INTRODUCCIN

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en
condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son
esenciales en el Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin,
preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los
resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de
medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente
para preparar un medio slido, se parte de un medio lquido al que se le aade un agente
solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo

a la naturaleza de sus constituyentes en:

Medios naturales o complejos: constituidos por

sustancias complejas de origen animal o vegetal,

las que son usualmente complementadas por la

adicin de minerales y otras sustancias. En ellos

no se conocen todos los componentes, ni las cantidades

exactas presentes de cada uno de ellos.

Trabajo Prctico N 6

PREPARACIN DE

MEDIOS DE CULTIVO

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

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9. 2

Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin qumica

definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de

un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de microorganismos

de ese tipo. Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras

del crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se quieren

cultivar.

Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser

medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos espec-

ficos.

Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados

de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo

de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas

de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de

sus constituyentes bsicos, o por simple rehidratacin de productos asequibles

comercialmente

(medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de

los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con

ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores

que suministren productos de calidad.

Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica

adecuada.

Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.

Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin. Nunca

se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo

las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

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9. 3

fresco (entre 15 y 25), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca

se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.

Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos. Cuando los envases de estos

medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la

precaucin de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados

para prevenir la entrada de humedad. La absorcin de agua produce cambios de pH,

formacin de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser

descartados porque pueden haber sufrido cambios qumicos o estar contaminados.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse

a temperatura ambiente por un periodo mximo de 2 semanas protegido de la luz, o

por periodos mayores a 12 -15C. Sin embargo, almacenados bajo refrigeracin entre

2 y 8C se prolonga la vida til de los mismos, (nunca por debajo de 0C porque se

destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes

bien cerrados para evitar su deshidratacin y cuando se usa tapn de algodn, se

debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).

Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado

debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan

sus propiedades fisicoqumicas (apariencia, pH, etc.) y microbiolgicas (esterilidad

y promocin de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de

calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.

OBJETIVO

Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:

Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de

medios de cultivo deshidratados.

Indicar el mtodo de esterilizacin apropiado.

FUNDAMENTO

La preparacin adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes

y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos

en el laboratorio.

PROCEDIMIENTO

1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparacin del medio de cultivo asignado.

2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada

uno de los ingredientes.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

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9. 4

Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.

3. Disolver la porcin pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante.

Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.

CUESTIONARIO

Tripteina Soya Agar

Medio utilizado para propsitos generales,favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad de microorganismos
aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos.
El agregado de sangre, permite el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente
exigentes y la observacin de reacciones de hemlisis.
Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

Fundamento
La triptena y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en pptidos, aminocidos libres, bases pricas y pirimdicas,
minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta tambin carbohidratos que estimulan el crecimiento de muchos
microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Adicionado con 5-10 % sangre , se logra un medio enriquecido y adecuado para observar reacciones de hemlisis.
Cuando se prepara como agar chocolate, es til para el cultivo de Neisseria spp., Haemophilus influenzae y
microorganismos exigentes similares. Incubado en forma anaerobia, permite el crecimiento de Clostridium spp. y
anaerobios NO esporulados. Es un medio adecuado para cultivar y mantener cepas de Aeromonas, y aumentando el
porcentaje de cloruro de sodio, para mantener cepas de algunos Vibrios (excepto V. cholerae).

Frmula (en gramos por litro)

Triptena 15.0
Peptona de soya 5.0
Cloruro de sodio 5.0
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.2
MEDIO COMPONENTES PRINCIPALES CARACTERSTICAS USOS VISUALIZACIN DE LAS
COLONIAS Agar de MacConkey

COMPONENTE Inhibidores: cristal violeta y sales biliares. Lactosa como agente diferencial.
Rojo neutro como indicador.

CARACTERISTICA

Selectivo y diferencial

USOS:

Aislamiento de bacterias gram negativas (enterobacterias). El colorante cristal violeta inhiben

las gram positivas. Las sales biliares inhiben las gram positivas y algunas gram negativas (no las
enterobacterias).

VIUALIZACION DE COLONIA

Las enterobacterias fermentadoras de lactosa (E. coli, Enterobacter, Klebsiella) se ven

rosa/rojo/violeta. E. coli puede presentar um halo rosa alrededor de ls colonias, debido a la
precipitacin de las sales biliares a pH muy cido. Las no fermentadoras de lactosa (Salmonella,
Shigella,Providencia, Proteus) se ven transparentes.

MEDIOS SLIDOS Agar nutritivo

COMPONNT

Caldo nutritivo + Agar. Diferentes versiones con distintos componentes (peptona, triptona-
soja, infusin de cerebro y corazn, agar Brucella, agar Columbia, etc.)

CARACTERIS

No es diferencial

USIO

Medio rico para el cultivo de microorganismos en general, crecen una gran mayora, excepto
algunos muy exigentes
TECNICAS DE AISLAMIENTO, OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS

Introduccin

En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sinointegrados

en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estosmicroorganismos y de sus
propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajarcon especies aisladas, obteniendo
cultivos axnicos o puros.Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin
microbiana mixta, seutilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron
desarrolladas durante elsiglo XIX. (Wistreich; 1983)Para efectuar el estudio de los
microorganismos, se han diseado diversos mtodosque permiten cultivarlos bajo condiciones
artificiales, en los que es posible cultivarlosbajo condiciones experimentales y manejar un solo
tipo de microorganismo. (Madigan;2004)El aislamiento de un microorganismo para obtener un
cultivo puro se realizaprincipalmente en un medio slido.Se inicia por la separacin de una sola
clula apartir de una poblacin y requiere tambin que la colonia que surja de esta clula
semantenga separada de otras clulas o colonias (Vullo; 2000).El aislamiento de un cultivo
puro puede hacerse tambin en medios lquidos, siempreque el organismo predomine en el
material de partida. (Seeley; 1991)Es la separacin de un determinado microorganismo del
resto de microorganismosque le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra
sobre un medio decultivo slido adecuado dispuesta en una placa de Petri.

Objetivos Al finalizar esta prctica el alumno ser capaz de: Explicar el fundamento de
diferentes medios de cultivo y condiciones de incubacin para el aislamiento de
microorganismos con caractersticas especficas. Aplicar diferentes tcnicas para el
aislamiento de microorganismos. Comparar con cepas de referencia la eficiencia de las
tcnicas de siembra, medios de cultivo y condiciones de incubacin empleadas para el
aislamiento de microorganismos. Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados.
Aplicar una tcnica de conservacin de corto o mediano plazo a los cultivos puros obtenidos.

Fundamento

En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran diversos

microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es decir la
separacin de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra.
Existen diversos mtodos para conseguir esta separacin, la mayora de ellos basados en la
inmovilizacin de las clulas microbianas en la superficie de los medios de cultivo slidos. Al
depositar una clula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, sta quedar
inmovilizada en ese punto y en l se reproducir por absorcin de los nutrientes del medio. Las
nuevas clulas generadas permanecern igualmente inmviles y tras sucesivas generaciones
conformarn lo que denominamos una "colonia" que no es ms que un montn de clulas
derivadas de una sola clula madre inicial, es decir, un clon de la bacteria o levadura
depositada al sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y presenta diferentes
caractersticas segn el microorganismo que la genera. Esto nos permite distinguir las
diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra sembrada y separarlas
transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo medio de cultivo estril, a estos cultivos los
consideraremos "puros" por poseer un slo tipo de microorganismo. (El fundamento es vlido
teniendo en cuenta slo microorganismos cultivables)

Objetivos

Distinguir los conceptos de cultivo puro y cultivo mixto.

Aplicar tcnicas de aislamiento para la localizacin de microorganismos concretos en
muestras contaminadas o con flora mixta.
Aplicar las tcnicas del agotamiento y las estras escocesas como las ms habituales en
aislamiento de microorganismos cultivables.
Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos.

Realizacin prctica

Tcnicas de aislamiento. Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes en un

cultivo mixto en caldo ordinario, sobre agar nutritivo. Se siembran dos placas de agar nutritivo,
una mediante la tcnica del agotamiento de asa y otra mediante la de estrias escocesas.
Estas tcnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el medio de cultivo
de forma que, en los ltimos trazos de la siembra, haya tan pocas clulas que queden
suficientemente separadas unas de otras y puedan desarrollar colonias independientes.

Tcnica de aislamiento y recuento: el banco de diluciones. Se realizan una serie de

diluciones seriadas a partir del cultivo mixto Con esta tcnica conseguimos adems de aislar
colonias, obtener un recuento del nmero de bacterias que tenemos en el cultivo.

Invertir las placas de agar durante la inoculacin e incubacin

Una vez que se ha colocado la suspensin de bacterias en la placa, se debe dejar que
se evapore una parte antes de comenzar la incubacin durante toda la noche. Sin
embargo, quedar una cantidad moderada de humedad. Si la placa no es invertida
durante la incubacin, la bacteria no podr colonizar el agar apropiadamente, lo
que evitar que crezca y forme colonias adecuadamente, o estimular el crecimiento
de otros microorganismos. Cualquiera de estas dos consecuencias invalidarn el
experimento. Adems, la condensacin o humedad puede causar vetas, lo que har
que elegir y analizar colonias separadas sea mucho ms difcil. Una vez que la
bacteria ha formado colonias, la placa tambin debe ser almacenada hacia abajo
para mantener los niveles de humedad.