda agregar los nutrientes que contienen aminocidos no ms all de transcurrido

el de la fermentacin. Esto se debe a la rpida inhibicin de su asimilacin en presencia de
alcohol.
Vitaminas y factores de crecimiento

Las vitaminas son cofactores de reacciones enzimticas y pueden ser utilizadas varias veces. Las
vitaminas ms importantes en la fermentacin alcohlica son la biotina, tiamina y pantotenato.
Parte de las vitaminas se pueden obtener del medio, mientras que las levaduras pueden
sintetizar otras. Muchos nutrientes complejos tienen agregado de estas vitaminas. Por otro lado,
las levaduras autolisadas o extractos de levadura, no slo aportan aminocidos, sino que son
tambin fuente de vitaminas, pudiendo aportar las necesidades.
Fsforo

El fsforo es componente estructural de molculas importantes, como cidos nucleicos, y varios

metabolitos, incluso el ATP, la moneda energtica de las clulas. Representa aproximadamente el
1,2% de la materia seca de levadura y debe estar presente en los mostos en valores que soporten
el crecimiento de la biomasa.

El DAP contiene 23% de fsforo y es la fuente de este elemento ms comnmente utilizada en

fermentaciones alcohlicas. Por lo tanto, si se agrega DAP para llegar a 150 ppm de nitrgeno
(como se ha planteado anteriormente), se est adicionando a la vez, 164 ppm de fsforo. Esta
cantidad soportara un crecimiento de hasta 13 g/l de biomasa seca de levadura, lo que constituye
un exceso importante, ya que se estima que sta llega a un lmite en torno a los 6 g/l. Esto es sin
tener en cuenta la cantidad de fsforo que ingresa en la materia prima. Por lo tanto, raramente este
elemento se encuentra en deficiencia mientras se utilice DAP como fuente de nitrgeno.

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 Minerales

Tambin son cofactores de reacciones enzimticas, siendo, por lo tanto, importantes en toda
fermentacin alcohlica. Muchos nutrientes complejos poseen sales de magnesio, potasio,
manganeso y zinc, que son los minerales de mayor importancia. Las levaduras autolisadas y
extractos de levadura tambin aportan estos elementos.
Factores de supervivencia

Corresponden a los esteroles (ergosterol) y cidos grasos de cadena larga, que son constituyentes
esenciales de las membranas celulares. La escasez de estas sustancias puede afectar notoriamente
la resistencia al alcohol en la fermentacin y ocasionar paralizaciones.

La produccin de estos factores de supervivencia es dependiente del oxgeno. Por lo tanto, en

mostos oxigenados al inicio de la fermentacin, no suele haber escasez de estos compuestos.

La LAS cuando es inoculada en forma directa, no requiere oxigenacin, ya que es rica en

ergosterol y cidos grasos insaturados. Esto se debe a que en las plantas industriales es crecida
en forma aerbica. Por otro lado, cuando son propagadas en presencia de oxgeno, las levaduras
tampoco requieren adicin de oxgeno en fermentacin.

Una forma de compensar la falta de factores de supervivencia, es adicionando preparaciones a

base de paredes celulares de levaduras. Las levaduras autolisadas, tambin contienen paredes
celulares que sirven a este propsito.

Adicin de derivados de levaduras como activadores de fermentacin

Existen varios productos derivados de levaduras que sirven como activadores de fermentacin.
Los productos ms completos son las levaduras autolisadas, que, como fue mencionado arriba,
son ricos en aminocidos, factores de supervivencia, minerales y vitaminas. Este tipo de activa-
dores, normalmente se usa en forma complementaria a una fuente de amonio, generalmente en
dosis de 0,3 g/l. El contenido de nitrgeno que aporta al medio nunca ser comparable con el de
las sales de amonio. Sin embargo, el tipo de nitrgeno (amino nitrgeno) y dems nutrientes,
es muy importante en fermentaciones alcohlicas. La figura 9 muestra la composicin tpica del
Bioferm, una levadura autolisada comercializada por Fermentis.

El aporte de aminocidos, por otro lado, genera una mejora en la calidad sensorial, ya sea por
un aumento en la concentracin de compuestos voltiles en forma directa (reaccin de Ehrlich)
o indirecta (mejora de la sntesis proteica).

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 Figura 9. Composicin del Bioferm, una levadura autolisada comercializada por Fermentis.

Existen tambin formulaciones especficas de nutrientes que contienen nitrgeno mineral (sales
de amonio), nitrgeno orgnico (levaduras autolisadas) y mezclas de vitaminas y factores de
supervivencia. Fermentis comercializa el Bioferm Equilibre, una mezcla balanceada que
contiene todos los nutrientes necesarios para la fermentacin alcohlica.

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 Tecnologa VHG

Gracias a la seleccin de nuevas cepas capaces de tolerar altas concentraciones de alcohol y

presin osmtica, muchas industrias estn volcndose cada vez ms a la tecnologa VHG (del
ingls: Very High Gravity). Bsicamente, esta tecnologa consiste en fermentar mostos con
altas concentraciones iniciales de azcar. Un ejemplo muy importante ocurre en la industria del
etanol a partir de maz, que ha llegado, en algunos casos, hasta 21% de alcohol v/v, cuando hace
10 aos esos valores eran aproximadamente del 12% v/v, como mximo.

Si bien cuando se trata de mostos de agave existe un limitante proveniente de la materia prima,
ya que el proceso de extraccin limita la concentracin de azcares que pueden obtenerse en
el jugo de agave, la disponibilidad de cepas de levadura osmotolerantes, como Safteq blue,
permite, potencialmente, incrementar los valores de alcohol en fermentacin. Los beneficios de
trabajar en estas condiciones se enumeran a continuacin:

Aumento de la productividad. Debido a que se trabaja con mostos ms concentrados,

es posible incrementar la cantidad de materia prima procesada.
Disminucin del consumo de agua: Al obtenerse mostos ms concentrados,
disminuye el consumo de agua.
Disminucin del gasto energtico: Esto ocurre debido a que se destilan vinos ms
ricos en alcohol.
Reduccin del volumen de efluentes.

En general, las condiciones de VHG pueden ser alcanzados con sistemas sofisticados de extraccin
de azcares y, sobre todo, cuando se suplementan los jugos de agave con otras fuentes de azcar.

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 Caracterizacin
de Safteq silver y Safteq blue

Aparte de las diferencias entre Safteq silver y Safteq blue mencionadas anteriormente en el
texto, que bsicamente se centran en la osmotolerancia, tolerancia al etanol y a las altas
temperaturas, ambas cepas fueron caracterizadas en estudios tanto a nivel industrial como a
nivel planta piloto.

Safteq blue suele fermentar con mayor rapidez debido a su alta vigorosidad en medios de agave.
La figura 10 (a) corresponde a cinticas de fermentacin de mostos 100% agave de 18Brix,
donde claramente se observa que Safteq blue finaliza casi 20 horas antes que Safteq silver.

Por otro lado, en la figura 10 (b) se muestra una clara diferencia en la produccin de biomasa.
Mientras que Safteq blue se desarrolla rpidamente y llega a ms de 5 g de biomasa (materia
seca) por litro de mosto al final de la fermentacin, Safteq blue crece ms lentamente y apenas
sobrepasa los 3 g/l. La mayor velocidad de fermentacin de Safteq blue puede explicarse, en
parte, a la gran produccin de biomasa inicial.
Los niveles de glicerol tambin se diferencian, como muestra la figura 10 (c). Safteq blue
produce niveles significativamente mayores, seal de que probablemente sufra ms estrs en el
medio. Esta figura tambin muestra que el rendimiento de ambas cepas es similar.

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 Figura 10.

A: Azcares totales (sumatoria de glucosa + fructosa).

B: produccin de biomasa, expresada como materia seca de levadura por gramo de mosto, en
fermentaciones conducidas con Safteq silver y Safteq blue.

C: Produccin de glicerol (g/l) y rendimiento alcohlico (gramos de etanol por gramo de azcar).

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 La tabla 4 muestra los niveles de compuestos regulados por la NOM-006-SCFI-2005 en destila-
dos. Ambas cepas, segn muestra la tabla, cumplen con la norma.

Por ltimo, el anlisis sensorial de destilados producidos con Safteq silver y Safteq blue arroj
que para la primera predominan el caramelo y aromas ctricos, mientras que en la segunda lo
hacen el agave cocido, sabor dulce y aromas a almendra.

Tabla 4. Compuestos de norma y cido actico (expresados en mg cada 100 ml de alcohol

anhidro) analizados en destilados provenientes de fermentaciones de mostos de agave 100%,
con Safteq silver y Safteq blue.

* Valores mximos establecidos por la NOM-006-SCFI-2005 expresados en mg cada 100 ml de alcohol anhidro.
** Compuesto no regulado por la NOM-006-SCFI-2005.

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