Tabla de Contenido

Introduccin . 2
Objetivo General . 3
Objetivos Particulares 3
Hiptesis ... 3
Justificacin ... 3
Metodologa Experimental ... 4
Resultados y Anlisis. 8
Conclusiones .. 15
Bibliografa .. 16

1
Introduccin

En todos los procesos vitales estn implicadas las enzimas, las cuales son
biomolculas especializadas en la catlisis de las reacciones qumicas que tienen
lugar en la clula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de
aumentar la velocidad de las reacciones qumicas mucho ms que cualquier
catalizador artificial conocido.
Las enzimas son utilizadas en diversas industrias como en la industria textil,
alimenticia, de detergentes, farmacutica, para el tratamiento de desechos etc. Sin
embargo, la demanda de enzimas en dichas industrias ha aumentado
considerablemente por lo que actualmente se han investigado diversos mtodos
para la obtencin de enzimas de manera rpida y con buenos rendimientos.
Por lo que la biotecnologa desarrolla cada vez ms mtodos de obtencin de
enzimas por medio de microorganismos para poder abastecer la demanda de las
enzimas en la industria.
Una de las enzimas con mayor demanda son las amilasas, estas se encuentran
ampliamente distribuidas en la naturaleza, son las enzimas responsables de la
degradacin del almidn, hidrolizan los enlaces glucosdicos -1-4. Estas se pueden
dividir en tres grupos:
- -Amilasas: Las cuales rompen al azar los enlaces en el interior del sustrato
(endoamiladas), produciendo maltosa y pequeos oligosacridos.
- - Amilasas: Las cuales hidrolizan ordenadamente unidades de maltosa a partir de
los extremos no reductores del sustrato (exoamilsas)
- Glucoamilasas: Estas liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no
reductores del sustrato.
Como se ha mencionado se pueden obtener diversas enzimas a partir de
microorganismos, en el caso de la enzima -Amilasa se puede obtener de Bacillus
subtilis, esta es una bacteria Gram positiva, Catalasa positiva, aerobio facultativo,
comnmente se encuentra en el suelo. Es miembro del gnero Bacillus.

2
Objetivo General

Obtener -amilasa por cintica del crecimiento del microorganismo Bacillus subtilis,
por medio de una fermentacin utilizando como sustrato cscara de papa.

Objetivos Particulares

-Identificar el microorganismo Bacillus subtilis, por medio de pruebas bioqumicas

primarias: tincin de Gram, oxidasa, motilidad, catalasa y oxidacin/ fermentacin
(OF).
- Hacer el recuento del microorganismo por el mtodo de dilucin en placas.
- Demostrar el aprovechamiento de la cscara de papa como sustrato en la
formacin de amilasa.

Hiptesis

Si se somete a Bacillus subtilis a condiciones apropiadas de fermentacin (37C

durante 48 horas) y con un sustrato degradable para este microorganismo (como es
el almidn que se encuentra en la cscara de papa) se obtendr la enzima -
amilasa, la cual tendr la utilidad de hidrolizar almidn en azcares simples.

Justificacin

La enzima -amilasa es una de las enzimas ms utilizadas a nivel industrial

especialmente en la alimentaria, como en cervecera, dulcera, cereales y panadera
especficamente en la sacarificacin maltognica. Sin embargo, su produccin es
muy limitada, por lo que se han hecho diversas investigaciones para mejorar su
produccin. Anteriormente la produccin de enzimas era por sntesis qumica, pero
en los ltimos aos esto ha sido reemplazado por la produccin a base de
microorganismos.

Las enzimas de origen microbiano presentan ventajas tcnico-econmicas ya que

poseen tiempos de generacin menores, tienen requerimientos de espacio menor
por unidad de enzima producida y una potencialidad ilimitada en cuanto a la
disponibilidad de nuevas enzimas. Otro factor a considerar es que se pueden
utilizar diversos sustratos, los cuales son considerados como desechos.

3
Metodologa Experimental

Lista de materiales
Material de vidrio Equipo Otros materiales Reactivos

2 matraz Erlenmeyer Incubadora Asas bacteriolgicas Dextrosa anhidra

500 mL

4 vasos de precipitados Centrifugadora Papel filtro cido sulfrico concentrado

100 mL

4 vasos de precipitados Microscopio elctrico Piseta con agua Fenol al 5%

50 mL destilada

20 tubos de ensaye Incubadora rotacional Portaobjetos Cloruro de calcio

5 pipetas de 1 mL Incubadora Cubreobjetos sulfato de amonio

5 pipetas volumtricas Balanza granataria Tiras de pH Sulfato de hierro.

de 5 mL

Agitador de vidrio Espectrmetro Gradilla

2 matraz aforado 100

mL

1 matraz aforado 25
mL

1 vidrio de reloj

14 Cajas Petri

1 embudo de vidrio

4
Purificacin de la bacteria Bacillus subtilis

1. Se tom una asada de la cepa proporcionada de B. subtilis y se sembr en una

placa de BHI por el mtodo de dilucin americana.
2. Se dej incubar por 24 horas a 37 C.

Pruebas Bioqumicas primarias

1. Se realizaron las pruebas bioqumicas primarias con la bacteria B. subtilis aislada

anteriormente:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Oxidasa
- Motilidad
- Oxidacin-Fermentacin (OF)

Preparacin del medio de cultivo

1. Se pes 300 g de cscara de papa ya lavada y escurrida

2. Se licu la cscara de papa con un poco de agua y se filtr.
3. El filtrado obtenido se llev a un volumen de 100 ml.
4. Se enriqueci el medio con 0.1 % de Cloruro de calcio, 5% de sulfato de
amonio y 0.2 % de Sulfato de hierro.
5. Se esteriliz en autoclave a 121C y 15 lb de presin, durante 15 minutos.

Inoculacin del medio de cultivo y proceso de fermentacin.

Preparacin del preinculo
1. Se tomaron dos asadas (con asa de 10 L) y se introdujeron en 10 ml de caldo
nutritivo.
2. Dicho preinculo se dej en incubacin por 24 horas a 37 C.

5
Fermentacin
1. Se inocul el medio de cultivo con el preinculo.
2. Se coloc en el incubador rotatorio a 125 rpm, durante 48 horas a
temperatura de 37 C.
3. A los tiempos 0, 1, 2, 3, 4 y 5 horas, se realiz un sembrado en cajas Petri
con medio caldo nutritivo para realizar conteo en placas. Y se extrajo un
volumen de 5 mL del sistema de fermentacin, se deposit en frascos viales
y se congel para su posterior anlisis de azcares.
4. Las placas se introdujeron a una incubadora a 37 C durante 24 horas.
5. Se hizo la lectura de las UFC de las placas, una vez terminada la incubacin.
6. Acabada la fermentacin se centrifug a 250 rpm durante 20 minutos y se
conserv el sobrenadante.

Determinacin de azcares totales por el mtodo de fenol sulfrico

Preparacin de la curva de calibracin de azcares
1. Se prepar una solucin de dextrosa anhidra 400 mg/L.

2. En tubos de ensayo, rotulados del 1 al 7 se agreg los siguientes volmenes

de la solucin de dextrosa: 0.0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mL; en ese orden.

3. A los mismos tubos se les agregaron los siguientes volmenes de agua

destilada: 2, 1.9, 1.8, 1.6, 1.4, 1.2 y 1 mL. En ese orden.

4. A todos los tubos se les agreg 0.1 mL de fenol al 5 %.

5. A todos los tubos se les agreg 2.5 mL de cido sulfrico concentrado. En

bao de hielo y la campana de extraccin.

6. Una vez que los tubos estuvieron a temperatura ambiente se ley la

absorbancia en el espectrmetro, a longitud de onda de 490 nm.

6
Determinacin de azcares totales en las muestras por el mtodo de fenol-sulfrico

1. A cada muestra de 5 mL tomada en los diferentes tiempos se le agreg 0.1

mL de fenol al 5 %.
2. Despus se les agreg 2.5 mL de cido sulfrico concentrado. En bao de
hielo y la campana de extraccin
3. Una vez que las muestras estuvieron a temperatura ambiente se ley la
absorbancia en el espectrmetro, a longitud de onda de 490 nm.

Prueba cualitativa de la actividad enzimtica de la amilasa

1. En 20 mL de agua destilada se agreg 0.01 g aproximadamente de almidn.
2. A 5 tubos de ensayo se les agreg 3 mL de la solucin de almidn.
3. A cada uno de los 5 tubos se les agreg la enzima obtenida.
4. Despus de determinados tiempos (5, 10, 20, 40 y 60 minutos) se le adicion
una gota de lugol a cada tubo.
5. Se observ y se anotaron resultados.

7
Resultados y Anlisis
Lo primero que se realiz fue la purificacin de la bacteria Bacillus subtilis a partir de
una cepa proporcionada por los profesores, para llevar a cabo la purificacin, la
bacteria B. subtilis se resembr en una caja Petri con agar nutritivo por el mtodo de
dilucin americana, dicha placa se dej incubar por 24 horas a 37C.

Imagen I.- Purificacin de la bacteria B. subtilis en agar

nutritivo.

Se observaron colonias circulares de color beige, de superficie lisa con aspecto

hmedo.
Una vez purificada y aislada la bacteria B. subtilis se le realizaron las pruebas
bioqumicas primarias. Obteniendo los siguientes resultados.

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Tabla I.- Resultados obtenidos de pruebas bioqumicas primarias de la bacteria B.
subtilis

Prueba Bioqumica Resultado

Tincin de Gram Bacilos Gram (+)

Oxidasa Positivo

Motilidad Positivo

Catalasa Positivo

Oxidacin /Fermentacin (OF) Bacteria fermentativa

Se compararon los resultados obtenidos experimentalmente con los reportados en

la literatura, al ver que ambos coincidan se decidi realizar los preinculos a partir
de la bacteria B. subtilis purificada y aislada anteriormente.
Una vez terminada la incubacin de los preinculos estos tenan una coloracin
ligeramente caf.

Una vez listos los preinculos, se le agregaron al matraz de fermentacin que

contena el medio de cultivo preparado anteriormente. Para monitorear el
crecimiento de la bacteria se realiz una curva de crecimiento microbiano, para la
cual se fueron tomando las muestras cada 60 minutos, ya que el tiempo de
duplicacin de la bacteria reportada en la literatura es de 40 minutos.
En el recuento de las placas, se obtuvieron los siguientes resultados.

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Tabla II.- Resultados de UFC/ml obtenidos en diferentes tiempos de la fermentacin
de B. subtilis

Tiempo Dilucin UFC/ ml (promedio)

(horas)

0 - 3 x 105

1 10 -1 3.6 x 105

2 10-2 4.7 x 105

3 10-3 3.1 x 105

4 10-4 6.1 x 106

5 10-5 -------------

6 10-6 -------------

Como se puede observar en la tabla anterior, en las ltimas diluciones no hubo

crecimiento del microorganismo en las cajas, esto se puede atribuir a que el factor
de dilucin fue muy grande o que el microorganismo agot todo el nutriente en el
medio de fermentacin y muri.

Grfica I. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis.

En la grfica anterior se puede ver que el microorganismo primero se fue adaptando

al medio en el que se encontraba y luego fue creciendo hasta llegar a la fase
exponencial y a la fase estacionaria, sin embargo, a partir del tiempo cinco no se
pudo seguir el crecimiento ya que no hubo crecimiento de la bacteria en las placas.

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Otro factor importante a considerar es la degradacin de azcares por parte del
microorganismo. La cual se hizo por el mtodo de fenol-sulfrico, con lo cual
obtuvimos los siguientes resultados.

Tabla III.- Resultados obtenidos de la prueba de degradacin de azcares totales

por fenol-sulfrico.

Tiempo (horas) Absorbancia (nm)

0 1.887

1 1.842

2 1.825

3 1.818

4 1.820

5 1.805

Como se puede ver en la tabla tres, la absorbancia va disminuyendo a travs del

tiempo.
Para determinar la concentracin de glucosa, nos apoyamos de una curva de
calibracin, para la cual se tomaron los siguientes datos.

Tabla IV.- Datos de curva de calibracin de glucosa.

Absorbancia (nm) Glucosa (g /mL)

0.2322 10

0.545 25

0.6998 40

1.02382 60

1.27811 75

1.75031 100

Con los datos se construy la curva de calibracin

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Grfica II.- Curva de calibracin

Utilizando la regresin lineal se obtuvo la ecuacin de la recta:

y=59.225x-2.4953
Pudiendo as calcular la concentracin de glucosa en cada tiempo:

Tabla V. Concentracin de glucosa en funcin del tiempo.

Tiempo (horas) Glucosa (g /mL)

0 109.2622

1 106.5971

2 105.590

3 105.1757

4 105.2942

5 104.4658

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Grfica III.- Curva de degradacin de glucosa

Como se puede observar en la grfica, el microorganismo fue degradando la glucosa del

medio lentamente, sin embargo, al tiempo cinco se nota un pequeo aumento en la
concentracin de glucosa, esto puede haber sido por la composicin del medio de cultivo ya
que como sabemos la papa contiene diversos compuestos entre los cuales pudieron aportar
una mayor cantidad de carbohidratos. Otro factor pudo haber sido por un error al momento
de llevar a cabo el procedimiento o las lecturas.

Una vez finalizada la fermentacin, se extrajo el extracto enzimtico por medio de

centrifugacin, en el cual se inactiv el sedimento obtenido el cual era de coloracin
caf. Se sigui trabajando con el extracto obtenido, el cual presentaba una
coloracin caf translcida.
Imagen II.- Extracto enzimtico obtenido a partir de la fermentacin

Para obtener la enzima -amilasa, fue necesario precipitarla a partir del extracto con
sulfato de amonio en bao de hielo. Una vez que la solucin se satur y se torn de

13
una coloracin caf ms oscuro se centrifug para obtener la enzima. La cual se
sec a temperatura ambiente.

Por ltimo, se realiz una prueba cuantitativa de la enzima -amilasa, esta prueba
fue con una solucin de almidn a la cual se le agreg la enzima y se dejaron
reposar diferentes tiempos, una vez terminado el tiempo de reposo, se le agregaron
gotas de lugol, esto era para identificar si la enzima haba degradado el almidn
presente.

Tabla VI. Resultados de la prueba cualitativa de la actividad enzimtica de la

amilasa.

Tiempo
(minutos) 5 10 20 40 60

Resultado

Sin embargo, no hubo un cambio en el color al agregar el lugol, como se puede

observar en la tabla anterior, esto se puede atribuir a que a la enzima se haya
desestabilizado en el proceso de secado ya que como sabemos las enzimas son
muy susceptibles al calor. Y la nuestra se dej secando aproximadamente
veinticuatros horas a temperatura ambiente.

14
Conclusiones

Mediante esta serie de experimentos descritos en este informe, y cumpliendo las

condiciones que el microorganismo Bacillus subtilis requiere para producir -amilasa
se puede afirmar que la hiptesis formulada es correcta y se cumplieron los
objetivos propuestos.

La experimentacin tuvo contratiempos por la falta de algunos reactivos como cido

sulfrico y sustrato de amonio; pero esto no represent mayores problemas que
posponer pruebas por algunos das. Otro factor que intervino el desarrollo del
proyecto, mas no en el resultado, fueron los das de asueto y el periodo vacacional,
que interrumpieron la fluidez del desarrollo experimental y acortaron la disposicin
del laboratorio.

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Bibliografa

Wiseman, Alan. Manual de biotecnologa de los enzimas. Zaragoza, Espaa :

Acribia S.A., 2004.
Kelly, Catherine T. Fogarty, William M. Microbial enzymes and biotechnology
2nd edition. England : ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS LTD, 2000.

http://www.enzymeindia.com/enzymes/enzymes-spanish.asp (mayo de 2017)
College, Occidental. Bio. 130 Intro. to celular chemistry. Translation and Signal
Sequence. [En lnea] 1 febrero de 2017.
http://departments.oxy.edu/biology/bio130/lectures_2000/11-17-00_lecture.htm

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