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Gua 4
Determinacin de Protena Total
Las protenas son heteropolimeros formados por aminocidos unidos por enlaces
peptdicos. Los aminocidos que conforman las protenas son del tipo (a excepcin de la prolina
que es un iminocido) y poseen una configuracin del tipo L. Son 20 en total y, de acuerdo a su
estructura qumica, pueden dividirse en polares, no-polares, cargados o no cargados. Las
propiedades funcionales de una protena dependen esencialmente del nmero y distribucin de
estos residuos aminocidicos a los largo de la molcula. Las protenas constituyen, en general,
ms de la mitad del peso seco de la clula y determinan su forma y estructura. Adems, actan
como los principales instrumentos de reconocimiento molecular y como catalizadores.
Por otra parte, dada la enorme versatilidad de las propiedades observadas en las distintas
protenas surgi, ya a comienzos del siglo pasado, un gran inters por su produccin y uso a nivel
industrial. En la actualidad existen un gran nmero de empresas dedicadas a la produccin de
protenas de muy variada aplicacin y muchas ms que utilizan estas protenas en procesos
productivos de diversa ndole.
En este laboratorio se utilizaran cuatro mtodos para la determinacin del contenido total
de protenas en una muestra patrn (albmina bovina) y dos muestras problemas. Los mtodos
utilizados sern: espectroscopia en el ultravioleta a 280 nm, ensayo de Bradford, ensayo de Lowry
y Microkjeldahl.
1
MTODO DE BRADFORD1
A. Preparacin de soluciones
Reactivo de Bradford
1. Pesar 10 mg de Azul Brillante de Coomasie G-250 y disolver (por al menos 1 h) en 5 mL de
etanol al 95%.
B. Procedimiento
Medir la absorbancia de las muestras a 590 nm. Usando la solucin de NaCl como blanco.
2
MTODO DE LOWRY2
A. Preparacin de soluciones
Se prepara una solucin de reactivo al 20% v/v. Para ello se mezcla 20 mL de solucin de
reactivo comercial con 100 mL de agua destilada.
B. Procedimiento
1) Adicionar 1 mL de muestra (convenientemente diluida) y 1 mL de RCA mezcla bien y dejar
reposar por 10 min a temperatura ambiente. (por duplicado)
3) Medir la absorbancia de las muestras a 650 nm. Usando agua destilada como blanco
Bibliografa
1. A rapid and sensitive methods for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Bradford, M. Anal Biochem 72:248-253, 1976.
2. Current Protocol in Molecular Biology. 2001. John Wiley & Sons, Inc. Editores. New York.
3. Skoog, D. Y West, D.M. 1990. Qumica Analtica. Cuarta Ed. Mc Graw-Hill. New York.